一種利用RsTyrDC制備紅景天甙的方法

專利名稱：一種利用RsTyrDC制備紅景天甙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用RsTyrDC制備紅景天甙的方法。
背景技術(shù)：
高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名庫頁紅景天，是景天科 (Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola rosea L.)植物，為多年生草本或亞灌木，常具 肉質(zhì)匍匐根狀莖，是長(zhǎng)白山珍稀藥用植物之一。紅景天屬植物的主要活性成分為紅景 天甙(salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明紅景天甙具 有明顯的抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗輻射、抗病毒、延緩機(jī)體衰老等功效，對(duì)于航天、深 海、沙漠、高原、體育等行業(yè)是一種極具開發(fā)應(yīng)用前景的環(huán)境適應(yīng)藥物，同時(shí)對(duì)高輻射從 業(yè)人員、微機(jī)使用頻繁人員、強(qiáng)腦力勞動(dòng)者、中老年人群具有積極的滋補(bǔ)保健作用。紅 景天甙生物合成最后一步反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)清楚，植物體內(nèi)的尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (UDP-glucosyltransferase,UDPGT,UGTs)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇為底物催化 合成紅景天甙。而酪醇酪醇生物合成則有可能來源于兩種不同的途徑一是酪醇可能來源 于P-香豆酸的脫羧反應(yīng)產(chǎn)物，而P-香豆酸來源于苯丙氨酸起始的苯丙烷代謝途徑；另一 種可能是酪醇可能來源于4-羥基苯乙醛，而其來自于酪氨酸脫羧反應(yīng)。有趣的是，苯丙氨 酸和酪氨酸又共同來源于一個(gè)前體化合物阿羅酸。由于酪醇分子屬于典型的簡(jiǎn)單酚類化合 物，植物體內(nèi)的大部分酚類化合物來源于苯丙烷類代謝途徑，苯丙烷類代謝途徑為酪醇的 生物合成提供了碳架結(jié)構(gòu)非常相似的前體化合物來源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用RsTyrDC制備紅景天甙的方法。本發(fā)明提供的一種制備紅景天甙的方法，包括如下步驟1)將RSTYRDC蛋白的編 碼基因?qū)肽康闹参锏耐庵搀w，得到轉(zhuǎn)基因的愈傷組織；2)從所述轉(zhuǎn)基因的愈傷組織中提 取紅景天甙，得到紅景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述序列2由507個(gè)氨基酸殘基組成。所述RSTYRDC蛋白的編碼基因通過重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入目的植物的外植體；所述RSTYRDC蛋白的編碼基因通過重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物的外植體。所述重組根癌農(nóng)桿菌為將所述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入宿主根癌農(nóng)桿菌得到的重 組根癌農(nóng)桿菌；所述重組植物表達(dá)載體為將所述RSTYRDC蛋白的編碼基因插入載體pBRin713的 BgLII和Spe I識(shí)別位點(diǎn)間得到的。將所述RSTYRDC蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏耐庵搀w，得到轉(zhuǎn)基因愈傷組織的 方法包括如下步驟用重組根癌農(nóng)桿菌侵染所述目的植物的外植體，再依次進(jìn)行共培養(yǎng)、抑 菌培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、抗性篩選培養(yǎng)和繼代抗性篩選培養(yǎng)。所述用重組根癌農(nóng)桿菌侵染所述目的植物的外植體的步驟中，所述侵染的時(shí)間為9分鐘。所述外植體為葉盤。從葉片上通過打孔器打下來的小圓片即為葉盤，可用于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染。所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在 所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基 中的濃度為0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度 為 0. 5mg/L ；所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌 呤、1-萘乙酸和頭孢霉素，得到所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在所述抑 菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中 的濃度為0. lmg/L，所述頭孢霉素在所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培 養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為2. 