專利名稱：一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，尤其涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方 法。
背景技術(shù)：
利用豬睪丸(ST)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)豬細(xì)小病毒滅活疫苗是一種常用豬細(xì)小病毒滅 活疫苗的生產(chǎn)工藝。目前，該生產(chǎn)工藝是采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)ST細(xì)胞工藝，即采用種毒接 種已形成單層的轉(zhuǎn)瓶ST細(xì)胞或采用細(xì)胞傳代時(shí)同時(shí)接入種毒來(lái)生產(chǎn)豬細(xì)小病毒滅活疫 苗，因各個(gè)轉(zhuǎn)瓶都是獨(dú)立的細(xì)胞元，所以每瓶的細(xì)胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度都不同，直接導(dǎo) 致產(chǎn)生疫苗批間差大和隱性污染引起高內(nèi)毒素等缺點(diǎn)，同時(shí)勞動(dòng)強(qiáng)度大。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種豬細(xì)小病毒滅 活疫苗的制備方法，以實(shí)現(xiàn)制備出的豬細(xì)小病毒滅活疫苗質(zhì)量均一。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(1) ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)；用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括pH值7. 0 7. 3、溫度35 37°C，培養(yǎng)基為DMEM ；培養(yǎng)48 72h，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為3 6 X IO5Cells/ ml，即可；(2) ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)；細(xì)胞接種密度為1 2X105cellS/ml，微載體濃度為3 5g/L，溶氧為30 % 60%，pH值7. 0 7. 3，溫度35 37°C，轉(zhuǎn)速40 60r/min，培養(yǎng)基為DMEM ；培養(yǎng)至細(xì)胞濃 度為3 5X 106cells/ml ；其中，微載體為球狀載體Cytodexl或片狀載體；(3) ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體的連續(xù)培養(yǎng)；以一定速度向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加新鮮的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)用相同的速度向 外排出培養(yǎng)好的ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞，保證ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞在反應(yīng)器中停留時(shí)間 內(nèi)擴(kuò)增至濃度為3 5X106cells/ml，即可；(4)接種豬細(xì)小病毒培養(yǎng)；將豬細(xì)小病毒接種于連續(xù)培養(yǎng)ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)， 接種MOI為0.01，培養(yǎng)條件包括溶氧30-60%, PH值7. 1-7. 4、溫度35_37°C，使病毒含量 達(dá)到彡 106 0TCID50/ml ；(5)收集病毒液，滅活病毒，制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。步驟(1)中，在所述的DMEM培養(yǎng)基中，添加有體積濃度為5 10%的血清(BVDV 抗體陰性)。步驟(3)中，所述的一定速度為2 3個(gè)生物反應(yīng)器體積/天。
步驟(4)中，在培養(yǎng)過(guò)程中，監(jiān)控葡萄糖的消耗、乳酸的產(chǎn)生和氨的產(chǎn)生，并對(duì)微 載體上細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。所述的球狀載體Cytodexl上細(xì)胞計(jì)數(shù)，先用PBS漂洗2次，經(jīng)0. 1% 結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核。上述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，利用ST細(xì)胞專用培血清(BVDV抗體陰 性)培養(yǎng)，血清濃度可降低至5%，首先從液氮中復(fù)蘇ST細(xì)胞，接著用三角瓶培養(yǎng)擴(kuò)增種子 細(xì)胞，然后接種5L反應(yīng)器進(jìn)行微載體培養(yǎng)，待ST細(xì)胞生長(zhǎng)合適 密度，接種豬細(xì)小病毒種毒， 收獲病毒上清，按照常規(guī)的滅活疫苗制備工藝制備豬細(xì)小病毒滅活疫苗即可。有益效果本發(fā)明的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，為采用反應(yīng)器微載體培養(yǎng) ST細(xì)胞的豬細(xì)小病毒工藝，微載體提供了更大的表面積，不僅能提高ST細(xì)胞密度，提高病 毒滴度，而且反應(yīng)器能自動(dòng)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒繁殖時(shí)的最適生化條件，每批反應(yīng)器生產(chǎn) 上清的病毒滴度均一批間小、質(zhì)量穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。本發(fā)明使用的豬細(xì)小病毒來(lái)源于金宇保靈生物藥品有限公司，命名為Porcine parvovirus isolate/Bei jing/BJ-2/04,簡(jiǎn)稱豬細(xì)小病毒BJ-2株；豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)， 來(lái)源于中國(guó)獸藥監(jiān)察所；豬腎細(xì)胞(IBRS-2)，來(lái)源于上海交通大學(xué)藥學(xué)院。實(shí)施例1篩選適宜細(xì)胞系將豬細(xì)小病毒BJ-2株接種于ST或者IBRS-2傳代細(xì)胞，在DMEM培養(yǎng)基中，控制培 養(yǎng)條件為PH值7. 0 7. 3，溫度35 37°C，不斷傳代培養(yǎng)，使病毒適應(yīng)細(xì)胞，測(cè)定病毒繁殖 滴度，至達(dá)到所需病毒含量要求彡106_°TCID5(l/ml，篩選出適宜的細(xì)胞系。適宜的細(xì)胞系應(yīng)該具有形態(tài)良好，狀態(tài)穩(wěn)定、一致，產(chǎn)毒高等特點(diǎn)。具體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn) 為細(xì)胞形態(tài)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)觀察 6h即可貼壁，40h可長(zhǎng)成單層。顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈不規(guī)則形狀。外源病毒檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)外源性病毒污染。胞核學(xué)檢查對(duì)不同傳代水平的細(xì)胞，取50個(gè)處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢 查。在基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞中存在的染色體標(biāo)志，在最高代次細(xì)胞中也應(yīng)存在，與基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)的 細(xì)胞相比，所有細(xì)胞的染色體模式差異數(shù)不得超過(guò)15 %，核型必須相同。