一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法

專利名稱：一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法。
背景技術(shù)：
孤雌生殖(Parthenogenesis)是指在沒有精子參與的情況下，由卵細(xì)胞直接發(fā)育 為一個(gè)胚胎的過程。孤雌生殖是自然界正常的繁殖方式，在昆蟲較為普遍，爬行類、魚類、鳥 類動(dòng)物也可見孤雌生殖現(xiàn)象，但是哺乳動(dòng)物的孤雌胚胎如果不經(jīng)過基因校正修飾將無法出 生，通常在胚胎種植后不久，由于胚外組織發(fā)育不良，無法形成正常的胎盤而夭折。雖然哺 乳動(dòng)物孤雌生殖的胚胎無法發(fā)育到正常出生，但是孤雌細(xì)胞與正常細(xì)胞形成的嵌合胚胎能 夠活產(chǎn)。小鼠的孤雌嵌合體試驗(yàn)(Thomson，1998)，把孤雌細(xì)胞注入到正常受精的胚胎，可以 觀察到孤雌細(xì)胞整合到胚胎三個(gè)胚層的組織器官中，并參與相應(yīng)器官組織的發(fā)育。1995年， Nature Genetics還報(bào)道了一個(gè)存在孤雌細(xì)胞嵌合的14歲小男孩，他的皮膚中含有部分孤 雌來源的細(xì)胞，外周血白細(xì)胞則完全由孤雌細(xì)胞構(gòu)成，核型表現(xiàn)為46，XX (Strain，1995)。這 些現(xiàn)象說明了孤雌細(xì)胞能夠參與到機(jī)體內(nèi)器官的發(fā)育，在部分器官還能明確發(fā)揮功能。隨著體外受精和胚胎培養(yǎng)技術(shù)的成熟，在體外操作卵子和胚胎成為現(xiàn)實(shí)。在 IVF-ET過程中，B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵及隨后的短暫培養(yǎng)過程也偶然引起卵細(xì)胞被孤 雌激活的現(xiàn)象(Muechler，1989 ；Sultan, 1995 ；Chen，2009)，從而形成孤雌胚胎，并進(jìn)一步 從中分離孤雌胚胎干細(xì)胞系。2007年本實(shí)驗(yàn)室分離的世界上第一株純合型人類孤雌胚胎干 細(xì)胞系(parthenogenetic embryonicstem cells, pESCs)即來自于 IVF 過程中的 1PN 胚胎 (Lin，2007)。除了自然情況，利用人工激活的方法也可以獲得孤雌胚胎。有文章報(bào)道在未 受精的冷凍卵子中，86. 的卵子能夠被人工激活，激活的胚胎中又有96. 8%能夠發(fā)育成 孤雌胚胎，最終有16. 7%能夠發(fā)育到囊胚階段(De Fried，2008)。目前，有許多物種利用人 工激活的方法得到孤雌囊胚，并最終分離獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系，如小鼠、大鼠、兔、豬、山 羊、牛、猴等(Cibelli，2006)。2007年，本實(shí)驗(yàn)室與其他一些研究組也先后利用人工孤雌激 活的方法獲得了人類孤雌胚胎干細(xì)胞系(Revazova，2007，2008 ；Lin, 2007 ；Mai, 2007) 孤雌胚胎干細(xì)胞系是構(gòu)建患者自身特異性多能干細(xì)胞的方法之一，pESCs的遺傳 物質(zhì)(包括細(xì)胞核和線粒體的基因組)全部來自于卵細(xì)胞，其HLA與供卵者完全匹配，分化 后得到的功能細(xì)胞移植到供卵者體內(nèi)，相當(dāng)于自體移植，不會(huì)激起免疫排斥反應(yīng)，相當(dāng)于育 齡女性患者的“克隆”。目前孤雌人工激活的方法多為阻止第二極體的排出，從而維持細(xì)胞 的二倍體狀態(tài)。這種情況下，由于存在同源染色體之間的聯(lián)會(huì)以及非姐妹染色單體之間遺 傳物質(zhì)的交換，70. 9%細(xì)胞系的HLA表現(xiàn)為雜合狀態(tài)(Kim，2007)，只能為供卵者或者HLA完 全匹配的人群服務(wù)。另外一種人工激活的方式，即聯(lián)合應(yīng)用A23187和puromycin，允許第二 極體的排出，形成的單倍體在有絲分裂之前DNA復(fù)制一次恢復(fù)二倍體狀態(tài)，從而得到純合 的孤雌胚胎干細(xì)胞系。如果在胚胎干細(xì)胞庫中能夠多儲(chǔ)存這樣常見HLA單倍型純合甚至全 基因組純合的細(xì)胞系，有利于提高胚胎干細(xì)胞庫的應(yīng)用價(jià)值，降低胚胎干細(xì)胞庫需要的細(xì) 胞系數(shù)量。并且由于pESCs來自于沒有發(fā)育潛能的孤雌胚胎，相對(duì)于破壞正常胚胎的hESCs而言，倫理爭(zhēng)議更少，是胚胎干細(xì)胞庫的重要細(xì)胞系來源。