5mg/L, 所述頭孢霉素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在 所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抗性篩選培養(yǎng)的培 養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L， 所述頭孢霉素在所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基的濃度為500mg/L ；每IOOOml所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加 入1.5ml6-芐氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液和0.5ml 2，4-二氯苯氧乙酸丁酯母液 后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述共培養(yǎng)用的培養(yǎng)基；每IOOOml所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Omie-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、5. Oml頭孢霉素母液后，蒸餾水定容至 1000ml，得到所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基；每IOOOml所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Oml 6-芐氨基嘌呤母液、0. Iml 1_萘乙酸母液、0. 25ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素 母液后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基；每IOOOml所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Oml 6-芐氨基嘌呤母液、0. Iml 1-萘乙酸母液、0. 3ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素 母液后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基；所述共培養(yǎng)的時(shí)間為3天，所述共培養(yǎng)的溫度為25°C，所述共培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述抑菌培養(yǎng)的時(shí)間為5天，所述抑菌培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抑菌培養(yǎng)為連續(xù) 光照；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為3周，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為25°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為連續(xù) 光照；
所述抗性篩選培養(yǎng)的時(shí)間為10周，所述抗性篩選培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抗性篩 選培養(yǎng)為連續(xù)光照。所述繼代抗性篩選培養(yǎng)的方法為依次按照如下I和II所示步驟進(jìn)行培養(yǎng)I 在連續(xù)光照、25°C，在如下培養(yǎng)基中繼代3次培養(yǎng)，I所用的培養(yǎng)基按照如下方 法配制向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到I所用的 培養(yǎng)基；所述6-芐氨基嘌呤在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在I所 用的培養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為20mg/L，所述 頭孢霉素在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；II 在連續(xù)光照、25°C，在如下培養(yǎng)基中繼代2次培養(yǎng)，II所用的培養(yǎng)基按照如下 方法配制向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到II所用 的培養(yǎng)基；所述6-芐氨基嘌呤在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L,所述1-萘乙酸在II 所用的培養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L，所 述頭孢霉素在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L。I IOOOml所用培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加入 1.0ml6-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、0. 2ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素母液 后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述的I所用培養(yǎng)基；所述步驟I中，所述繼代3次按照每 10-13天的間隔進(jìn)行繼代；II IOOOml所用培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加入 1. Omie-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、1. Oml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素母液后， 蒸餾水定容至1000ml，得到所述的II所用培養(yǎng)基；所述步驟II中，所述繼代2次按照每15 天的間隔進(jìn)行繼代。所述6-芐氨基嘌呤母液按照如下方法配置稱取50mg6_芐氨基嘌呤用IOmllM的 NaOH水溶液溶解后加水定容到50ml，得到所述6-芐氨基嘌呤母液；所述1-萘乙酸母液按照如下方法配置稱取50mgl_萘乙酸用IOmllM的NaOH水 溶液溶解后加水定容50ml，得到所述1-萘乙酸母液；所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置稱取20mg2，4_ 二氯苯氧乙 酸丁酯用15ml無水乙醇溶解后加水定容20ml，得到所述2，4_ 二氯苯氧乙酸丁酯母液；所述頭孢霉素母液按照如下方法配置稱取IOOOmg頭孢霉素溶解于水中后，加水 定容到10ml，得到所述頭孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置稱取IOOOmg潮霉素溶解于水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液；所述RsTyrDC蛋白的編碼基因?yàn)橄率?)