專(zhuān)利名稱(chēng)：一種與香味性狀共分離的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，屬分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，專(zhuān)用于水稻 香味品種的選育與遺傳研究，并可用于克隆香味基因。
背景技術(shù)：
香味是水稻重要的食味品質(zhì)性狀。許多優(yōu)良的水稻品種具有令人愉快的香氣，備 受消費(fèi)者的歡迎，世界上每個(gè)水稻生產(chǎn)國(guó)或地區(qū)均有香稻種植。目前對(duì)香味的測(cè)定方法主要有咀嚼籽粒法、氫氧化鉀法、高效液相色譜法，前兩種 方法是通過(guò)嗅覺(jué)來(lái)進(jìn)行的，咀嚼籽粒法大批量鑒定時(shí)會(huì)對(duì)舌頭和鼻子造成影響，氫氧化鉀 法對(duì)香味的釋放也有一定的局限性，鑒定不準(zhǔn)。高效液相色譜為香味的測(cè)定提供了客觀的 方法，但該方法需要大批的樣品量，而且費(fèi)時(shí)(Jin et al.，2003)。在香稻選育方面，利用分子標(biāo)記輔助選擇可以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地選育香稻。許多 研究者對(duì)香味基因的遺傳分析和定位進(jìn)行了研究，并為香稻育種提供了一些有用的分子標(biāo) 記，但是目前所利用的分子標(biāo)記距離較遠(yuǎn)，對(duì)香味不能準(zhǔn)確鑒定。到目前為止，大部分研究表明稻米香味是受一個(gè)隱性單基因控制的。Ahnet al. (1992)利用一對(duì)近等基因系Lemont和香Lemont，香Lemont的香味基因來(lái)自供體 Delia,以有香味分離的F3群體為材料，通過(guò)RFLP分析表明，香味基因與位于第8染色體 上的RG28連鎖，遺傳距離為4.5cM。李欣等(1995)以秈型及粳型標(biāo)記基因系為材料，分 別與武進(jìn)香秈、武進(jìn)香粳雜交，以堿浸法測(cè)定雙親和Fp F2、及部分F3組合的葉香，結(jié)果表明 香味基因與位于第8染色體上的標(biāo)記基因v-8表現(xiàn)連鎖，估算兩者的重組值約為38. 03% ±3. 84%0 Jin etal. (1995)用 CT9993/KDML105 的 F2 分離群體為材料，找到一個(gè) RAPD 引 物，這個(gè)引物只在非香群體中擴(kuò)增到1.5kb片段，并表現(xiàn)與香味性狀緊密連鎖，用該引物 對(duì)兩親本、F2分離群體單株和其它不同品種進(jìn)行分析，進(jìn)一步證明了這種多態(tài)的可靠性。 Lorieux et al. (1996)以DH群體為材料，利用RFLP、RAPD、STS和同工酶標(biāo)記及氣相色 譜測(cè)定AcPy的濃度，證實(shí)了 AcPy是香味的主要成分，且香味基因與RG28相連鎖，距離為 5. 8cM，同時(shí)鑒定出2個(gè)QTL，一個(gè)位于第4染色體，另一個(gè)位于第12染色體。Garland et al. (2000)根據(jù)RG28在一對(duì)香稻與非香稻品種之間的多態(tài)性區(qū)域發(fā)展了一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記 S⑶-RICE-SSR-I，并選擇附近區(qū)域的4個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)24個(gè)香稻和非香品種進(jìn)行標(biāo)記的多態(tài) 信息量分析，研究表明，S⑶-RICE-SSR-1、RM42和RM223可以用來(lái)區(qū)別不同品種中的香味 基因的復(fù)等位基因。Jin et al. (2003)找到了一個(gè)與香味基因連鎖的SNP標(biāo)記RSP04，用 RSP04對(duì)50個(gè)單株構(gòu)成的F2分離群體進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)RSP04與香味基因之間有兩個(gè) 重組株，RSP04與香味基因相距2cM ；用RSP04對(duì)另外一個(gè)163個(gè)單株構(gòu)成的F2分離群體進(jìn) 行基因型分析，發(fā)現(xiàn)RSP04與香味基因之間有6個(gè)重組株，RSP04與香味基因相距約2cM。
3Dong etal. (2001)對(duì)三個(gè)日本當(dāng)?shù)叵愕酒贩N的三體遺傳分析表明，這三個(gè)香稻品種的香味 是由一個(gè)隱性基因控制的，均屬等位基因，位于第8染色體上。Siddiqet al. (1986)對(duì)一個(gè) 印度品種進(jìn)行三體遺傳分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)隱性香味基因，分別位于第5和第9染色體。Chen 等(2006)把香味基因座定位在一個(gè)69kb的區(qū)間內(nèi)。施軍瓊(2004)利用單片段代換系對(duì) 香味基因進(jìn)行了初步定位，在兩個(gè)分離群體中香味基因均與RM223共分離，在以Basmati 385為供體的分離群體中，香味基因距兩側(cè)標(biāo)記RM515和RM284分別為2. 