專(zhuān)利名稱(chēng)：齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因、重組表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP)基因、含有該基因的原核重 組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
(Odontoglossum ringspot tobamovirus, 0RSV)
產(chǎn)中蔓延最廣的病毒病之一(Korotieieva et al.，2004)，發(fā)病非常普遍且無(wú)需專(zhuān)門(mén)傳播 媒介，接觸傳染迅速，給花卉生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。大面積的田間生產(chǎn)和貿(mào)易中需要方便、快 捷的檢測(cè)方法，以及時(shí)阻隔病原物的擴(kuò)散。目前利用分子免疫學(xué)的方法因其具有的快速、特 異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物病毒檢測(cè)中。在檢測(cè)過(guò)程中往往需要制備特異性強(qiáng) 的抗體作為檢測(cè)試劑，通常病毒在病組織中含量低，一方面難以獲得大量高純度的病毒，另 一方面利用提純病毒制備的抗血清中常含有寄主蛋白的抗體，易導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)(鄧叢良 等，2005)。但是可以利用病毒核酸基因在大腸桿菌菌株中大量表達(dá)蛋白，通過(guò)蛋白的富集 和純化，可以利用其免疫獲得特異性強(qiáng)的抗血清，達(dá)到上述檢測(cè)要求，提高檢測(cè)的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP)基因齒蘭環(huán)斑病毒外 殼蛋白基因，含有該基因的原核重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因0RSVCP，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列agtcttacactattactgacccgtctaagctggcttatttaagctcggcttgggctgaccccaattcac taatcaacctttgtaccaattctctgggtaatcagttccaaacacaacaagctcgaacaactgttcaacagcagttt gctgatgtttggcagccggttcctactttgaccagtaggttccctgcaggcgctggttacttcagagtttatcgcta tgatcctatattagatcctttaataactttcttaatgggtacttttgatactcgtaatagaataatcgaggtagaaa atccgcagaatccgacaactacggaaacattagatgcaactcgtagagttgatgatgcaactgtagcaataagatct gcaataaataatctattaaatgagttagttaggggaactggtatgtacaatcaagtctcatttgagacgatgtctgg acttacttggacctcttcctaa。本發(fā)明還涉及一種所述基因的原核重組表達(dá)載體，由SEQ ID NO. 1所示的目的基 因ORSVCP插入原核表達(dá)載體獲得。本發(fā)明關(guān)鍵在于提供了齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因ORSVCP的基因序列，在已知 該基因序列的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以方便的獲得含有該基因的重組表達(dá)載體。所述原核表達(dá)載體為pET32c，目的基因ORSVCP的插入位點(diǎn)位于EcoR I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。PET32C表達(dá)載體是個(gè)帶有多克隆位點(diǎn)(Polylinker)的載體，多 克隆位點(diǎn)的下游含有組氨酸標(biāo)簽，因此外源基因以融合蛋白的形式表達(dá)，同時(shí)表達(dá)的蛋白N 端由載體序列編碼的6XHis標(biāo)記的蛋白不影響病毒外殼蛋白的免疫原性，由此制備的抗 血清特異性也不受影響。
所述原核重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜如圖1所示。本發(fā)明還涉及構(gòu)建所述原核重組表達(dá)載體的方法，所述方法包括以PET32C為原核表達(dá)載體，構(gòu)建含有ORSV外殼蛋白基因的原核表達(dá)載體pET32c-0RSV-cp，目的基因 ORSVCP的插入位點(diǎn)位于EcoR I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。具體的，所述方法如下(1)以O(shè)RSV-CP-F和ORSV-CP-R為引物、以感染齒蘭環(huán)斑病毒的蘭花總RNA為模 板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得ORSV的完整CP基因片段；ORSV-CP-F 5' -ATCGAATTCAGTCTTACACTATTACTGAC-3‘ORSV-CP-R 5’ -GCCAAGCTTTTAGGAAGAGGTCCAAGT-3’(2)純化后PCR產(chǎn)物和pET32c質(zhì)粒分別用EcoR I/Hind III雙酶切定，酶切結(jié)束 獲得目的基因片段(SEQ ID NO. 1)和質(zhì)粒DNA片段用試劑盒連接；(3)步驟(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆斑進(jìn)行培養(yǎng)，篩 選陽(yáng)性菌落，即為含有所述原核重組表達(dá)載體的菌落。