或2)或3)1)序列表中的序列1的自5，末端第69位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列1的自5’末端第63位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中的序列1。上述序列1由1715個(gè)核苷酸組成，其OFR為序列1的自5，末端第69位到第1592 位核苷酸所示的DNA分子。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為景天科植 物，所述景天科植物優(yōu)選為紅景天屬植物，所述紅景天屬植物尤其優(yōu)選為高山紅景天。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將RsTyrDC基因置于植物高效表達(dá)載體pBRin713的35S啟動(dòng) 子+Ω增強(qiáng)子下游，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化高山紅景天，獲得的轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組 織中紅景天甙含量較野生型對(duì)照提高倍4. 3倍。本發(fā)明內(nèi)容為利用高山紅景天轉(zhuǎn)基因愈傷 組織系統(tǒng)過表達(dá)紅景天甙生物合成途徑關(guān)鍵酶一酪氨酸脫羧酶(RsTyrDC)提供了具有創(chuàng) 新性和實(shí)用性的相關(guān)技術(shù)方法及應(yīng)用。


圖1為總RNA的電泳結(jié)果
圖2為RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖3為基因5，RACE結(jié)果
圖4為全長(zhǎng)cDNA的PCR擴(kuò)增
圖5為RsTyrDC蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析
圖6為pBSRsTyrDC表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖
圖7為pBSRsTyrDC表達(dá)載體的BgLII和Spe I雙酶切鑒定
圖8為pBSRsTyrDC表達(dá)載體的PCR鑒定
圖9為潮霉素對(duì)葉片生長(zhǎng)狀態(tài)的影響
圖10為RsTyrDC的高山紅景天遺傳轉(zhuǎn)化過程(農(nóng)桿菌介導(dǎo)法)
圖11為部分轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織的PCR檢測(cè)結(jié)果
圖12為部分轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果
圖13為部分轉(zhuǎn)基因高山紅景天的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖14為轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織紅景天甙含量測(cè)定
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、RsTyrDC基因分離用RACE法(rapid-amplification of cDNA ends)成功地從高山紅景天組織分離 得到1個(gè)新的酪氨酸脫羧酶基因cDNA全序列，命名為RsTyrDC。具體過程如下1、總RNA的提取Trizol法提取高山紅景天愈傷組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。2、高山紅景天酪氨酸羧酶基因(RsTyrDC)3'端的分離以高山紅景天愈傷組織總RNA為模板，以Qt (5，-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTC GAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)為反轉(zhuǎn)錄引物，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書 進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。之后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)合成的 Block T(5，-GAGTTCCAGCACTACCTCGAYGGNRTNGAR-3，)簡(jiǎn)并引物，與設(shè)計(jì)的巢式錨定引物 Q0(5‘ -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3‘)組合進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，獲得一條大小約為770bp特異 條帶(圖2 :M, DL-2000Marker ；1，PCR擴(kuò)增結(jié)果。)，預(yù)期大小與引物設(shè)計(jì)位置距其它相關(guān) TyrDC基因3’端距離相符
將酶切與PCR鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果在NCBI 的GenBank庫中進(jìn)行BLAST P分析后發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果與已注冊(cè)的植物酪氨酸脫羧酶基因3’端 具有一定的同源性(44% -52% )，說明該序列確為高山紅景天酪氨酸脫羧酶基因3’端，而 且是一個(gè)新基因。3、RsTyrDC基因5，端序列的克隆參照Invitrogen 5'RACE試劑盒說明書分離5，端序列。根據(jù)3，RACE獲得的cDNA 序列5’末端設(shè)計(jì)合成3條5’ RACE實(shí)驗(yàn)巢式引物(Tyr5’ -1 :5’ -CGCTAGAGATTGGATTAGG-3’ ； Tyr5' -2 :5，-CACATGAAGCAGCAATCGAG-3，；Tyr5，-3 :5，-CGTTCATGCTGATCGAATCG-3)，經(jīng)套式 PCR擴(kuò)增后，在950bp處出現(xiàn)特異條帶(圖3 :M,DL2000marker ；1，PCR擴(kuò)增結(jié)果。)