專利名稱：豬板油率,內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudt6的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬板油率，內(nèi)脂率 和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudte的分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用。本發(fā)明的分子標(biāo)記與Nudte基因有關(guān)。
背景技術(shù)：
豬肉是我國人民攝取動(dòng)物蛋白主要來源。在過去幾十年間，隨著人民生活水平提 高，豬肉消費(fèi)市場(chǎng)逐漸擴(kuò)大，獲得高經(jīng)濟(jì)效益豬種是豬肉生產(chǎn)者和豬育種努力方向。因此豬 胴體性狀成為豬遺傳改良的目標(biāo)性狀，是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。胴體性狀主要有屠宰率、背 膘厚度、眼肌面積、腿臀比率、胴體瘦肉率、板油率和內(nèi)脂率等。高的屠宰率和腿臀比率是獲 得較高經(jīng)濟(jì)效益保證。由于胴體性狀無法進(jìn)行活體測(cè)定，常規(guī)育種方法對(duì)這類性狀的改良 無法實(shí)施個(gè)體選擇，往往采用同胞選擇進(jìn)行改良，其改良效果往往不佳，而相關(guān)分子標(biāo)記的 尋找是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。近年來隨著豬QTL和分子標(biāo)記的研究進(jìn)展以及標(biāo)記輔助 選擇在育種中的應(yīng)用，豬胴體性狀的改良速度得到了很大的提高。但是豬的胴體性狀是一 類數(shù)量性狀是受多基因控制的，目前的研究還僅僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)控制胴體性狀的基因和分子標(biāo) 記，大量的候選基因和分子標(biāo)記還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。目前與豬胴體性狀相關(guān)的QTL幾乎分布于豬的所有染色體，并通過功能候選基 因法或位置克隆的策略篩選了一些與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。目前已發(fā)現(xiàn)許多與胴體 性狀存在顯著關(guān)聯(lián)的基因瘦素受體(L印tin receptor, LEPR)基因和心臟脂肪酸結(jié)合 蛋白(Heart fatty acid binding protein, H-FABP)是豬6號(hào)染色體上影響背膘厚度， 肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積等QTL區(qū)域候選基因，連鎖分析表明H-FABP和LEI3R基因位于 SSC685. 4cM和107eM位置，PCR-RFLP分析表明H-FABP基因單核苷酸多態(tài)與肌內(nèi)脂肪和眼 肌面積顯著相關(guān)，LEI5R基因單核苷酸多態(tài)與背膘厚和肌內(nèi)脂肪是顯著相關(guān)的(G.Muz et al, J. Anim. Sci. ,2009,87 459-468 ；Cristina OVILOa et al.，Genet. Sel. Evol.，2002， 34:465-479)。Lpinl, Lpin2和Lpin3是與脂肪代謝相關(guān)的三個(gè)基因，屬于一個(gè)基因家族， 豬上分別位于 3q21_27，6q24_ (1/2) q31 和 17 (1/2) q21_q23，PCR-RFLP 表明 Lpinl 基因第二 外顯子的C93T單核苷酸突變與板油率和肌內(nèi)脂肪這兩個(gè)胴體性狀相關(guān)(Bang Liu et al, Investigation of Lpinl as a candidate gene for fat deposition in pigs. Mol. Biol. Rep, 2009, 36 1175-1180 ；Bang Liu et al, Molecular characterization, chromosomal localization and association analysis with back-fat thickness of porcine LPIN2 and LPIN3. Mol. Biol. Rep. , 2008Nov 7，DOI 10. 1007/sl 1033-008-9385-2) 原發(fā)性心肌 癥相關(guān)蛋白 1 和 4(cardiomyopathy-associated 1 and 1，CMYAl 和 CMYA4)基因定位于 豬SSC13和SSC12分別SW344與SW62微衛(wèi)星標(biāo)記緊密相連的區(qū)域。CMYAl基因編碼區(qū) 一個(gè)同義突變 c. 1053C > T 和三個(gè)錯(cuò)義突變:c. 1394A > G(p. His 465Arg)，c. 1751A > G(p.Asp582Gly)和c. 3290C > A(p. Thrl097Asp)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明與不同背膘后存在顯著相關(guān)；CMYA4基因第十五內(nèi)含子上A558G單核苷酸突變產(chǎn)生一個(gè)MspI酶切位點(diǎn)，性 狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與六七肋骨背膘厚和肩膘厚存在顯著相關(guān)(Bang Liu et al, Molecular characterization,expression and association analysis of the porcine CMYA4 gene with carcass traits. J. Anim. Breed Genet.,2008Aug,125(4) 234-239 ；Bang Liu et al.，Porcine skeletal muscle differentially expressed gene CMYA 1 :isolation, characterization, mapping, expression and association analysis with carcass traits. Anim. Genet.