導(dǎo)致孤雌胚胎發(fā)育缺陷的關(guān)鍵原因就在于基因組印記的異常，由于缺乏父源性基 因組印記，胚胎外組織不能正常發(fā)育，孤雌胚胎最多能夠存活到懷孕中期，胚胎本身發(fā)育滯 緩，但是形態(tài)正常。在小鼠嵌合體實(shí)驗(yàn)中觀察到孤雌細(xì)胞能夠整合到正常胚胎中參與各個(gè) 組織器官的發(fā)育，但是在滋養(yǎng)外胚層和胚外內(nèi)胚層等胚外組織中未見孤雌細(xì)胞，而孤雄細(xì) 胞則基本富集在胚外組織中，幾乎不參與胚胎本身的發(fā)育，提示印記狀態(tài)會(huì)影響細(xì)胞的分 化命運(yùn)。建系過程沒有改變孤雌胚胎干細(xì)胞的印記狀態(tài)，其印記基因表達(dá)模式仍與孤雌胚 胎相似，即表達(dá)母源性印記基因，而父源性印記基因不表達(dá)。孤雌胚胎干細(xì)胞未來臨床應(yīng)用最大的安全隱患在于其印記基因表達(dá)異常。但是這 種印記異常如果被糾正，就有可能安全應(yīng)用。韓國科學(xué)家的實(shí)驗(yàn)給予了很好的提示。他們 通過基因修飾小部分發(fā)育關(guān)鍵的印記基因(H19/Igf2 ；Dlkl-Gtl2)能夠改善孤雌胚胎的質(zhì) 量甚至得到孤雌出生的小鼠(Kono，2004 ;Wu，2006)。同樣，孤雌來源的造血干細(xì)胞能夠重 建致死性照射后小鼠的造血系統(tǒng)，達(dá)到穩(wěn)定和有功能的造血干細(xì)胞移植(Eckardt，2007)， 而一個(gè)罕見的具有孤雌嵌合人類，其外周血白細(xì)胞完全來自于孤雌細(xì)胞，并能夠發(fā)揮正常 功能(Strain，1995)。因此，盡管不能保證孤雌胚胎干細(xì)胞來源的所有組織器官都可以正常 發(fā)育，但是至少在某些組織器官內(nèi)能夠其起作用。如果能夠?qū)麓婆咛ジ杉?xì)胞來源的組織 進(jìn)行遺傳與功能分析證明它們是安全和有效的，孤雌胚胎干細(xì)胞也可能代表一種有效的組 織替代治療的細(xì)胞來源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法，它是從1PN胚胎中分 離得到的基因組純合型孤雌胚胎干細(xì)胞。與以往報(bào)道的人類胚胎干細(xì)胞不同，本發(fā)明所獲得的孤雌胚胎干細(xì)胞系來源于 IVF過程中的1PN胚胎，SNP芯片分析發(fā)現(xiàn)其基因組99%以上的區(qū)域表現(xiàn)為純合。該基因組純合型孤雌胚胎干細(xì)胞系的具體獲得方法可以是包括以下步驟1、在胚胎受精12小時(shí)后觀察，選擇單原核胚胎進(jìn)一步培養(yǎng)至囊胚階段；2、切取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，接種至預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，并采用抑制細(xì)胞分化 的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；3、將未分化的細(xì)胞進(jìn)一步傳代、擴(kuò)增、凍存，并進(jìn)行孤雌特征以及干細(xì)胞特征的鑒定。本發(fā)明所獲得的孤雌胚胎干細(xì)胞系的孤雌來源以及全基因組的純合狀態(tài)是通過 HLA分型、STR位點(diǎn)分析以及SNP芯片分析來證明的HLA分型顯示了孤雌胚胎干細(xì)胞的HLA-A、-B和-DR位點(diǎn)是和供卵者半匹配的，與 父方HLA完全不匹配(圖1)。15個(gè)STR位點(diǎn)和Amelogenin基因均表現(xiàn)為純合，且與供卵 者的等位基因半相合，與父方的等位基因基本不相同(圖2)。SNP芯片總共分析了全基因 組500，447個(gè)SNP位點(diǎn)，結(jié)果顯示99%以上的位點(diǎn)表現(xiàn)為純合，而異質(zhì)性位點(diǎn)在基因組范圍 內(nèi)散在分布(圖3)。本發(fā)明所獲得的孤雌胚胎干細(xì)胞系的印記基因分析包括父源性印記基因SNRPN、 IPW、KCNQ10T1、PEG3、IGF2，母源性印記基因 NES55、H19。其中 SNRPN、IPW、KCNQ10T1、PEG3均未檢出，而IGF2僅有微弱表達(dá)，母源性印記基因NES55、H19的表達(dá)比正常胚胎干細(xì)胞有 所增強(qiáng)(圖4)。這些結(jié)果為chHES-32的孤雌來源提供了進(jìn)一步的證據(jù)。經(jīng)過干細(xì)胞特征的鑒定，該孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32表達(dá)干細(xì)胞特異性標(biāo)記 (圖5)以及多能性相關(guān)基因，維持正常的二倍體核型46，XX，具有強(qiáng)的端粒酶活性(圖6)， 能夠在體內(nèi)外向三個(gè)胚層的細(xì)胞分化(圖7)。