，該條帶 經(jīng)回收、T載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序、分析測(cè)序結(jié)果后發(fā)現(xiàn)該序列與3’ RACE獲得的cDNA 序列5’末端有一段重復(fù)序列，同時(shí)與其它植物TyrDC同源性較高，說明該序列是該cDNA的 5’端序列。4、RsTyrDC基因全長(zhǎng)cDNA的克隆利用DNAman軟件對(duì)分離的cDNA3’端序列和5’端序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行電子合并， 得到全長(zhǎng)1715bp的序列(序列表的序列1)。在該序列ORF兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物(表1中的 TyrQC5，-l和TyrQC3，_l)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增出大小為1524bp的PCR產(chǎn) 物(圖5所示M，DL2000marker ； 1，擴(kuò)增的RsTyrDC基因全長(zhǎng)cDNA片段)，將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng) 回收、T載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1的第63-1592位核苷 酸序列，將該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為RsTyrDC，該基因的OFR為序列表中序列1的第69-1592 位核苷酸序列，該基因編碼的蛋白命名為RsTyrDC，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列 2。表1 RsTyrDC基因cDNA全長(zhǎng)引物(酶切位點(diǎn)用于植物表達(dá)載體的構(gòu)建) 5、RsTyrDC基因的生物信息學(xué)分析將獲得的基因的全長(zhǎng)cDNA序列通過NCBI的Bankit工具遞交GenBank (序列接收 號(hào)DQ471943)。利用DNAman軟件對(duì)獲得的RsTyrDC基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析(序列 1)。所獲得的RsTyrDCcDNA全長(zhǎng)1715bp，其中包括1524bp完整的開放閱讀框(open reading frame, ORF (序列1自5，末端第69-1592位核苷酸)，推測(cè)編碼508個(gè)氨基酸的多肽，分子 量(MW)為56.88kDa，等電點(diǎn)(pi)值為6. 15 ；同時(shí)含有67bp的5，非轉(zhuǎn)譯區(qū)(5，UTR)和 123bp 3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3’ UTR)以及多聚腺苷酸尾。5’ UTR區(qū)起始密碼子前有1個(gè)終止密碼 子，且與編碼區(qū)讀碼框相吻合，說明實(shí)驗(yàn)所獲得的cDNA是全長(zhǎng)的。
6、RsTyrDC蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析用BLAST 服務(wù)器(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(圖 5)，結(jié)果表明RsTyrDC 508個(gè)氨基酸序列中含有完整的TyrDC特征性結(jié)構(gòu)域。RSTyrDC基因可通過以上方法獲得，也可人工合成。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織人工合成序列表中序列1所示⑶NA。UpBSRsTyrDC表達(dá)載體的構(gòu)建以上述人工合成的CDNA為模板，用引物TyrQC5’ _1和TyrQC3’ _1進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到的PCR產(chǎn)物用BgLII和Spe I酶切后得到的片段，插入到載體pBRin713 (Ma， L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, Χ. B. , Lu, S. Y. , Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li , Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印.26，989-999 ；公眾可從北京農(nóng)學(xué)院獲得。)載體的BgLII 和Spe I識(shí)別位點(diǎn)間，構(gòu)建重組載體，將構(gòu)建好重組載體經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選后進(jìn)行酶切和PCR 鑒定，用BgLII和Spe I雙酶切鑒定，結(jié)果如圖7 (M，DL15000+2000Marker ；1-2,陽性質(zhì) 粒。)所示，從圖中看出，得到約1.5Kb的DNA片段；用RsTyrDC基因特異引物TyrQC3，-1 和35S-UP引物(5，-TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3，)為引物，以重組載體為模板進(jìn)行 PCR, PCR鑒定結(jié)果如圖8(M，DL2000 Marker ；1-8,陽性質(zhì)粒。)所示，得到約1. 6Kb的DNA 片段；將酶切得到約1. 5Kb的DNA片段和PCR得到約1. 6Kb的DNA片段的重組載體命名為 PBSRsTyrDC，其構(gòu)建過程如圖6所示。將植物高效表達(dá)載體pBSRsTyrDC送去測(cè)序，結(jié)果為 該載體為在pBRin713的BgLII和Spe I識(shí)別位點(diǎn)間插入序列1自5，末端第69-1592位核 苷酸(RsTyrDC基因的OFR框)，進(jìn)一步證明該載體構(gòu)建正確。將構(gòu)建好的表達(dá)載體pBSRsTyrDC通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (Ma, L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, Χ. B. , Lu, S. Y. , Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li, Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosy!transferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印.26，989-999 ；公眾可從北京農(nóng)學(xué)院獲得。)