7cM和3. 3cM，在 以美國(guó)茉莉香為供體的分離群體中，香味基因距兩側(cè)標(biāo)記冊(cè)515和RM210分別為2. 9cM和 11. 8cM。利用分子標(biāo)記對(duì)水稻香味基因的分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但迄 今為止，關(guān)于水稻香味基因共分離的標(biāo)記還未見(jiàn)報(bào)道，利用TPS溶液鑒定香味性狀也是第 一次報(bào)道。我國(guó)香稻資源豐富，從不同的水稻品種中發(fā)掘、鑒定和定位香味基因，找到鑒定香 味性狀準(zhǔn)確可靠的方法，克服目前咀嚼法、KOH法和儀器分析法鑒定香味中不準(zhǔn)的缺點(diǎn)，建 立共分離的香味基因分子標(biāo)記，并利用與香味基因共分離的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，判斷 香味基因是以雜合和純合存在，能準(zhǔn)確地選擇在香味基因座上純合和雜合的具有優(yōu)異性狀 單株，而且能夠有目標(biāo)地將香味基因在實(shí)驗(yàn)室選擇得到，大大提高選擇的效率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有鑒定水稻香味的方法的不足之處，而提供一種鑒定水稻 香味的方法，以及為分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種提供一種與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，提高 選育效率。本發(fā)明該種鑒定水稻香味的方法如下(1)在分蘗期取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于-80°C冰箱中備用；(2)取2-4cm長(zhǎng)的水稻葉片放入1.5ml離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液 900 μ 1，75°C水浴 20 分鐘；其中 TPS 溶液為=IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 0), IOmM EDTA (pH8. 0), IM KCl ；(3)打開(kāi)蓋，用鼻聞，即可判定香味的有無(wú)。本發(fā)明所提供的與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，是由特異性PCR引物L(fēng)Ol上游端自5，-3，的核苷酸序列為CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5，-3，的核苷酸序列為GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特異性PCR引物L(fēng)02上游端自5，_3，的核苷酸序列為 ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5，-3，的核苷酸序列為 CCAGACATAAATAATGGCATCTT經(jīng)PCR擴(kuò)增水稻基因組DNA得到的。其中引物L(fēng)Ol在香粳9407中擴(kuò)增出280bp 的特異片段，在IRBB60中擴(kuò)增出271bp的特異片段。引物L(fēng)02在香粳9407中擴(kuò)增出210bp 的特異片段，在IRBB60中擴(kuò)增出200bp的特異片段。利用本發(fā)明提供的鑒定水稻香味的方法對(duì)曲阜香稻、明水香稻、香粳9407(均為 公知公用品種，國(guó)家種子庫(kù)均有保存，可對(duì)外提供)分別和水稻品種IRBB60(公知公用品 種，國(guó)家種子庫(kù)均有保存，可對(duì)外提供)雜交的F2分離群體進(jìn)行香味性狀鑒定。在分蘗期
4取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于_80°C冰箱中備用。取2-4cm長(zhǎng)的水稻葉片放入1. 5ml 離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μ 1，75°C水浴20分鐘。打開(kāi)蓋，用鼻聞，可準(zhǔn)確 判定香味的有無(wú)。TPS 溶液配方IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)，IOmM EDTA (pH8. 0)，IM KCl。此外本發(fā)明人設(shè)計(jì)出了 2對(duì)特異性的PCR引物，它能對(duì)水稻苗期香味性狀進(jìn)行標(biāo) 記鑒定，檢測(cè)是否具有香味基因fgr，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單。由于曲阜香稻、明水香 稻、香粳9407是普遍應(yīng)用的雜交品種的親本，因此該分子標(biāo)記還具有檢測(cè)是否具有香味性 狀的普遍意義，可以作為其他以香稻品種作為親本育種材料的檢測(cè)工具。本發(fā)明該種鑒定水稻香味的方法及與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，具有以下優(yōu)占.