本發(fā)明提供的這株從1PN胚胎中分離獲得的基因組基本純合型孤雌胚胎干細(xì)胞 系及其衍生物對(duì)于探討父源性基因組和母源性基因組在遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)上對(duì)于發(fā)育 過程的影響具有重要的意義，是研究印記基因在胚胎發(fā)育過程中生物學(xué)作用的重要工具。 此外，該細(xì)胞系具有向三個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力，且HLA位點(diǎn)純合，誘導(dǎo)分化為特定的功能 細(xì)胞后用于HLA半相合患者的細(xì)胞替代治療，可以避免免疫排斥反應(yīng)，是干細(xì)胞庫重要的 種子細(xì)胞來源，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32的STR檢測(cè)情況chHES_32的STR位點(diǎn)表現(xiàn) 為純合，與供卵者半相合，而與父方基本不一致。圖2為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32的SNP分析結(jié)果?；蚪M范圍內(nèi)99%以上的 區(qū)域表現(xiàn)為純合，不到1 %的區(qū)域?yàn)殡s合，且散在分布與基因組內(nèi)。圖3為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32與正常胚胎干細(xì)胞chHES_35的印記基因表 達(dá)情況chHES-35同時(shí)表達(dá)父源性和母源性印記基因，而chHES-32僅表達(dá)母源性印記基因 (NES55、H19)，而不表達(dá)父源性印記基因(SNRPN、IPW、KCNQ10T1、PEG3、IGF2)。圖4為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32來源的孤雌胚胎形態(tài)及細(xì)胞特征標(biāo)記染色鑒 定。A為受精12小時(shí)觀察1PN胚胎的光鏡下形態(tài)；B為1PN胚胎發(fā)育至第6天的囊胚形態(tài)； C為chHES-32的未分化細(xì)胞形態(tài)；D為堿性磷酸酶染色結(jié)果，表現(xiàn)為強(qiáng)陽性；E-I分別為干 細(xì)胞特異性標(biāo)記SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和0CT-4免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，均 顯示為陽性。圖5為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32的多能性相關(guān)基因、端粒酶和核型的鑒定。A 為多能性相關(guān)基因 OCT-4，NANOG, REX-1，S0X2, LEFTY A, TDGF, FGF4, TERF1, THY1 和 DPPA2 的PCR檢測(cè)結(jié)果；B為端粒酶檢測(cè)結(jié)果，顯示為高端粒酶活性；C顯示為正常的二倍體核 型-46，XX。圖6為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32體內(nèi)外分化能力的鑒定。A_C為chHES-32細(xì)胞 體外分化3周后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，分別為e-tubulin(A)，SMA⑶and AFP(C)； D-I為chHES-32細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤經(jīng)切片HE染色結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)有軟骨 (D)，骨(E)，脂肪組織(F)，神經(jīng)上皮(G)，皮脂腺(H)和消化道上皮(I)等組織。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一基因組純合型孤雌胚胎干細(xì)胞系的獲得一、患者的知情同意本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守中華人民共和國衛(wèi)生部的有關(guān)法規(guī)(人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范， 2003年)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，全過程受倫理委員會(huì)的監(jiān)督。