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擬南芥基因AtSDH在調(diào)控植物抗脅迫方面的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:586014閱讀:378來源:國知局
專利名稱:擬南芥基因AtSDH在調(diào)控植物抗脅迫方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因AtSDH的應(yīng)用,尤其涉及該基因在調(diào)控植物抗逆境脅 迫方面的應(yīng)用,以及該基因在培育抗逆境脅迫轉(zhuǎn)基因植物品種方面的應(yīng)用,屬于基因工程 領(lǐng)域。
背景技術(shù)
植物生長發(fā)育過程中,不正常的生長條件,如干旱、溫度過低或過高、土壤鹽離子 濃度過高等都會引起植物體內(nèi)的離子失衡和高滲脅迫,導(dǎo)致植物發(fā)育不良、生長緩慢特別 是降低農(nóng)作物產(chǎn)量、甚至導(dǎo)致植物死亡。因此,隨著環(huán)境的逐步惡化和耕地面積的減少,通 過提高作物的抗逆性以提高糧食的產(chǎn)量越來越受到人們的重視。在逆境條件下,植物通過產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來減輕脅迫造成的傷害。在蘋果等植 物中,水分脅迫下更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇,且水分脅迫抑制了山梨醇向淀粉的轉(zhuǎn)化,表 明山梨醇可能是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),但山梨醇參與植物抗逆的機理目前還不清楚。 推測山梨醇可能通過保護膜脂過氧化而降低對細(xì)胞的傷害作用。已知,山梨醇脫氫酶催化 以下可逆反應(yīng)
果糖+NAD+ 4 山梨醇+NADH+ H+在逆境脅迫條件下,植物體內(nèi)會積累超氧陰離子自由基,山梨醇脫氫酶催化山梨 醇合成的同時生成H+,H+可以在超氧化物歧化酶的作用下接收超氧陰離子自由基中的高能 電子,緩解超氧陰離子自由基對細(xì)胞的傷害;另外,山梨醇脫氫酶催化山梨醇合成或分解的 同時還涉及NAD+和NADH的轉(zhuǎn)化,NAD+和NADH的數(shù)量和濃度在植物的糖酵解和三羧酸循環(huán) 中起重要作用,山梨醇脫氫酶可能起到調(diào)節(jié)NAD+和NADH平衡的作用。ABA是植物體內(nèi)一種重要的激素,參與干旱等多種脅迫反應(yīng),目前我們已經(jīng)對ABA 參與的脅迫反應(yīng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有所了解。并且,ABA還能通過調(diào)控糖代謝中如酸性轉(zhuǎn) 化酶等多種酶的含量和活性而調(diào)控糖代謝。但對于ABA是否能夠通過調(diào)控山梨醇代謝而提 高植物抗逆境脅迫的能力,目前還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥基因AtSDH在調(diào)控植物抗逆境脅迫方面的應(yīng)用。進一步的,本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因AtSDH在培育抗逆轉(zhuǎn)基因植 物方面的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 一種擬南芥基因AtSDH在調(diào)控植物 抗逆境脅迫方面的應(yīng)用。所述的基因AtSDH在GenBank中的編號為AYl33848 (At5g51970),該基因的CDS長 度為1095bp,編碼364個氨基酸的蛋白。
本發(fā)明通過采用⑶S組織定位和GFP融合蛋白的細(xì)胞定位方法,分析AtSDH基因 的組織和細(xì)胞表達特性。所述的基因AtSDH表達產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)胞漿內(nèi),該基因主要在 葉片和根中表達。所述的基因AtSDH參與干旱、NaCl等逆境脅迫。從擬南芥資源中心(ABRC)獲得 的 AtSDH/ 基因 T-DNA 插入的缺失突變體 SALK 035903 (sdh-1)、SALK 020855 (sdh-2)的純 合體比對干旱、NaCl等脅迫的敏感性增強。所述的基因AtSDH參與激素ABA調(diào)控的逆境脅迫反應(yīng)。本發(fā)明利用從ABRC獲得 的AtSDH基因T-DNA插入的缺失突變體,研究發(fā)現(xiàn)缺失突變體sdh_l和sdh_2對ABA的敏 感性提高。同時,本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種擬南芥基因AtSDH在培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植 物方面的應(yīng)用。