專利名稱：齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(Odontoglossum ringspot tobamovirus, 0RSV)
產(chǎn)中蔓延最廣的病毒病之一(Korotieieva et al.，2004)，發(fā)病非常普遍且無需專門傳播 媒介，接觸傳染迅速，給花卉生產(chǎn)帶來巨大損失。大面積的田間生產(chǎn)和貿(mào)易中需要方便、快 捷的檢測方法，以及時(shí)阻隔病原物的擴(kuò)散。目前利用分子免疫學(xué)的方法因其具有的快速、特 異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物病毒檢測中。在檢測過程中往往需要制備特異性強(qiáng) 的抗體作為檢測試劑，通常病毒在病組織中含量低，一方面難以獲得大量高純度的病毒，另 一方面利用提純病毒制備的抗血清中常含有寄主蛋白的抗體，易導(dǎo)致假陽性反應(yīng)(鄧叢良 等，2005)。但是可以利用病毒核酸基因在大腸桿菌菌株中大量表達(dá)蛋白，通過蛋白的富集 和純化，可以利用其免疫獲得特異性強(qiáng)的抗血清，達(dá)到上述檢測要求，提高檢測的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白及其制 備和應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白，具有SEQID No. 1所示的 氨基酸序列msytitdpsk laylssawad pnslinlctn slgnqfqtqq art t vqqqf a dvwqpvptltsrfpagagyf rvyrydpild plitflmgtf dtrnriieve npqnptttet ldatrrvdda tvairsainnllnelvrgtg mynqvsfetm sgltwtss。本發(fā)明還涉及制備所述原核表達(dá)蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述原核表 達(dá)蛋白的目的基因ORSV CP插入原核表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到 基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得所述建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白；所述目的基 因ORSV CP具有SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列agtcttacac tattactgac ccgtctaagc tggcttattt aagctcggct tgggctgaccccaattcactaatcaacctt tgtaccaatt ctctgggtaa tcagttccaa acacaacaag ctcgaacaac tgttcaacagcagtttgctg atgtttggca gccggttcct actttgacca gtaggttccc tgcaggcgct ggttacttcagagtttateg ctatgatcct atattagatc ctttaataac tttcttaatg ggtacttttg atactcgtaatagaataatc gaggtagaaa atccgcagaa tccgacaact acggaaacat tagatgcaac tcgtagagttgatgatgcaa ctgtagcaat aagatctgca ataaataatc tattaaatga gttagttagg ggaactggtatgtacaatca agtctcattt gagacgatgt ctggacttac ttggacctct tcctaa ο
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在已知本發(fā)明原核表達(dá)蛋白序列及其編碼序列的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可 以方便的獲得本發(fā)明所述的原核表達(dá)載體并進(jìn)一步獲得本發(fā)明原核表達(dá)蛋白。優(yōu)選的，所 述原核表達(dá)載體為pET32c，目的基因ORSVCP的插入位點(diǎn)位于EcoR I和Hind III兩個(gè)酶切 位點(diǎn)之間。pET32c表達(dá)載體是個(gè)帶有多克隆位點(diǎn)(Polylinker)的載體，多克隆位點(diǎn)的下游 含有組氨酸標(biāo)簽，因此外源基因以融合蛋白的形式表達(dá)，同時(shí)表達(dá)的蛋白N端由載體序列 編碼的6XHis標(biāo)記的蛋白不影響病毒外殼蛋白的免疫原性，由此制備的抗血清特異性也 不受影響。本發(fā)明還涉及所述的原核表達(dá)蛋白作為抗原在制備ORSV抗血清中的應(yīng)用。含目的基因ORSVCP的重組載體在大腸桿菌菌株細(xì)胞中的大量誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行表 達(dá)蛋白的富集，通過Ni-NTA Agarose蛋白純化柱進(jìn)行目的蛋白的純化，通過Bradford進(jìn)行 蛋白濃度測定。