所述步驟(1)最佳PCR反應(yīng)條件如下94°C熱變性3min ;94°C 30s，58°C 30s， 72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0本發(fā)明利用近年來(lái)蘭科病毒核酸基因組信息以及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)成果， 對(duì)含ORSV外殼蛋白基因的表達(dá)載體進(jìn)行了 IPTG誘導(dǎo)的原核表達(dá)、蛋白富集和純化，獲 得了約20毫升800yg/mL的ORSV-CP純化蛋白并初步鑒定了表達(dá)蛋白的免疫原性。 Western-blotting和蛋白濃度純度分析表明，表達(dá)產(chǎn)物陽(yáng)性血清具有免疫反應(yīng)性，純度高 濃度大，可以直接進(jìn)行免疫和抗血清制備，以用以O(shè)RSV的特異檢測(cè)。本發(fā)明以帶毒蘭花總RNA為模板，設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，獲得ORSV的完整CP 基因片段，EcoR I/Hind III雙酶切定向克隆到原核表達(dá)載體pET32c。挑取單克隆斑進(jìn)行 LB培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行序列測(cè)定，得到序列測(cè)定報(bào)告后，用DNAStar軟件進(jìn) 行序列比對(duì)分析，分析顯示ORSV CP基因與載體上的6XHis融合，且閱讀框正確。載體中 插入的ORSV CP序列與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ORSV CP基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性 介于97% 99%，其中與臺(tái)灣分離物(AF406775)同源性高達(dá)99%，與煙草花葉病毒外殼蛋 白基因的同源性最低為72%。獲得含齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)載體命名為 pET32c-0RSV-cp。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP)基因、 含有該基因的原核重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，利用原核表達(dá)病毒外殼蛋白基因的產(chǎn)物作 為抗原可以得到特異性強(qiáng)的抗血清，為進(jìn)一步研制ORSV的快速檢測(cè)試劑盒提供了基礎(chǔ)。
圖1為含齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的原核重組表達(dá)載體pET32c-0RSV-cp ；圖2為重組載體pET32c-0RSV-cp的PCR鑒定結(jié)果；1 標(biāo)準(zhǔn)Mark ；2 =ORSV的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.空白對(duì)照；圖3為原核表達(dá)的ORSV-CP蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果；1 非預(yù)染Mark ；2 pET32c-0RSV-cp在大腸桿菌中的表達(dá)蛋白；3 :pET32c在大腸桿菌中表達(dá)的載體蛋白；4 純化的pET32c-0RSV-CP表達(dá)蛋白；
圖4為ORSV抗體與原核表達(dá)菌株pET32c-0RSV_cp表達(dá)的CP蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果1 預(yù)染Mark ；2 純化的ORSV CP融合蛋白；3 :pET32c空載體表達(dá)的載體蛋白。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 重組載體的構(gòu)建1、材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株采自杭州傳化大地生物技術(shù)有限公司花卉基地，采 集黃化條紋和局部褪綠葉樣，于_75°C低溫冰箱保存。原核表達(dá)載體pET32c與大腸桿菌菌 株BL21(DE3)購(gòu)自北京英俊公司(Invitrogen，北京)。1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離的ORSV杭州分離物(GenBank登陸號(hào)為DQ915440)的CP基 因序列設(shè)計(jì)2條引物。在引物ORSV-CP-F的5’端添加EcoR I酶切位點(diǎn)和起始密碼子， ORSV-CP-R的5’端添加Hind III酶切位點(diǎn)和終止密碼子；所有引物均由上海生工生物技 術(shù)有限公司公司合成，引物序列如下ORSV-CP-F 5' -ATCGAATTCAGTCTTACACTATTACTGAC-3‘ORSV-CP-R 5' -GCCAAGCTTTTAGGAAGAGGTCCAAGT-3’1. 30RSV CP基因片段的PCR擴(kuò)增ORSV CP基因直接以蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株總RNA(以Trizol-RNA抽提試劑 盒提取)合成的1st cDNA (上海生工生物工程有限公司)為模板，用PCR方法合成，50 μ L 的PCR反應(yīng)體系包括5 X Primer STAR Buffer (Pakala,大連) 5 μ LdNTP2mmol/LPrimer (F)50pmol/LPrimer (R)50pmol/L