捐贈(zèng)剩余胚胎或配子供干細(xì)胞研究的IVF患者均被詳細(xì)告知實(shí)驗(yàn)流程，包括實(shí)驗(yàn)的目的、意義、配子或胚胎 的使用途徑、捐贈(zèng)行為的自愿、無償原則、研究者的保密、無傷害原則等，即通過完整充分的 說明和介紹，對(duì)捐贈(zèng)者有關(guān)詢問的必要回答和解釋，使捐贈(zèng)者全面了解捐贈(zèng)行為的利與弊， 在完全知情的情況下，自主、自愿、理性得做出負(fù)責(zé)任的決定。保證所有胚胎僅限于科研使 用，嚴(yán)禁用于生殖目的。二、1PN胚胎的培養(yǎng)將取出的卵冠丘復(fù)合體置于1ml含有10%母體血清的B2培養(yǎng)基中，繼續(xù)成熟培 養(yǎng)4 6小時(shí)等待授精。授精時(shí)按5 X 10個(gè)直線運(yùn)動(dòng)精子/ml的密度進(jìn)行授精，平均每1ml 加入2 3個(gè)卵冠丘復(fù)合體。授精后16 18小時(shí)觀察受精情況，只觀測(cè)到1個(gè)原核的胚 胎(1PN)被移入預(yù)先在培養(yǎng)箱中平衡過夜的50ul G1. 2培養(yǎng)基微滴中，其上覆蓋有石蠟油 進(jìn)行培養(yǎng)。第3天上午，將發(fā)育的6 8細(xì)胞胚胎移到50ul G2. 2培養(yǎng)基微滴中培養(yǎng)至囊 胚階段用于胚胎干細(xì)胞的分離。三、孤雌胚胎干細(xì)胞系的建立和培養(yǎng)囊胚被機(jī)械切割成兩半，含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一半將種植在經(jīng)絲裂霉素C有絲分裂滅 活的人胚成纖維細(xì)胞(human embryonic fibroblasts, hEFs，密度為 5，000cells/cm2)飼 養(yǎng)層上進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DFSR培養(yǎng)基，包括75% DMEM/F12U5% K0_SR、2mM左旋谷氨 酰胺、0. ImM 巰基乙醇、非必需氨基酸和50ng/ml bFGF。隔天換液，4 7天后，有平 鋪生長的類胚胎干細(xì)胞團(tuán)塊長出，機(jī)械挑取未分化部分，分割成小塊后種植于新的飼養(yǎng)層 上繼續(xù)培養(yǎng)，約7天傳代一次。待胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)代并且凍存足夠量的早期細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移 到添加4ng/ml bFGF的常規(guī)DFSR培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)。實(shí)施例二 孤雌胚胎干細(xì)胞系的鑒定一、孤雌胚胎干細(xì)胞系的常規(guī)干細(xì)胞特性鑒定1.堿性磷酸酶(AKP)的檢測(cè)采用Invitrogen公司提供的Fast Red Substrate Pack試劑盒對(duì)未分化的hESCs 克隆進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟按試劑盒提供的方法進(jìn)行，基本原理同Gomori a -萘酚磷酸法，即 堿性磷酸酶在堿性條件下將a-萘基磷酸水解出a-萘酚，然后與固紅B鹽在酶活性部位 偶聯(lián)形成棕紅色不溶于水的鹽。陽性染色結(jié)果為鮮紅色。周邊的MEF不著色，為陰性對(duì)照。2細(xì)胞特異抗原的檢測(cè)多能性干細(xì)胞特異性抗原，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT-4； 三胚層特異性標(biāo)記，包括AFP(內(nèi)胚層)、0-tubulin(外胚層)、SMA(中胚層)。均采用 間接免疫熒光法來檢測(cè)，步驟如下培養(yǎng)的ES克隆用4%的多聚甲醛固定20分鐘；0. 1% Triton-X-100透膜10分鐘(此步驟針對(duì)核內(nèi)抗原0CT-4，其余為胞膜抗原不需要)；正常 山羊血清室溫封閉30分鐘；相應(yīng)的一抗4°C孵育過夜；加入Alexa Flour 488-連接二抗， 室溫避光孵育1小時(shí)；DAPI復(fù)染核；熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果并照相。3 hESCs的G顯帶核型分析將hESCs轉(zhuǎn)移至用matrigel鋪皿、hEFs-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的無飼養(yǎng)層體系下進(jìn)一 步擴(kuò)增并且去除人飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染。培養(yǎng)3天后，在培養(yǎng)基中加入秋水仙堿(終濃度為 80ng/ml)，37°C處理3. 5小時(shí)。用0. 05%胰蛋白酶/0. 53mM EDTA消化收集細(xì)胞。按本實(shí)驗(yàn) 室常規(guī)方法制備好染色體涂片，Giemsa溶液染色，樹膠封片，在油鏡下觀察結(jié)果。每個(gè)樣本分析5-10個(gè)中期分裂相。表 1