同時(shí)對表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離和可溶性檢測，對相應(yīng)大小的目的蛋白 條帶進(jìn)行Western-blotting免疫原性分析，獲得了高純度高濃度可溶性的ORSV外殼蛋白 基因原核表達(dá)蛋白，可直接作為抗原免疫動(dòng)物進(jìn)行抗血清制備，為ORSV檢測提供制備特異 抗體的原料。本發(fā)明利用近年來蘭科病毒核酸基因組信息以及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)成果， 對含ORSV外殼蛋白基因的表達(dá)載體進(jìn)行了 IPTG誘導(dǎo)的原核表達(dá)、蛋白富集和純化，獲 得了約20毫升800yg/mL的ORSV-CP純化蛋白并初步鑒定了表達(dá)蛋白的免疫原性。 Western-blotting和蛋白濃度純度分析表明，表達(dá)產(chǎn)物陽性血清具有免疫反應(yīng)性，純度高 濃度大，可以直接進(jìn)行免疫和抗血清制備，以用以O(shè)RSV的特異檢測。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白(CP) 基因的原核表達(dá)蛋白及其制備和應(yīng)用，利用該原核表達(dá)蛋白作為抗原可以得到特異性強(qiáng)的 抗血清，為進(jìn)一步研制ORSV的快速檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。
圖1為含齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的原核重組表達(dá)載體pET32c-0RSV-cp ；圖2為重組載體pET32c-0RSV-cp的PCR鑒定結(jié)果；1 標(biāo)準(zhǔn)Mark ；2 =ORSV的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.空白對照；圖3為原核表達(dá)的ORSV-CP蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果；1 非預(yù)染Mark ； 2 pET32c-0RSV-cp在大腸桿菌中的表達(dá)蛋白；3 :pET32c在大腸桿菌中表達(dá)的載體蛋白；4 純化的pET32c-0RSV-CP表達(dá)蛋白；圖4為ORSV抗體與原核表達(dá)菌株pET32c-0RSV_cp表達(dá)的CP蛋白的Western blot 檢測結(jié)果1 預(yù)染Mark ；2 純化的ORSV CP融合蛋白；3 :pET32c空載體表達(dá)的載體蛋白。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 重組載體的構(gòu)建1、材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料
蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株采自杭州傳化大地生物技術(shù)有限公司花卉基地，采 集黃化條紋和局部褪綠葉樣，于_75°C低溫冰箱保存。原核表達(dá)載體pET32c與大腸桿菌菌 株BL21(DE3)購自北京英俊公司(Invitrogen，北京)。1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離的ORSV杭州分離物(GenBank登陸號為DQ915440)的CP基 因序列設(shè)計(jì)2條引物。在引物ORSV-CP-F的5’端添加EcoR I酶切位點(diǎn)和起始密碼子， ORSV-CP-R的5’端添力Hind III酶切位點(diǎn)和終止密碼子；所有引物均由上海生工生物技 術(shù)有限公司公司合成，引物序列如下ORSV-CP-F 5' -ATCGAATTCAGTCTTACACTATTACTGAC-3‘ORSV-CP-R 5' -GCCAAGCTTTTAGGAAGAGGTCCAAGT-3’1. 30RSV CP基因片段的PCR擴(kuò)增ORSV CP基因直接以蝴蝶蘭(P. amabilis)感病株總RNA(以Trizol-RNA抽提試劑 盒提取)合成的1st cDNA (上海生工生物工程有限公司)為模板，用PCR方法合成，50 μ L 的PCR反應(yīng)體系包括5 X Primer STAR Buffer (Pakala，大連)5μ LdNTP2mmol/LPrimer (F)50pmol/LPrimer (R)50pmol/LPrimer STAR (Pakala,大連)0. 5 μ L模板1 μ L加去離子水補(bǔ)足50 μ L本申請發(fā)明人在前期工作基礎(chǔ)上已經(jīng)建立了 ORSV的最佳PCR反應(yīng)體系及條件 94°C熱變性 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在紫外燈下觀察目的條帶并拍照。1.4擴(kuò)增產(chǎn)物的純化在紫外燈下小心切下目的條帶，用上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司的DNA回收純 化試劑盒進(jìn)行回收，并取1 μ L純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，粗略定量。