Primer STAR (Pakala,大連)0. 5 μ L模板1 μ L加去離子水補(bǔ)足50 μ L本申請(qǐng)發(fā)明人在前期工作基礎(chǔ)上已經(jīng)建立了 ORSV的最佳PCR反應(yīng)體系及條件 94°C熱變性 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀(guān)察目的條帶并拍照。1.4擴(kuò)增產(chǎn)物的純化在紫外燈下小心切下目的條帶，用上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司的DNA回收純 化試劑盒進(jìn)行回收，并取1 μ L純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，粗略定量。1. 5載體DNA和目的基因的酶切、回收將純化的PCR產(chǎn)物和pET32c質(zhì)粒分別用EcoR I、Hind III雙酶切，體系為去 離子水 30 μ L，EcoR I I (Pakala，大連)2.5 μ L，Hind III (Pakala，大連)2· 5 μ L，10 XMbuffer(Pakala，大連)5yL，質(zhì)粒DNA或目的基因DNA 10 μ L ;37°C酶切6h。酶切結(jié)束后用 DNA純化試劑盒(QIAGEN，上海)回收DNA片段，并用瓊脂糖凝膠電泳粗略定量，估計(jì)兩者濃 貞t匕。1. 6連接反應(yīng) 將回收的目的DNA片段與載體DNA按體積比4 1混合后，用連接試劑盒(Pakala， 大連)連接。連接體系為載體DNA 1 μ L、目的基因DNA 4 μ L、Solution I 5 μ L，混勻后 16 °C連接過(guò)夜。1. 7細(xì)菌轉(zhuǎn)化取連接產(chǎn)物與20(^1^感受態(tài)見(jiàn)21混勻，冰浴20min，42°C熱激90s后立即冰浴 2min，補(bǔ)加ImL LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。6000rpm離心lmin，棄ImL上清，用剩 余的200 μ L上清懸浮沉淀，涂布含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜至菌 落出現(xiàn)。2.結(jié)果與分析2. 1.原核表達(dá)載體的鑒定用EcoR I, Hind III對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定；同時(shí)用設(shè)計(jì)的特異性引物 ORSV-CP-F、ORSV-CP-R進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。挑取酶切和 PCR鑒定(鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2)為陽(yáng)性的菌落，命名為pET32c-0RSV-cp (圖譜見(jiàn)圖1)，轉(zhuǎn)接于 新的LB液體培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后送英俊公司測(cè)序，測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行同源性比 對(duì)。同源性介于97% 99%，其中與臺(tái)灣分離物(AF406775)同源性高達(dá)99%，與煙草花葉 病毒外殼蛋白基因的同源性最低為72%。ORSV曾一度被認(rèn)為是煙草花葉病毒的蘭花株系 (Orchid Rtrain of Tobacco mosaic virus, TMV-0)，但 1991 年日本學(xué)者 IS0MURA 等根據(jù) 核酸序列比較表明ORSV并非TMV-0。本研究中ORSV CP基因與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的TMV CP基因核苷酸及氨基酸序列都存在較大差異。但世界范圍內(nèi)不同地區(qū)ORSVCP核苷酸序列 存在高度的保守性。實(shí)施例2:蛋白的表達(dá)1.方法1.1 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)1)、挑取含ORSV外殼蛋白基因重組質(zhì)粒的單個(gè)轉(zhuǎn)化菌，接種于5mL含50 μ g/mL Ampcillin的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；2)、取200 μ L上述過(guò)夜培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接種于20mL含同樣濃度抗生素的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0. 4 0. 6 (約4 5小時(shí))；3)、上述20mL繼代培養(yǎng)液中加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后 收集誘導(dǎo)菌液。1 · 2 SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白1)、取誘導(dǎo)菌液ImL于Eppendorf管中，12000rpm離心lmin，去上清；2)、沉淀用0. OlM PBS洗滌后用80 μ L PBS懸浮，超聲波破碎并離心；3)、上述上清和沉淀各加入20 μ L 5 X十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)上樣緩沖液(600mM pH 6. 8Tris-HCl,5% 2-巰基乙醇，5% SDS, 0. 溴酚藍(lán)， 25%甘油)混合；
4)、上述混合液分別煮沸后離心，取上清，作為SDS-PAGE電泳樣品，用15%的分離 膠進(jìn)行電泳，并用考馬斯亮藍(lán)R250染色以檢測(cè)是否有目的蛋白條帶出現(xiàn)。1. 3ffestern-blot 免疫印跡分析1)、電轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌SDS-PAGE蛋白膠兩次；2)、剪取凝膠大小的濾紙2張、硝酸纖維素膜(NC膜)1張，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤(rùn)， 在負(fù)極石墨板上按濾紙、NC膜、凝膠、濾紙順序鋪好，趕走氣泡放上蓋板，20V，350mA轉(zhuǎn)膜 45min ；3)、上述NC膜放入平皿，用TBST洗滌一次，放入新配制的5%脫脂奶粉中37°C封 閉2h ；4)、將ORSV抗血清(Agdia公司，檢測(cè)抗體效價(jià)1 200)用含5%脫脂奶粉的PBS 稀釋100倍后，浸潤(rùn)封閉過(guò)的NC膜，37°C作用Ih ；5)、用TBST洗滌上述浸潤(rùn)后NC膜5次，每次3-5min ；6)、將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG做1000倍稀釋?zhuān)?rùn)上述洗滌后的NC膜，37°C作用 lh；7)、用TBST洗滌上述NC膜6次，每次3-5min ；8)、將上述NC膜浸入顯影液，待出現(xiàn)明顯的條帶或背景時(shí)，用水沖洗終止反應(yīng)。