所述的基因AtSDH在GenBank中的編號為AYl33848 (At5g51970),該基因的CDS長 度為1095bp,編碼364個氨基酸的蛋白。將AtSDH基因編碼區(qū)序列連接到表達載體上,通 過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植物。超表達AtSDH基因的擬南芥對ABA的敏感性下 降,抵抗干旱、NaCl等逆境脅迫的能力提高。本發(fā)明編號為At5g51970 的 AtSDH(Sorbitol Dehydrogenase)基因編碼一個山 梨醇脫氫酶,定位于細(xì)胞漿內(nèi),通過逆境信號分子ABA在植物抵抗逆境脅迫中具有重要作 用。缺失該基因降低植物抗逆境脅迫能力,超表達該基因可以提高植物對逆境脅迫的抵抗 能力。本發(fā)明通過對AtSDH基因的缺失和超表達分析,確立了 AtSDH在調(diào)控植物抗逆境脅 迫中的作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用此基因可以使植物的生長更耐受干旱、高鹽等不利的環(huán)境 因素,為培育轉(zhuǎn)基因作物新品種奠定基礎(chǔ)。


圖1是AtSDH基因在擬南芥根細(xì)胞㈧和葉片表皮細(xì)胞⑶中的亞細(xì)胞定位;圖2為超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh的擬南芥在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)、生長(A B)和在培養(yǎng)基質(zhì)上開花、結(jié)實(C)情況;圖3超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh擬南芥在含有0. 7 μ MABA的MS培養(yǎng)基 上萌發(fā);圖4缺失突變體sdh擬南芥種子在含150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)㈧和超表 達AtSDH基因及缺失突變體sdh擬南芥在150mM NaCl MS培養(yǎng)基上生長(B)以及在澆灌 150mMNaCl的培養(yǎng)基質(zhì)上生長1_4周的情況(C-F);圖5超表達AtSDH基因和缺失突變體sdh擬南芥在含375mM甘露醇的MS培養(yǎng)基 上萌發(fā)(A)、生長(B)和培養(yǎng)基質(zhì)上停止?jié)菜?周后植株的生長情況(C);圖1-5中WT為野生型擬南芥;35S :SDH_2,35S :SDH_8為兩個超表達AtSDH基因 的擬南芥株系;sdh-1,sdh-2分別為AtSDH基因在啟動子區(qū)域和編碼區(qū)區(qū)域插入的T-DNA 缺失突變體純合體。具體發(fā)明實施方式實施例1缺失突變體純合體的篩選,表型和遺傳學(xué)分析
從擬南芥資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)購買的 AtSDH 基因啟動子區(qū)域和編碼區(qū)區(qū)域插入的T-DNA缺失突變體SALK 035903 (sdh-Ι)和SALK 020855 (sdh-2),利用PCR法篩選純合突變體,引物分別為SALK_035903LP 5' -CGAATTGGGTTTTAAAAATTCG-3‘RP 5' -TGGATGGCTTATCGAGTTTTG-3‘SALK_020855 LP 5' -TGAAAGCTGTTGGTATTTGTGG-3‘RP 5' -CTACCTCCCTGTCTCCAAACC-3‘T-DNA (BP)引物5 ‘ -TCAAACAGGATTTTCGCCTGCT-3 ‘對T-DNA插入純合突變體sdh-Ι,sdh-2的進行RT-PCR分析,結(jié)果表明在突變體中 該基因在轉(zhuǎn)錄水平不表達。對缺失純合突變體植株在正常和脅迫條件下的生長發(fā)育進行分 析。實施例2AtSDH基因的克隆,載體的構(gòu)建,轉(zhuǎn)基因植株的篩選從擬南芥基因組中利用PCR方法擴增分離得到AtSDH的啟動子序列,連接到 PCAMBIA1391的⑶S報告載體;從擬南芥中提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,從cDNA中擴增AtSDH 的⑶S序列,分別連接到pBI121的超表達載體和PBI121-GFP亞細(xì)胞定位載體;農(nóng)桿菌介導(dǎo) 轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。從擬南芥信息資源 tair(The Arabidopsis Information Resource)上查找 AtSDH整個基因組序列,然后從起始密碼子ATG之前取包括TATAbox等序列在內(nèi)的1551bp, 并且包括ATG之后第一個外顯子和第一個內(nèi)含子序列,共計1779bp,然后設(shè)計引物,根 據(jù)pCAMBIA1391-GUS載體的多克隆位點,選擇Sal I/BamHI酶切位點,設(shè)計引物時引入 酶切位點序列。