1. 5載體DNA和目的基因的酶切、回收將純化的PCR產(chǎn)物和pET32c質(zhì)粒分別用EcoR I、Hind III雙酶切，體系為去 離子水 30 μ L，EcoR II (Pakala，大連)2· 5 μ L，Hind III (Pakala，大連)2· 5 μ L，10 XM buffer (Pakala，大連)5 μ L，質(zhì)粒DNA或目的基因DNA 10 μ L ;37°C酶切6h。酶切結(jié)束后用 DNA純化試劑盒(QIAGEN，上海)回收DNA片段，并用瓊脂糖凝膠電泳粗略定量，估計(jì)兩者濃 貞t匕。1. 6連接反應(yīng)將回收的目的DNA片段(SEQ ID No. 2)與載體DNA按體積比4 1混合后，用連接 試劑盒(Pakala，大連)連接。連接體系為載體DNA 1 μ L、目的基因DNA 4 μ L、Solution I 5 μ L，混勻后16°C連接過夜。1. 7細(xì)菌轉(zhuǎn)化取連接產(chǎn)物與20(^1^感受態(tài)見21混勻，冰浴20min，42°C熱激90s后立即冰浴2min,補(bǔ)加ImL LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。6000rpm離心lmin，棄ImL上清，用剩 余的200 μ L上清懸浮沉淀，涂布含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜至菌 落出現(xiàn)。2.結(jié)果與分析2. 1.原核表達(dá)載體的鑒定用EcoR I, Hind III對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定；同時(shí)用設(shè)計(jì)的特異性引物 ORSV-CP-F、ORSV-CP-R進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。挑取酶切和 PCR鑒定(鑒定結(jié)果見圖2)為陽性的菌落，命名為pET32c-0RSV-cp (圖譜見圖1)，轉(zhuǎn)接于 新的LB液體培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)后送英俊公司測序，測序后在GenBank中進(jìn)行同源性比 對。同源性介于97% 99%，其中與臺灣分離物(AF406775)同源性高達(dá)99%，與煙草花葉 病毒外殼蛋白基因的同源性最低為72%。ORSV曾一度被認(rèn)為是煙草花葉病毒的蘭花株系 (Orchid Rtrain of Tobacco mosaic virus, TMV-0)，但 1991 年日本學(xué)者 IS0MURA 等根據(jù) 核酸序列比較表明ORSV并非TMV-0。本研究中ORSV CP基因與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的TMV CP基因核苷酸及氨基酸序列都存在較大差異。但世界范圍內(nèi)不同地區(qū)ORSVCP核苷酸序列 存在高度的保守性。實(shí)施例2:蛋白的表達(dá)1.方法1.1 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)1)挑取含ORSV外殼蛋白基因重組質(zhì)粒的單個(gè)轉(zhuǎn)化菌，接種于5mL含50 μ g/mL Ampcillin的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩過夜培養(yǎng)；2)取200μ L上述過夜培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接種于20mL含同樣濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0. 4 0. 6 (約4 5小時(shí))；3)上述20mL繼代培養(yǎng)液中加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后 收集誘導(dǎo)菌液。1. 2SDS-PAGE檢測目的蛋白1)取誘導(dǎo)菌液ImL于Eppendorf管中，12000rpm離心lmin，去上清；2)沉淀用0. OlM PBS洗滌后用80 μ LPBS懸浮，超聲波破碎并離心；3)上述上清和沉淀各加入20μ L 5Χ十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)上樣緩沖液(600mM pH 6. 8 Tris-HCl,5% 2-巰基乙醇，5% SDS, 0. 溴酚藍(lán)， 25%甘油)混合；4)上述混合液分別煮沸后離心，取上清，作為SDS-PAGE電泳樣品，用15%的分離 膠進(jìn)行電泳，并用考馬斯亮藍(lán)R250染色以檢測是否有目的蛋白條帶出現(xiàn)。1. 