中，得到重組 菌，將該重組菌提取質(zhì)粒后經(jīng)過BgLII和Spe I雙酶切鑒定，得到約1. 5Kb的DNA片段的重 組菌為陽性重組菌，命名為EHA105/pBSRsTyrDC。2、轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織的獲得選擇性標(biāo)記抗性篩選是獲得轉(zhuǎn)基因植物材料的關(guān)鍵。如果篩選壓力過高，會(huì)造成 轉(zhuǎn)基因材料生長(zhǎng)狀態(tài)低下甚至死亡；反之則會(huì)出現(xiàn)大量的假陽性材料，為后續(xù)篩選工作增 加難度。本實(shí)驗(yàn)所采用的植物表達(dá)載體中含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hpt可分解培養(yǎng)基中 的潮霉素。不同濃度的潮霉素(Hyg)處理對(duì)高山紅景天葉片外植體的影響見圖9。當(dāng)潮霉 素濃度為Omg/L時(shí)，外植體生長(zhǎng)旺盛；潮霉素濃度為5mg/L時(shí)，外植體生長(zhǎng)減慢，致死率達(dá)到 50. 17% ；潮霉素濃度為10mg/L時(shí)，致死率高達(dá)93. 0% ；潮霉素濃度為15mg/L時(shí)，葉片全部 死亡。從高山紅景天葉片對(duì)潮霉素敏感性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，當(dāng)Hyg濃度達(dá)到10mg/L時(shí)，可完 全抑制從葉片誘導(dǎo)愈傷組織的形成。但如果外植體一開始就經(jīng)歷高壓選擇，可能導(dǎo)致已轉(zhuǎn) 化細(xì)胞的死亡。所以，本實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)基因初期抗生素篩選濃度Hyg為5mg/L。為能獲得陽性轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織，在轉(zhuǎn)基因初期潮霉素濃度為5mg/L獲得大量生長(zhǎng)狀態(tài)良篩選，獲得 理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將上述獲得的EHA105/pBSRsTyrDC接種在固體培養(yǎng)基(YEB)上劃線培養(yǎng)，于27°C 下活化3次，挑取平板上單菌落，接種在50ml YEB液體培養(yǎng)基，于27 °C、120rpm\min，黑 暗下震蕩培養(yǎng)，繼代3次，待EHA105/pBSRsTyrDC的0D_為0. 5時(shí)用于侵染高山紅景天 (Rhodiola sachalinensis A. Bor ；Ma, L. Q. , Liu, B. Y. , Gao, D. Y. , Pang, X. B. , Lu, S. Y., Yu, H. S. , Wang, H. , Yan, F. , Li, Ζ. Q. , Li, Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印· 26，989-999 ；公眾可從北京農(nóng)學(xué)院獲得。) 的葉盤，侵染時(shí)間為9分鐘。將農(nóng)桿菌EHA105/pBSRsTyrDC侵染過的高山紅景天葉盤置于共培養(yǎng)基上(圖IOA 侵染過農(nóng)桿菌的高山紅景天葉盤置于共培養(yǎng)基上)，25°C光照條件下共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)移到 只含有抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)抗生素(頭孢霉素Cef，500mg/L)的抑菌培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行5天的 抑菌培養(yǎng)；將經(jīng)過抑菌培養(yǎng)的外植體接到含有潮霉素Hyg2. 5mg/L、Cef500mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)培 養(yǎng)基上，25°C連續(xù)光照條件下，3周繼代一次，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖IOB轉(zhuǎn)化葉盤在選擇培養(yǎng) 基上產(chǎn)生愈傷)。待誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的愈傷形成后，將一部分愈傷組織接到抗性篩選培養(yǎng)培 養(yǎng)基上，在高濃度潮霉素(30mg/L)條件下進(jìn)行抗性篩選培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織(圖 IOC愈傷置于高選擇壓培養(yǎng)基上)；取在抗性篩選培養(yǎng)培養(yǎng)基上成活的愈傷組織采取逐漸 降低潮霉素濃度的方式依次進(jìn)行I和II所示的繼代抗性篩選培養(yǎng)，具體為在潮霉素20mg/L 培養(yǎng)基上繼代3次后，轉(zhuǎn)入潮霉素10mg/L的培養(yǎng)基上繼代保存培養(yǎng)，形成生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 抗性愈傷組織(圖IOD篩選出的抗性愈傷)，作為轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織進(jìn)行分子 檢測(cè)和指標(biāo)測(cè)定。每IOOOml所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加 入1.5ml6-芐氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液和0.5ml 2，4-二氯苯氧乙酸丁酯母液 后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述共培養(yǎng)用的培養(yǎng)基；每1000ml所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Omie-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、5. Oml頭孢霉素母液后，蒸餾水定容至 1000ml，得到所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基；每1000ml所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Oml 6-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酶母液、0. 25ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素 母液后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基；每1000ml所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中 加入1. Oml 6-芐氨基嘌呤母液、0. Iml 1-萘乙酸母液、0. 3ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素 母液后，蒸餾水定容至1000ml，得到所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基；所述共培養(yǎng)的時(shí)間為3天，所述共培養(yǎng)的溫度為25°C，所述共培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述抑菌培養(yǎng)的時(shí)間為5天，所述抑菌培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抑菌培養(yǎng)為連續(xù) 光照；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為2-3周，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為25°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為連 續(xù)光照；
所述抗性篩選培養(yǎng)的時(shí)間為10周，所述抗性篩選培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抗性篩 選培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述繼代抗性篩選培養(yǎng)的方法為依次按照如下I和II所示步驟進(jìn)行培養(yǎng)I IOOOml所用培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加入 1. Omie-芐氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、0. 2ml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素母液后， 蒸餾水定容至1000ml，得到所述的I所用培養(yǎng)基；培養(yǎng)時(shí)間為40d，繼代3次，25°C，連續(xù)光照。II :1000ml所用培養(yǎng)基按照如下方法配制700mlMS液體培養(yǎng)基中加入1. 0ml6芐 氨基嘌呤母液、0. Imll-萘乙酸母液、1. Oml潮霉素母液、5. Oml頭孢霉素母液后，蒸餾水定 容至1000ml，得到所述的II所用培養(yǎng)基；培養(yǎng)時(shí)間為30d，每15d繼代1次，25°C，連續(xù)光照；所述6-芐氨基嘌呤母液按照如下方法配置稱取50mg6_芐氨基嘌呤用IOmllM的 NaOH水溶液溶解后加水定容到50ml，得到所述6-芐氨基嘌呤母液；所述1-萘乙酸母液按照如下方法配置稱取50mgl_萘乙酸用IOml IM的NaOH水 溶液溶解后加水定容50ml，得到所述1-萘乙酸母液；所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置稱取20mg2，4_ 二氯苯氧乙 酸丁酯用15ml無水乙醇溶解后加水定容20ml，得到所述2，4_ 二氯苯氧乙酸丁酯母液；所述頭孢霉素母液按照如下方法配置稱取IOOOmg頭孢霉素溶解在水中后，加水 定容到10ml，得到所述頭孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置稱取IOOOmg潮霉素溶解在水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液；所述MS培養(yǎng)基的組成及配制方法如下表1為MS培養(yǎng)基母液
直接溶解定容表2為MS培養(yǎng)基配制方法(1000ml) 配制方法大量筒中先放置200ml左右的蒸餾水，將上述母液稱量后加入大量筒 中，再加入400-500ml蒸餾水，加入30克蔗糖溶解后定容到1000ml，倒入三角瓶中。 用PH計(jì)測(cè)PH值到5. 80—5. 85。加入7—7. 5g瓊脂后融化倒瓶滅菌。3、轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織的分子鑒定以上述步驟2中得到轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織(潮霉素陽性愈傷組織)為 材料，提取基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)。為了避免內(nèi)源基因的干擾，PCR引物之一為 目標(biāo)基因的3’引物(TyrQC3’ _1)，另一個(gè)引物為對(duì)應(yīng)于CaMV 35S啟動(dòng)子上游的一段核苷 酸序列(35S-UP，5，-TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3，)，該引物在野生型高山紅景天基因 組上沒有互補(bǔ)序列。圖11為轉(zhuǎn)化RsTyrDC的部分轉(zhuǎn)基因愈傷組織的PCR檢測(cè)結(jié)果(PCK 質(zhì)粒PCARsTyrDC ；RCK 野生型；1_15 部分轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織。)，陽性對(duì)照用 質(zhì)粒pBSRsTyrDC為模板。結(jié)果顯示用引物TyrQC3，_l與35S-UP從轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天 愈傷組織中擴(kuò)增得到的DNA片斷與陽性對(duì)照(PCK)相同，為1. 