，2009Jun, 40(3) :255_261)。Nudix類模體6 (Nudt6, nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X) -type motif 6)基因最早于1989年通過在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的cDNA文庫中用小鼠bFGF序列篩 選分離得到的，它編碼蛋白在物種間高度保守。小鼠Nudte位于3號(hào)染色體，長約1. Ikb0小 鼠該基因與FGF-2相向轉(zhuǎn)錄且在3’末端有460個(gè)左右核苷酸有互補(bǔ)性，所以又稱反義FGF。 豬中該基因位于8號(hào)染色體，與豬FGF2也是相向轉(zhuǎn)錄。由于基因結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，Nudte可 以通過3’端非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)FGF的翻譯起始和mRNA穩(wěn)定，調(diào)控FGF-2的生物學(xué)作用。Nudte和FGF-2在同一組織中表達(dá)，且FGF-2在心臟以及骨骼肌發(fā)育，維持神經(jīng) 系統(tǒng)功能，促進(jìn)祖細(xì)胞分裂，對(duì)于耳毒性藥物有很強(qiáng)的拮抗作用等方面有重要意義，所以 Nudt6可以通過調(diào)節(jié)FGF-2共同影響生理過程。FGF2因子對(duì)于肌細(xì)胞的生長調(diào)控而言是一 種關(guān)鍵的調(diào)控因子。它對(duì)骨骼肌細(xì)胞的增殖具有顯著的刺激作用，而對(duì)其分化具有強(qiáng)烈的 抑制作用。在肌肉生成的過程中，F(xiàn)GF2因子具有抑制肌細(xì)胞生成素(肌管形成時(shí)需要的調(diào) 節(jié)因子)轉(zhuǎn)錄的功能。通過抑制肌細(xì)胞生成素，F(xiàn)GF2能維持了骨骼肌細(xì)胞不斷增殖的狀態(tài)。 由于其對(duì)FGF2調(diào)控作用，我們不難發(fā)現(xiàn)該基因在肌肉發(fā)育方面具有重要功能，因此我們開 展豬Nudte基因的克隆和SNP篩查、檢測(cè)及與性狀關(guān)聯(lián)分析等相關(guān)工作。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆一種與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudte的 分子標(biāo)記，其制備方法及其在豬標(biāo)記輔助選擇關(guān)聯(lián)分析上的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人:通過克隆方法獲得一種與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudte 的分子標(biāo)記，它的CDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所述，在序列表SEQ ID N0:1的169bp 處有1個(gè)T169-C169的堿基替換。申請(qǐng)人:提供了一種與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率性狀相關(guān)分子標(biāo)記的制備方 法，其步驟如下用鼠Nudt6基因(GenBank收錄號(hào)NM_153561. 2) cDNA為探針，作同源序 列篩選，獲得同源性90%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，然后拼接豬EST-重疊群，根 據(jù)EST-重疊群序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述的引物對(duì)的核苷酸序列如下所示正向引物為 5 ‘ -AGCCTGGAGAAGATATTGGA-3 ‘，反向引物為 5 ‘ -ATAGCATTTACCATTATCCAGT-3 ‘。從豬肌肉組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板通過PCR方 法克隆得到如序列表SEQ ID NO 1所述的cDNA序列。根據(jù)序列表SEQ ID NO :1和附圖2所述的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的核苷酸 序列如下所示正向引物為5 ‘ -TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3 ‘，反向引物為
45 ‘ ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3 ‘，該引物對(duì)正向引物所示序列的第11-32位堿基與SEQ ID NO 1所述序列大部分相同，其中第31位為引物引入C — G變異，第1-10位堿基與SEQ ID NO 1所述序列不同，是在引物序列5'端添加的IObp的oligodT，即PCR擴(kuò)增序列如SEQ ID NO 2和附圖4所示，在該序列的1-10位堿基為T且第31位堿基為G，通過這種ACRS-P CR(amplification-created-restriction site-PCR)方法設(shè)計(jì)的引物為 SEQIDN0 2 和附 圖4所示序列第33位堿基T169C變異的識(shí)別提供了簡易的BclI (TGATCA)酶切多態(tài)性鑒別 方法。
序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因 Nudt6的cDNA序列(如附圖2對(duì)應(yīng))。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明克隆的與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因 Nudt6用于ACRS-BclI-RFLP檢測(cè)的核苷酸序列(該序列如附圖4對(duì)應(yīng))。圖1 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖；圖2:是本發(fā)明中獲得豬Nudte基因用于克隆的cDNA片段。所用的引物序列用下 劃線標(biāo)注；突變位置為為169位，括號(hào)外的Y代表括號(hào)內(nèi)的T/C突變。圖3 篩查T169C SNP的測(cè)序圖；圖4:是本發(fā)明中豬Nudte基因用于BcII-RFLP檢測(cè)的核苷酸序列。