3 Western-blot 免疫印跡分析 1)電轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌SDS-PAGE蛋白膠兩次；2)剪取凝膠大小的濾紙2張、硝酸纖維素膜(NC膜)1張，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤，在負(fù) 極石墨板上按濾紙、NC膜、凝膠、濾紙順序鋪好，趕走氣泡放上蓋板，20V, 350mA轉(zhuǎn)膜45min ；3)上述NC膜放入平皿，用TBST洗滌一次，放入新配制的5%脫脂奶粉中37°C封閉 2h ；4)將ORSV抗血清(Agdia公司，檢測抗體效價(jià)1 200)用含5%脫脂奶粉的PBS稀釋100倍后，浸潤封閉過的NC膜，37°C作用Ih ；5)用TBST洗滌上述浸潤后NC膜5次，每次3-5min ；6)將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG做1000倍稀釋，浸潤上述洗滌后的NC膜，37 V作用 lh；7)用TBST洗滌上述NC膜6次，每次3-5min ；8)將上述NC膜浸入顯影液，待出現(xiàn)明顯的條帶或背景時(shí)，用水沖洗終止反應(yīng)。1.4誘導(dǎo)菌中表達(dá)蛋白的富集與純化1)、選取含ORSV-cp基因原核表達(dá)載體的陽性重組菌克隆斑，進(jìn)行IPTG大量誘導(dǎo) 表達(dá)；2)、上述誘導(dǎo)菌液離心，用 50mM PBS(配制0·5Μ NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29. 3g，加熱溶解后定容到lOOOmL，調(diào)pH 8. 0)洗滌一次，棄去上清；3)、上述每克細(xì)菌沉淀物濕重加入5mL緩沖液1 (pH 8. 0的50mMPBS溶解urea 480g，定容到lOOOmL，調(diào)pH 8.0)懸浮細(xì)菌，超聲波破碎(300W，4S，99次)；4)、用清水和20%乙醇清洗Ni-NTAAgarose蛋白純化柱三次；5)、混勻填料上柱(水平裝柱2mL，可純化IOmL左右的細(xì)胞破碎液)，并用2 5 個(gè)柱床體積50mM PBS平衡柱子；6)、將上述步驟3)細(xì)胞破碎超聲液過上述步驟5)所述鎳柱，反復(fù)過柱三次；7)、用50mM PBS 2 5個(gè)柱床體積洗滌上述柱子，以除去雜蛋白平衡PH值；8)、再分別用2 5個(gè)柱床體積的含10mM、20mM和50mM咪唑的PBS緩沖液洗滌柱 子，除去雜蛋白；9)、用適量含200mM、300mM和400mM咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，循環(huán)洗滌5次，分 別取少量進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度；10)、柱床上小心覆蓋20%乙醇適量，4°C保存。1.5純化蛋白濃度測定純化蛋白用Bradford法測定濃度，如果濃度不高則用超濾管濃縮后再測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
權(quán)利要求
一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白，具有SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。
2.制備如權(quán)利要求1所述原核表達(dá)蛋白的方法，所述方法包括將編碼所述原核表達(dá) 蛋白的目的基因ORSV CP插入原核表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到基 因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得所述建蘭花葉病毒外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白；所述目的基因 ORSV CP具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述原核表達(dá)載體為pET32c，目的基因ORSV CP的插入位點(diǎn)位于EcoR I和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
4.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)蛋白作為抗原在制備ORSV抗血清中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)外殼蛋白基因原核表達(dá)蛋白及其制備和應(yīng)用，所述原核表達(dá)蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。該表達(dá)蛋白可直接作為抗原免疫動(dòng)物進(jìn)行抗血清制備，為ORSV檢測提供制備特異抗體的原料，利用該原核表達(dá)蛋白作為抗原可以得到特異性強(qiáng)的抗血清，為進(jìn)一步研制ORSV的快速檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/40GK101935340SQ20101026664
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者徐鶯, 施農(nóng)農(nóng), 楊科府, 陳瑜 申請人:杭州師范大學(xué)