1.4誘導(dǎo)菌中表達(dá)蛋白的富集與純化1)、選取含ORSV-cp基因原核表達(dá)載體的陽(yáng)性重組菌克隆斑，進(jìn)行IPTG大量誘導(dǎo) 表達(dá)；2)、上述誘導(dǎo)菌液離心，用 50mM PBS (配制0· 5M NaH2PO4 19mL，0. 5M Na2HP0481mL, NaCl 29. 3g，加熱溶解后定容到IOOOmL, il pH 8. 0)洗滌一次，棄去上清；3)、上述每克細(xì)菌沉淀物濕重加入5mL緩沖液1 (pH 8. 0的50mMPBS溶解urea 480g，定容到lOOOmL，調(diào)pH 8.0)懸浮細(xì)菌，超聲波破碎(300W，4S，99次)；4)、用清水和20%乙醇清洗Ni-NTAAgarose蛋白純化柱三次；5)、混勻填料上柱(水平裝柱2mL，可純化IOmL左右的細(xì)胞破碎液)，并用2_5個(gè) 柱床體積50mM PBS平衡柱子；6)、將上述步驟3)細(xì)胞破碎超聲液過(guò)上述步驟5)所述鎳柱，反復(fù)過(guò)柱三次；7)、用50mM PBS 2 5個(gè)柱床體積洗滌上述柱子，以除去雜蛋白平衡PH值；8)、再分別用2 5個(gè)柱床體積的含10mM、20mM和50mM咪唑的PBS緩沖液洗滌柱 子，除去雜蛋白；9)、用適量含200mM、300mM和400mM咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，循環(huán)洗滌5次，分 別取少量進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度；10)、柱床上小心覆蓋20%乙醇適量，4°C保存。1.5純化蛋白濃度測(cè)定純化蛋白用Bradford法測(cè)定濃度，如果濃度不高則用超濾管濃縮后再測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
權(quán)利要求
一種齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因ORSVCP，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一種含權(quán)利要求1所述基因的原核重組表達(dá)載體，由SEQ ID NO. 1所示的目的基因 ORSVCP插入原核表達(dá)載體獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述原核表達(dá)載體為pET32c，目的基因 ORSVCP的插入位點(diǎn)位于EcoR I和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
4.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述原核重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
5.構(gòu)建權(quán)利要求2所述原核重組表達(dá)載體的方法，所述方法包括以pET32c為原核表 達(dá)載體，構(gòu)建含有ORSV外殼蛋白基因的原核表達(dá)載體pET32c-0RSV-cp，目的基因ORSVCP的 插入位點(diǎn)位于EcoR I和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)以O(shè)RSV-CP-F和ORSV-CP-R為引物、以感染齒蘭環(huán)斑病毒的蘭花總RNA為模板，經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增獲得ORSV的完整CP基因片段；ORSV-CP-F :5’ -ATCGAATTCAGTCTTACACTATTACTGAC-3‘ORSV-CP-R :5’ -GCCAAGCTTTTAGGAAGAGGTCCAAGT-3’(2)純化后PCR產(chǎn)物和pET32c質(zhì)粒分別用EcoRI/Hind III雙酶切，酶切結(jié)束獲得目 的基因片段和質(zhì)粒DNA片段用試劑盒連接；(3)步驟(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆斑進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽(yáng) 性菌落，即為含有所述原核重組表達(dá)載體的菌落。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(I)PCR反應(yīng)條件如下94°C熱變性 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP)基因、含有該基因的原核重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。所述齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因ORSVCP，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP)基因、含有該基因的原核重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，利用原核表達(dá)病毒外殼蛋白基因的產(chǎn)物作為抗原可以得到特異性強(qiáng)的抗血清，為進(jìn)一步研制ORSV的快速檢測(cè)試劑盒提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101935666SQ20101026664
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者應(yīng)奇才, 徐鶯, 施農(nóng)農(nóng), 楊科府, 王慧中 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)