所用的引物 序列用下劃線標(biāo)注。突變位置為33位，括號(hào)外的Y代表括號(hào)內(nèi)的T/C突變。在圖4所示序 列的31位的“G”為引入的突變。圖5 是本發(fā)明中豬Nudt6基因BcII-RFLP的三種基因型(TT TC CC)電泳結(jié)果。 圖中 Marker :DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL20001adder)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、Nudt6基因的克隆1、引物設(shè)計(jì)用鼠(GenBank收錄號(hào)NM_153561. 2)Nudt6基因mRNA在互聯(lián)網(wǎng)上進(jìn)行同源搜索， 獲得同源性90%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，然后用DNASTAR拼接豬EST-重疊群，再根據(jù) EST-重疊群序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增獲得豬Nudte部分cDNA序列，引物的核苷酸序列如 下正向引物5‘ -AGCCTGGAGAAGATATTGGA-3 ‘，反向引物5‘ -ATAGCATTTACCATTATCCAGT-3 ‘。2、PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序?qū)⒓兓蟮腜CR產(chǎn)物與pMD-18T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)在 4°C水浴過夜連接；無菌狀態(tài)下取150 200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞于1. 5ml Ependorff 管中，將 7 μ 1的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，后冰浴3 4min，加入450 μ 1 無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。取100 μ 1涂布于帶有氨芐青霉素(濃 度60 μ g/μ L)平板，37°C平放Ih后倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，接種于Iml LB中， 370C 220r/min培養(yǎng)過夜。取1 μ 1菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證后，用雙脫氧末端終止法在DNA自動(dòng)
5測(cè)序儀上對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。用DNASTAR 軟件中的SEQMAN程序進(jìn)行拼接，得到一條長度為650bp的cDNA序列。DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)網(wǎng)立占 StJ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的豬的EST序列進(jìn) 行序列同源性比較，以鑒定獲得的cDNA序列。檢索結(jié)果表明所測(cè)序列與豬Nudte基因EST
拼接結(jié)果一致。實(shí)施例2、Nudt6基因SNP的篩查和ACRS-PCR-RFLP診斷方法的建立1、SNP 的篩查運(yùn)用序列表SEQ ID NO 1弓丨物對(duì)擴(kuò)增中國地方豬品種“通城豬“，外來豬品種“大 白”和“長白“純種豬的cDNA序列，通過瓊脂糖膠回收試劑盒(購自北京原平皓生物技術(shù)有 限公司)獲得PCR產(chǎn)物pool送該公司測(cè)序，結(jié)果表明在該片段第169位堿基處有一個(gè)C-T 的堿基突變，該位點(diǎn)變異引起(Ile-Ser)氨基酸的改變，通過引入酶切位點(diǎn)PCR方法在該序 列167位堿基引入C-G突變，為C169T的SNP位點(diǎn)的Bcl I-RFLP多態(tài)性檢測(cè)引入BclI的 識(shí)別序列，測(cè)序結(jié)果如圖2和圖3所示。2、ACRS-PCR-RFLP診斷方法的建立(1)引物設(shè)計(jì)所述的引物對(duì)的序列如下Nudt6(BclI-RFLP) NuSNPl-S 5' -TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3‘
9NuSNPl-R5' -ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3‘。(2) PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積10 μ 1，其中豬基因組DNA約lOOng，含1 X緩沖液(buffer，購自 寶生物工程(大連)有限公司)，1. 5mmol/L MgCl2, dNTP終濃度為150 μ mol/L，引物終濃度 為 0. 4ymol/L，0. IU Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)。BclI-RFLP PCR 擴(kuò)增程序是95°C 4min， 循環(huán)38次94°C 30s，61°C 30s，然后72°C ，最后72°C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到148bp特異擴(kuò)增片段(如圖4)，測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該148bp片段中 31位堿基處引物序列中引入C —G的變異，且存在一個(gè)BclI酶切位點(diǎn)(TG丨ATCA)，其中 第33bp處為多態(tài)性切點(diǎn)。(3) PCR-RFLP酶切檢測(cè)條件BclI-RFLP PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體積是10 μ 1，其中IXbuffer 1 μ 1，PCR產(chǎn)物4 6 μ 1，限制性內(nèi)切酶BclI為0.2μ I(IOU)，用H2O補(bǔ)足10 μ 1，將樣品混勻后離心，55°C水 浴8h，用3. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，凝膠成像系統(tǒng)中拍照。對(duì)該位 點(diǎn)兩個(gè)純合子的測(cè)序結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)?3bp位置是C33時(shí)，則該BclI酶切位點(diǎn)不存在，BclI 酶切后檢測(cè)結(jié)果只有1個(gè)片段，長度是148bp (定為等位基因C)；但存在C33 — T33的替換 時(shí)，其結(jié)果導(dǎo)致第33bp處一個(gè)BclI酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，得到2個(gè)片段，長度分別為117bp和 31bp (定為等位基因T)，三種基因型CC, TC, TT如圖5所述。(4)、本發(fā)明制備的分子標(biāo)記在豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用