6Kb左右，陰性對(duì)照(野生型 高山紅景天，RCK)沒有該擴(kuò)增產(chǎn)物。在檢測(cè)的25個(gè)轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織系中 PCR檢測(cè)結(jié)果全部為陽性。說明高濃度潮霉素篩選的效率高?；谵D(zhuǎn)基因材料在一段時(shí)間內(nèi)與農(nóng)桿菌共同生長(zhǎng)，取一部分愈傷組織在誘導(dǎo)、篩 選、繼代5個(gè)月實(shí)驗(yàn)過程中一直添加頭孢霉素(Cef 500mg/L)獲得脫菌轉(zhuǎn)基因愈傷組織，另 一部分在檢測(cè)前4周停止脫菌(停止添加頭孢霉素Cef 500mg/L)獲得停止脫菌轉(zhuǎn)基因愈 傷組織，停止脫菌的材料培養(yǎng)過程中沒有農(nóng)桿菌的再生。提取脫菌轉(zhuǎn)基因愈傷組織、停止 脫菌轉(zhuǎn)基因愈傷組織和野生型愈傷組織的基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。引物為 TyrQC3’-l和35S-UP，陽性對(duì)照用質(zhì)粒pBSRsTyrDC為模板，空白對(duì)照(空白對(duì)照1_實(shí)時(shí)熒 光PCR鑒定時(shí)以無菌水為模板，空白對(duì)照2提取DNA、RNA時(shí)，以無菌水代替研磨后的植物組 織)(以下同)。如圖12 (PCK 質(zhì)粒pCARsTyrDC ；DBTC 脫菌轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組 織，ODBTC 停止脫菌轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織，RCK 野生型愈傷組織，BCKl :2_空白 對(duì)照)所示，脫菌和沒脫菌轉(zhuǎn)基因愈傷與陽性對(duì)照相同，有擴(kuò)增產(chǎn)物生成，都得到近“S”型 曲線，說明RsTyrDC的cDNA確已整合到高山紅景天核基因組DNA中。而野生型愈傷及空白 對(duì)照1，2 —致，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物生成，得到為近水平直線。為了弄清RsTyrDC在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況，進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。提取陽性轉(zhuǎn) RsTyrDC高山紅景天愈傷組織的RNA和野生型愈傷組織的RNA，分別經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到陽性轉(zhuǎn) RsTyrDC高山紅景天愈傷組織cDNA和野生型愈傷組織的cDNA，分別以各自cDNA為模板，引 物為TyrQC3’-l和35S-UP，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。設(shè)陽性質(zhì)粒和野生型及空白對(duì)照1，2，結(jié)果 見圖13 (PCK 陽性質(zhì)粒對(duì)照，TPC 陽性轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織，BCKl :2_空白對(duì) 照，RCK 野生型愈傷)。由圖可以判斷出，陽性轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中得到與陽 性質(zhì)粒對(duì)照一致的結(jié)果，說明在轉(zhuǎn)錄水平中表達(dá)。綜合前述分子檢測(cè)，說明RsTyrDC基因不僅成功整合到高山紅景天基因組DNA中， 而且得到轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。采用同樣的方法將空載體pBRin713轉(zhuǎn)入高山紅景天愈傷組織中，獲得轉(zhuǎn) pBRin713高山紅景天愈傷組織。采用同樣的方法將PCAMBIA1301-RsTyrDC導(dǎo)入高山紅景天中，獲得轉(zhuǎn) pCAMBIA1301-RsTyrDC高山紅景天愈傷組織。pCAMBIAl301-RsTyrDC在(Ge Y, Cheng X，Hopkins A, Wang ZY. Generation of transgenic Lolium temulentum plants by Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation. Plant Cell Rep. 200726(6) :783_789，公眾可從北京農(nóng)學(xué)院獲得。)記載。pCAMBIAl301-RsTyrDC的構(gòu)建方法與pBSRsTyrDC基本相同，為將序列表中序列1 自5，末端第69-1592位核苷酸插入pCAMBIA1301載體的BgLII和Bst EII識(shí)別位點(diǎn)間得 到。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中紅景天甙含量的HPLC測(cè)定將由實(shí)施例2獲得的陽性轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織、野生型對(duì)照(高山紅 景天愈傷組織)、由實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)pBRin713高山紅景天愈傷組織和由實(shí)施例2獲得的 轉(zhuǎn)PCAMBIA1301-RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中的紅景天甙含量進(jìn)行了高效液相色譜測(cè) 定，具體方法如下從由實(shí)施例2的2步驟獲得的陽性轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中提取紅景天 甙，具體提取方法如下將高山紅景天轉(zhuǎn)基因愈傷組織于烘箱中60°C烘至恒重，粉碎后過 80目網(wǎng)篩，精確稱取0. 8g樣品加入甲醇8ml，超生提取30min (超聲功率100w、時(shí)間30min)， 之后于60°C孵育30min，于室溫IlOOOg離心15min，收集上清；沉淀用50%的甲醇水溶液再 提取一次，將上清合并后，過0. 45 μ m濾膜。取過濾后的溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)條件為色譜柱=Hypersyl ODS柱，5mm， 4. 