以野生型擬南芥基因組DNA為模板,PCR擴增AtSDH啟動子序列,連接 到pCAMBIAl391-GUS載體,構(gòu)建重組載體pCAMBIA1391_AtSDHp_GUS。并同時根據(jù)擬南芥 AtSDHCDS序列設(shè)計引物,并在引物兩端分別加入酶切位點Xbal/SacI和Xbal/Kpnl以引入 表達載體PBI121,分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI121-AtSDH和pBI121-AtSDH-GFP,并由PCR、測序和 酶切鑒定。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101,篩選陽性克隆。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化擬南芥花蕾。 將攜帶有 pCAMBIA1391-AtSDHp-⑶S、pBI121_AtSDH 和 pBI121_AtSDH_GFP 重組載體的農(nóng)桿 菌分別轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。對得到的種子進行篩選鑒定。載體pCAMBIA1391和pBI121分別帶有潮霉素抗性 基因和卡那霉素抗性基因,將收獲的種子用含潮霉素和卡那霉素的MS培養(yǎng)基分別篩選,對 得到的抗性苗進行PCR鑒定,收獲陽性植株的種子。對攜帶有AtSDHp-GUS的轉(zhuǎn)基因植株進行⑶S組織化學(xué)染色,用于分析AtSDH的時 空表達情況;對攜帶AtSDH-GFP的轉(zhuǎn)基因植株進行亞細(xì)胞定位分析;AtSDH超表達植株進行 正常和脅迫條件下的表型分析。實施例3AtSDH基因的表達分析
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對攜帶有AtSDHP-GUS的轉(zhuǎn)基因植株進行⑶S組織化學(xué)染色,結(jié)果表明AtSDH主要 在植物的根部和幼葉表達。利用激光共聚焦顯微鏡對攜帶AtSDH-GFP的轉(zhuǎn)基因擬南芥進行 GFP融合蛋白定位分析,表明該基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。分別利用葉綠體 的自發(fā)熒光、線粒體、過氧化酶體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光標(biāo)記探針檢測排除該蛋白在以上 細(xì)胞器的定位,確定該基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的胞質(zhì)溶膠中。實施例4超表達AtSDH因和缺失突變體sdh擬南芥對ABA的敏感性分析對ABA的敏感性上,超表達和缺失突變體擬南芥與野生型擬南芥相比都發(fā)生變 化,說明AtSDH基因參與ABA的調(diào)控過程。將擬南芥種子消毒后播種于含0. 7 μ MABA的 MS固體培養(yǎng)基上,4°C暗處放置24小時,在22°C,16小時光照(lOOymol/n^/s)下垂直培 養(yǎng)1周后,超表達AtSDH因擬南芥對ABA的敏感性降低,2個超表達AtSDH因的擬南芥株系 (35S :SDH-8,35S :SDH_8)的種子都能生根并能長出綠色子葉,野生型擬南芥有60%的子葉 為黃色,僅有下胚軸而不能生根(圖2,A)。缺失突變體的擬南芥對ABA的敏感性提高,在 含0. 7 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上,相同條件水平培養(yǎng)1周后,突變體基本不能生根,子葉較小 且呈黃色(圖2,B)。實施例5正常和脅迫條件下超表達AtSDH因和缺失突變體sdh擬南芥的生長分析正常條件下(溫度22°C,光照強度100 μ mol/m2/s, 16小時光照),超表達AtSDH因 和缺失突變體sdh擬南芥在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)(圖3,A)、生長(圖2,B)和在培養(yǎng)基質(zhì)上開 花、結(jié)實等發(fā)育過程與野生型擬南芥無明顯差異(圖3,C)。超表達AtSDH因的擬南芥抵抗NaCl脅迫的能力增強,缺失突變體擬南芥的萌發(fā)和 生長都受到顯著抑制。將野生型和缺失突變體擬南芥種子消毒后播種于含150mM NaCl的 MS固體培養(yǎng)基上,4°C暗處放置24小時,在常規(guī)條件下(溫度22°C,光照強度100 μ mol/m2/ s, 16小時光照)生長1周后,缺失突變體種子萌發(fā)和幼苗生長受到顯著抑制(圖4,A)。將 MS培養(yǎng)基上常規(guī)條件下生長1周的擬南芥移到含有150mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng), 1周后超表達AtSDH因擬南芥幼苗長出兩片較大的真葉,野生型擬南芥長出的真葉較小,而 缺失突變體sdh幼苗無真葉長出,且超表達擬南芥幼苗的根較野生型擬南芥長,缺失突變 體的根比野生型擬南芥短(圖4,B)。