試驗(yàn)共檢測(cè)了 140個(gè)豬個(gè)體，包括中國地方豬品種“通城豬”純種27頭，外來豬“大 白”純種28頭，“長白”純種27頭，中國地方豬與外來豬的雜交培育的雜交豬“大長通”(大 白X(長白X通城))29頭、長大通(長白X(大白X通城))29頭的多態(tài)，確定其基因 型，并進(jìn)行基因型與生產(chǎn)性狀(出生至上市平均日增重、胴體直長、胴體斜長、腿臀比率、腿 臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水損失、肌肉PH值、肌內(nèi)脂肪含量、肉色、眼肌面積、 臀部膘厚)的關(guān)聯(lián)分析。建立如下所述的最小二乘模型yiJk = μ +Gi+Cj+P.+Bj+ ε iJk其中，yijk是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，G1為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)，Pk為 父本效應(yīng)，B」為批次效應(yīng)，為隨機(jī)誤差，假定^uk相互獨(dú)立，服從Ν(0，σ2)分布。 BcII-RFLP基因型檢測(cè)結(jié)果表明在140個(gè)個(gè)體中CC基因型有48個(gè)個(gè)體，TC基因型有59個(gè) 個(gè)體，TT基因型有33個(gè)個(gè)體，基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果是Nudt6基因與板油率，內(nèi)脂 率和腿臀肉骨率呈顯著相關(guān)。由表1可知，Nudt6基因BclI-RFLP SNP位點(diǎn)對(duì)屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積有顯著 影響(P < 0. 05)，此位點(diǎn)對(duì)其它胴體性狀沒有顯著影響。表1 :Nudt6基因BcII-RFLP多態(tài)不同基因型均值及與部分胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
一種與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudt6的分子標(biāo)記，它的cDNA序列如序列表SEQ IDNO1所述，在序列表SEQ ID NO1的169bp處有1個(gè)T169 C169的堿基替換。
2.一種檢測(cè)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示 正向引物5 ‘ -TTTTTTTTTTCGCTTAAAGCCACGTTCATTGA-3 ‘，反向引物5 ‘ -ATAGAGCAGCAGCCGAGCAAC-3 ‘。
3.一種與豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率相關(guān)基因Nudte的分子標(biāo)記的制備方法，其 步驟如下用鼠Nudte基因cDNA為探針，作同源序列篩選，獲得同源性90 %以上的表達(dá)序列 標(biāo)簽(EST)，然后拼接豬EST-重疊群，根據(jù)EST-重疊群序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述的引物 對(duì)的核苷酸序列如下所示正向引物為5 ‘ -AGCCTGGAGAAGATATTGGA-3 ‘，反向引物為 5' -ATAGCATTTACCATTATCCAGT-3‘ ；PCR 擴(kuò)增獲得如序列表 SEQ ID N0:1 所述的 cDNA 序 列；根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，利用ACRS-PCR-RFLP方法設(shè)計(jì)引物，該引物的核苷 酸序列如權(quán)利要求2所述，其正向引物5'端添加有IObp的oligodT，并在所述的正向引物 的第31位堿基處引入C — G突變。
4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在豬板油率，內(nèi)脂率和腿臀肉骨率標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與板油率，內(nèi)脂率，腿臀肉骨率和眼肌面積性狀相關(guān)Nudt6基因的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由Nudt6基因克隆得到，它的cDNA序列如SEQ ID NO1所述。在SEQ ID NO1序列的第169bp處有一個(gè)T169-C169的堿基替換，并通過設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)的突變引物方法(ACRS-PCR-RFLP)通過BclI酶切檢測(cè)該SNP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增Nudt6基因部分cDNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測(cè)的方法，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101955931SQ20101027864
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者劉榜, 孫玲, 彭中鎮(zhèn), 徐學(xué)文, 樊斌 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)