無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。支原體檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)支原體生長(zhǎng)。細(xì)胞代次基礎(chǔ)細(xì)胞代次為2 10代，工作細(xì)胞代次為11 20代，生產(chǎn)用細(xì)胞代 次不超過(guò)30代。細(xì)胞保存液氮保存，保存期24個(gè)月。毒種繼代應(yīng)不超過(guò)3代。毒種種子批的建立將分離純化后的BJ-2株病毒在ST細(xì)胞上連傳20代，測(cè)定病 毒含量及對(duì)豚鼠紅細(xì)胞HA效價(jià)，并選取E1、E5、E10、E15、E20代毒進(jìn)行特異性、免疫原性及 純凈性鑒定，結(jié)果表明各代次病毒含量穩(wěn)定，均在106_° 107_°TCID5(l/ml，其免疫原性、特異性、純凈性均符合種毒標(biāo)準(zhǔn)，且未發(fā)生明顯改變。為保證生產(chǎn)用毒種良好的免疫原性和安 全性，原始種子批代次定位El E5代種毒，基礎(chǔ)種子批代次為E6 ElO代種毒，生產(chǎn)種子 為Ell E13代種毒。實(shí)施例2病毒鑒定使BJ-2株病毒在實(shí)施例1篩選出的合適的細(xì)胞系上，在添加有5 10%血清濃度 的在DMEM培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)條件為PH值7. 0 7. 3，溫度35 37°C，不斷傳代培養(yǎng)，同 時(shí)鑒定病毒的特異性、免疫原性、毒力等病毒特性，并作基因序列分析，保證病毒在培養(yǎng)過(guò) 程中與原分離株在特異性、毒力、免疫原性等方面沒(méi)有發(fā)生明顯改變。(1)病毒的特異性鑒定理化特性檢測(cè)結(jié)果表明，該分離株對(duì)脂溶劑、酸、堿均不敏感，對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)。這 些特點(diǎn)符合PPV的一般特性。熒光抑制試驗(yàn)豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(HCV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬繁殖 與呼吸綜合征(PRRSV)均為可引起懷孕母豬相似癥狀的病毒。根據(jù)試驗(yàn)可知(見(jiàn)表1)，分 離的毒株培養(yǎng)物不能被PRV熒光抗體、PRRSV間接熒光抗體特異性染色，所以該毒株排除了 PRV和PRRSV的可能性；三價(jià)熒光抗體對(duì)分離的毒株培養(yǎng)物和豬瘟病毒培養(yǎng)物均敏感，而且 該分離毒株可被PPV抗血清特異結(jié)合而抑制三價(jià)熒光抗體特異性染色，初步判定該分離毒 株不是豬瘟病毒(HCV)而是豬細(xì)小病毒(PPV)表1熒光抑制試驗(yàn)
權(quán)利要求
一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)；用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括pH值7.0～7.3、溫度35～37℃，培養(yǎng)基為DMEM；培養(yǎng)48～72h，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為3～6×105cells/ml，即可；(2)ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)；細(xì)胞接種密度為1～2×105cells/ml，微載體濃度為3～5g/L，溶氧為30％～60％，pH值7.0～7.3，溫度35～37℃，轉(zhuǎn)速40～60r/min，培養(yǎng)基為DMEM；培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為3～5×106cells/ml；其中，微載體為球狀載體Cytodex1或片狀載體；(3)ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體的連續(xù)培養(yǎng)；以一定速度向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加新鮮的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)用相同的速度向外排出培養(yǎng)好的ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞，保證ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞在反應(yīng)器中停留時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增至濃度為3～5×106cells/ml，即可；(4)接種豬細(xì)小病毒培養(yǎng)；將豬細(xì)小病毒接種于連續(xù)培養(yǎng)ST細(xì)胞或IBRS 2細(xì)胞的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，接種MOI為0.01，培養(yǎng)條件包括溶氧30 60％、PH值7.1 7.4、溫度35 37℃，使病毒含量達(dá)到≥106.0TCID50/ml；(5)收集病毒液，滅活病毒，制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于在步驟(1) 中，在所述的DMEM培養(yǎng)基中，添加有體積濃度為5 10%的血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟(3)中， 所述的一定速度為2 3個(gè)生物反應(yīng)器體積/天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟(4)中， 在培養(yǎng)過(guò)程中，監(jiān)控葡萄糖的消耗、乳酸的產(chǎn)生和氨的產(chǎn)生，并對(duì)球狀載體Cytodexl上細(xì) 胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的球狀 載體Cytodexl上細(xì)胞計(jì)數(shù)，先用PBS漂洗2次，經(jīng)0. 1 %結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法。該制備方法包括ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)；ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)；ST細(xì)胞或IBRS-2細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體的連續(xù)培養(yǎng)；接種豬細(xì)小病毒培養(yǎng)；收集病毒液，滅活病毒，制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。本發(fā)明的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，為采用反應(yīng)器微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞的豬細(xì)小病毒工藝，微載體提供了更大的表面積，不僅能提高ST細(xì)胞密度，提高病毒滴度，而且反應(yīng)器能自動(dòng)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒繁殖時(shí)的最適生化條件，每批反應(yīng)器生產(chǎn)上清的病毒滴度均一批間小、質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101947318SQ20101027750
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者傅元華, 刁文華, 史春云, 李玉和, 潘杰 申請(qǐng)人:揚(yáng)州優(yōu)邦生物制藥有限公司;揚(yáng)州威克生物工程有限公司