^ \\\ ·(1)利用本發(fā)明鑒定水稻香味的方法(TPS法)鑒定水稻香味，簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確方 便。利用KOH法不能準(zhǔn)確判定香味性狀的單株，利用TPS法可準(zhǔn)確判定。(2)標(biāo)記穩(wěn)定，不受環(huán)境影響。通過(guò)本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性PCR引物，2007年在不同 生育期取樣，用這兩標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記表現(xiàn)穩(wěn)定，不受環(huán)境影響。(3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。通過(guò)PCR標(biāo)記的擴(kuò)增，可以判定香味基因 是以純合或雜合狀態(tài)基因型存在的單株，加快香味性狀分子標(biāo)記輔助育種，大大提高選擇 的效率。
圖1 標(biāo)記LOl對(duì)香粳9407X IRBB60雜交的F2代分子標(biāo)記輔助選擇電泳圖譜M 為 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分離單株。圖2 標(biāo)記L02對(duì)香粳9407 X IRBB60雜交的F2代分子標(biāo)記輔助選擇電泳圖譜M 為 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分離單株。
具體實(shí)施例方式1、F2群體的創(chuàng)建和表型鑒定2005年利用曲阜香稻、明水香稻、香粳9407分別與IRBB60雜交，年底F1種子送海 南島三亞加代，自交產(chǎn)生F2種子。2006年將F2分離群體播種于山東省水稻研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng) 場(chǎng)，5月1號(hào)播種，6月20號(hào)插秧，單株插植。插秧20天抽提F2分離群體的單株DNA，并利 用本發(fā)明鑒定水稻香味的方法(TPS法)鑒定水稻單株的香味性狀，分有香味和無(wú)香味兩種 表型，每個(gè)分離群體種植3000株，共9000株。2、F2分離群體的分子標(biāo)記分析(1)用CTAB法提取曲阜香稻/IRBB60、明水香稻/IRBB60、香粳9407/IRBB60雜交 的F2各單株DNA。(2) SSR分析參照Panaud et al. (1996)的方法。20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為模板DNA IOng/μ 1,0. 15 μ 1 IOmM dNTPs，1· 5 個(gè)單位的 Taq 酶，2μ 1 10 X PCRbuffer (含 MgCl2)， 1. 5 μ 1的2uM正向和反向引物，反應(yīng)體積20 μ 1。PCR反應(yīng)程序?yàn)镈NA 94°C預(yù)變性5min， 然后 94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，最后 72°C延伸 5min。在 PTC-200PCR 儀 上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行分離電泳，銀染參照李文濤等(2002)的 方法進(jìn)行顯色觀察，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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(3)水稻香味基因fgr已經(jīng)被定位在水稻第8染色體RMl 109和PSM465之間(Chen et al. 2006，F(xiàn)en, 2005)。在此基礎(chǔ)上，利用RMl 109和PSM465對(duì)三個(gè)組合F2分離群體的 9000個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，在兩個(gè)標(biāo)記之間共篩選到106個(gè)交換株，利用本發(fā)明鑒定水稻香味 的方法(TPS法)鑒定水稻交換株的香味。同時(shí)根據(jù)所在區(qū)域日本晴和9311的基因組序 列，利用Primer Premier Version5設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)LOl (上游端自5’ -3’的核苷酸序列 為 CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT，下游端自 5，-3，的核苷酸序列為 GTGTGCACTGGTCACTGTTTT)和 L02(上游端自5，-3，的核苷酸序列為ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT，下游端自5，-3，的核 苷酸序列為CCAGACATAAATAATGGCATCTT)，進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明在曲阜香稻、明水香稻、香粳 9407和IRBB60之間LOl和L02表現(xiàn)多態(tài)性，其中在香粳9407和IRBB60的擴(kuò)增結(jié)果如附 圖1，2所示。通過(guò)分析交換株的基因型與香味表型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩標(biāo)記與香味基因fgr出 現(xiàn)交換，表現(xiàn)共分離。因此LOl和L02兩標(biāo)記可用于篩選香稻品種。
權(quán)利要求
一種與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，其特征在于，是由特異性PCR引物L(fēng)01上游端自5’ 3’的核苷酸序列為CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5’ 3’的核苷酸序列為GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特異性PCR引物L(fēng)02上游端自5’ 3’的核苷酸序列為ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5’ 3’的核苷酸序列為CCAGACATAAATAATGGCATCTT經(jīng)PCR擴(kuò)增水稻基因組DNA得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與香味性狀共分離的分子標(biāo)記，屬分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。在分蘗期取水稻單株上部1-2片幼葉，保存于-80℃冰箱中備用。取2-4cm長(zhǎng)的水稻葉片放入1.5ml離心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μl，75℃水浴20分鐘。打開(kāi)蓋，用鼻聞，可準(zhǔn)確判定香味的有無(wú)。用特異性PCR引物L(fēng)01或L02經(jīng)PCR擴(kuò)增即可得到該分子標(biāo)記。本發(fā)明專(zhuān)用于水稻香味品種的選育與遺傳研究，并可用于克隆香味基因。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101921761SQ20101028769
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者姚方印, 姜明松, 張曉東, 李廣賢, 李潤(rùn)芳, 王文英 申請(qǐng)人:山東省水稻研究所