Sample Hiuiia ^ .、 .、 _-A_-B_-DRB_r/iH.FS-32A-OlB1M 5B ^DRBl-UDRBl i^li
oocyte donorA1-!,A^02B^35B、DPUi3DRBi:H5
donorV— A”4B"60B .DRBl^lIDRBrM 5表1為孤雌胚胎干細(xì)胞系chHES-32的HLA檢測(cè)情況ChHES_32的HLA位點(diǎn)表現(xiàn) 為純合，與供卵者半相合，而與父方完全不一致。4hESCs多能性相關(guān)基因的檢測(cè)收集未分化的hESCs團(tuán)塊，用Trizol抽提總RNA，用Fermentas公司提供的逆轉(zhuǎn)錄 試劑盒將lug RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，以檢測(cè)其中多能性相關(guān)基 因 0CT3/4、Nanog、REX-l、S0X2、THYl、TDGFl、TERFl、LEFTB、DPPA2 和 FGF4 的表達(dá)，β -actin 為反應(yīng)體系陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件95°C 1分30秒；30個(gè)循環(huán)(94°C 40秒，54°C -64°C 40 秒，72 0C 40秒)；72°C延伸7分鐘。5hESCs分化潛能的檢測(cè)5. 1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-畸胎瘤的制備收集未分化hESCs克隆，約1-2 X 106cells，注射入6_8周齡雄性SCID小鼠的后肢 肌肉中，觀察畸胎瘤的形成情況。8-12周后取出腫瘤，常規(guī)石臘包埋切片后，HE染色觀察。5. 2體外實(shí)驗(yàn)_擬胚體的制備將hESCs克隆機(jī)械切割成大小基本一致的團(tuán)塊，收集hESCs團(tuán)塊于60mm細(xì)菌培養(yǎng) 皿中懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基為EB培養(yǎng)基，即不含bFGF的DFSR培養(yǎng)基，每天換液，懸浮培養(yǎng)7天 后，接種到預(yù)先用0. 明膠處理的六孔板中貼壁培養(yǎng)14天，然后進(jìn)行三胚層標(biāo)記的免疫 組化染色。二、本發(fā)明孤雌胚胎干細(xì)胞系及其衍生物的特異性鑒定1全基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Matrigel鋪皿、hEFs-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的無飼養(yǎng)層體系下進(jìn) 一步擴(kuò)增，同時(shí)去除人飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染。0.05%胰酶消化收集細(xì)胞，用DNeasy Blood & Tissue kit 抽提全基因組DNA。我們采用 GeneChip Human Mapping SNP Array 5.0 對(duì) 2 個(gè) 正常受精hESCs系和2個(gè)pESCs系進(jìn)行全基因組SNP分型分析，根據(jù)全基因組SNP位點(diǎn)的 基因分型來幫助判斷細(xì)胞系的來源。分析方法是Y染色體以外的所有染色體從著絲粒位 置開始，每1Mb作為一個(gè)單位，向染色體兩端分區(qū)，然后計(jì)算每個(gè)單位區(qū)間SNP的雜合頻率 (雜合的SNP位點(diǎn)數(shù)/總的SNP位點(diǎn)數(shù)目)。我們規(guī)定如果單個(gè)區(qū)間內(nèi)SNP的雜合頻率低 于5%，那么判定該區(qū)域?yàn)榧兒希粗?，如果雜合頻率高于5%，則判定該區(qū)域?yàn)殡s合。由于 chHES-8核型為46，XY,其X染色體應(yīng)該表現(xiàn)為純合，而芯片結(jié)果顯示該X染色體有0. 