將以上3種擬南芥種子播于培養(yǎng)基質(zhì)中,常規(guī)條件下 培養(yǎng)4周后,開始澆灌150mM NaCl。澆灌1_4周后觀察到植株生長情況如圖4C-F所示。澆 灌1周后,缺失突變體、超表達和野生型擬南芥無明顯差異(圖4,C)。2周后缺失突變體 sdh和野生型擬南芥部分葉片開始干枯變黃,超表達植株葉片仍呈綠色、部分葉片變成褐色 (圖4,D)。澆灌3周后超表達AtSDH因的擬南芥株系8(35S :SDH_8)部分葉片開始發(fā)黃干 枯,株系2(35S :SDH-2)葉片仍呈綠色或褐色,而缺失突變體和野生型擬南芥大部分植株已 經(jīng)干枯死亡(圖4,E)。澆灌4周后缺失突變體基本全部死亡,野生型擬南芥絕大部分植株 干枯死亡,而超表達擬南芥株系8約一半植株死亡,株系2僅有少數(shù)植株干枯死亡(圖4, F)。在干旱和滲透脅迫條件下,超表達AtSDH因的擬南芥幼苗和植株的抵抗和忍耐能 力提高,缺失突變體sdh擬南芥的抵抗能力降低。將種子播于含有375mM的MS培養(yǎng)基上, 4°C暗處放置24小時后,常規(guī)條件下培養(yǎng)10天后,突變體sdh-Ι和sdh-2的子葉呈黃色,僅有下胚軸無根長出。野生型擬南芥有40%種子能生根并長出綠色子葉。超表達AtSDH因 的擬南芥兩個株系分別有為86%和72%的種子能生根和長出綠色子葉(圖5,A)。將相同 條件下于MS培養(yǎng)基上生長1周的幼苗移到含375mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng),1周后 超表達的擬南芥幼苗與野生型和突變體相比,根系較長,且有真葉長出(圖5,B)。將以上 3種類型的擬南芥種子播于培養(yǎng)基質(zhì)中,常規(guī)條件下培養(yǎng)3周后,以不澆水作為干旱脅迫處 理。處理3周后,超表達植株仍能生長正常,野生型擬南芥葉片開始輕度萎焉,而缺失突變 體植株葉片已經(jīng)嚴(yán)重萎焉(圖5,C)。
權(quán)利要求
擬南芥基因AtSDH在調(diào)控植物抵抗逆境脅迫中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于所述的基因AtSDH(Arabidopsis sorbitol dehydrogenase)在 GenBank 中的編號為 At5g51970,該基因的 CDS 全長為 1095bp,編碼364個氨基酸的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述的基因AtSDH參與逆境脅迫激素ABA 調(diào)控的植物生長發(fā)育觀察。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于所述的基因AtSDH編碼一種定位于細(xì)胞 質(zhì)溶膠的山梨醇脫氫酶。
5.一種擬南芥基因AtSDH在培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的擬南芥基因AtSDH在培育抗逆境脅迫轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng) 用,其特征在于將AtSDH基因或其中部分片段連接到不同種類的載體上,通過不同的表達 載體轉(zhuǎn)化獲得抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因AtSDH的應(yīng)用,涉及該基因在調(diào)控植物抗逆境脅迫方面的應(yīng)用,以及該基因在培育抗逆境脅迫轉(zhuǎn)基因植物品種方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過對超表達轉(zhuǎn)基因植株和缺失突變體對ABA的敏感性和逆境條件下生長分析,確立了AtSDH在擬南芥逆境脅迫中的作用與植物激素ABA有關(guān),為理解植物山梨醇代謝在植物抗逆境脅迫中的作用提供了重要依據(jù)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用該基因可以使幼苗和植株的生長更耐受逆境脅迫,為培育轉(zhuǎn)基因作物新品種奠定理論基礎(chǔ)。與野生型擬南芥相比,AtSDH基因超表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性下降,幼苗和植株耐受干旱、高鹽等逆境脅迫的能力提高。
文檔編號C12N15/53GK101955955SQ20101028798
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者王秀玲, 高新起 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
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