5% 的區(qū)域?yàn)殡s合，我們將這條染色體總的雜合頻率作為SNP芯片的系統(tǒng)誤差，以此控制整個(gè) 基因分型分析的誤差概率。2印記基因的RT-PCR檢測(cè)用Trizol抽提總RNA，用Fermentas公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將lug RNA反轉(zhuǎn)錄 為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)印記基因的表達(dá)，β -actin為反應(yīng)體系陽性對(duì)照。PCR 反應(yīng)條件95°C 1 分 30 秒；25-30 個(gè)循環(huán)(95 °C 40 秒，54°C -64°C 40 秒，72°C 40 秒)；72°C延伸7分鐘。3DNA指紋分析胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Matrigel鋪皿、hEFs-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的無飼養(yǎng)層體系下 進(jìn)一步擴(kuò)增，同時(shí)去除人飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染。0.05%胰酶消化收集細(xì)胞，用DNeasyBlood & Tissue kit抽提全基因組DNA，3130基因分析儀進(jìn)行DNA指紋分析。采用powerpiex 16system,總共分析15個(gè)STR位點(diǎn)以及Amelogenin，操作步驟參見試劑盒說明書。4HLA分型的檢測(cè)對(duì)胚胎干細(xì)胞均進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原HLA-A、-B、-DR位點(diǎn)的DNA分型。胚胎干細(xì) 胞轉(zhuǎn)移至Matrigel鋪皿、hEFs-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的無飼養(yǎng)層體系下進(jìn)一步擴(kuò)增，同時(shí)去除 人飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染。0.05%胰酶消化收集細(xì)胞，用DNeasy Blood & Tissue kit抽提全 基因組DNA。采用Invitrogen公司提供的AB/DR SSP UniTray進(jìn)行HLA分型的檢測(cè)，運(yùn)用 PCR-SSP的方法，具體步驟參見試劑盒說明書。
權(quán)利要求
一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于該孤雌胚胎干細(xì)胞是從1PN胚胎中分離得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)在胚胎受精12小時(shí)后觀察，選擇單原核胚胎進(jìn)一步培養(yǎng)至囊胚階段；(2)切取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，接種至預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，并采用抑制細(xì)胞分化的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)將未分化的細(xì)胞進(jìn)一步傳代、擴(kuò)增、凍存，并進(jìn)行孤雌特征以及干細(xì)胞特征的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系的方法。該細(xì)胞系從IVF廢棄的1PN胚胎中分離得到，通過SNP芯片分析發(fā)現(xiàn)其基因組99％以上的區(qū)域表現(xiàn)為純合狀態(tài)，而DNA指紋則證明其遺傳物質(zhì)完全來源于母方，無父方基因組的參與。本發(fā)明證明了IVF過程中廢棄的1PN胚胎是分離純合型孤雌胚胎干細(xì)胞系的一種來源，由此得到的純合型孤雌胚胎干細(xì)胞系遺傳背景簡單，HLA位點(diǎn)純合，不僅能夠滿足供卵者，而且能夠滿足更多HLA分型相同人群的器官移植要求，是細(xì)胞替代治療的重要種子細(xì)胞來源。此外，該孤雌胚胎干細(xì)胞系還是研究單性生殖發(fā)育以及印記基因作用的良好工具。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101914491SQ20101026677
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者盧光琇, 林戈, 歐陽琦 申請(qǐng)人:湖南光琇高新生命科技有限公司