6X 150mm ；流動(dòng)相水-甲醇-乙腈(70 25 5，ν/ν/ν)；流速0. 8ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng) 275nm,帶寬10nm，參比波長(zhǎng)400nm，帶寬80nm ；外標(biāo)法定量。紅景天甙標(biāo)準(zhǔn)品(上海同田生物技術(shù)有限公司，Catalog E_0069)，保留時(shí)間 為5.61min。HPLC檢測(cè)的野生型愈傷組織對(duì)照中的紅景天甙的保留時(shí)間為5.61min，轉(zhuǎn) RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中的紅景天甙的保留時(shí)間為5. 61min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。紅景天甙樣品保留時(shí)間為5. Blmin0結(jié)果如圖14(A 愈傷組織，B 轉(zhuǎn)pBRin713愈 傷C 轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織；)所示，從圖中看出野生型愈傷組織中的紅景天甙 含量為1. 55mg/g干重，轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中的紅景天甙含量為8. 22mg/g干 重，轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈傷組織中的紅景天甙含量比野生型對(duì)照提高4. 3倍，RsTyrDC 的轉(zhuǎn)化明顯提高了紅景天甙的積累水平，具有直接的應(yīng)用價(jià)值。而轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-RsTyrDC 高山紅景天愈傷組織中的紅景天苷含量為3. 77mg/g DW，遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)RsTyrDC高山紅景天愈 傷組織(使用pBRin713載體)。轉(zhuǎn)PBRin713高山紅景天愈傷組織和野生型愈傷組織對(duì)照的結(jié)果無顯著差異。
權(quán)利要求
一種制備紅景天甙的方法，包括如下步驟1)將RSTYRDC蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏耐庵搀w，得到轉(zhuǎn)基因的愈傷組織；2)從所述轉(zhuǎn)基因的愈傷組織中提取紅景天甙，得到紅景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RSTYRDC蛋白的編碼基因通過重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入目的植物的外植體； 所述RSTYRDC蛋白的編碼基因通過重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物的外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重組根癌農(nóng)桿菌為將所述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入宿主根癌農(nóng)桿菌得到的重組根 癌農(nóng)桿菌；所述重組植物表達(dá)載體為將所述RSTYRDC蛋白的編碼基因插入載體pBRin713的多克 隆位點(diǎn)間得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于將所述RSTYRDC蛋白的編碼基 因?qū)肽康闹参锏耐庵搀w，得到轉(zhuǎn)基因愈傷組織的方法包括如下步驟用重組根癌農(nóng)桿菌 侵染所述目的植物的外植體，再依次進(jìn)行共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、抗性篩選培養(yǎng)和繼 代抗性篩選培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述用重組根癌農(nóng)桿菌侵染所 述目的植物的外植體的步驟中，所述侵染的時(shí)間為9分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外植體為葉盤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在 所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基 中的濃度為0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度 為 0. 5mg/L ；所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、 1-萘乙酸和頭孢霉素，得到所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在所述抑菌培 養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃 度為0. lmg/L，所述頭孢霉素在所述抑菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、 1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在所 述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng) 基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為2. 5mg/L，所 述頭孢霉素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、 1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基，所述6-芐氨基嘌呤在所 述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng) 基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L，所 述頭孢霉素在所述抗性篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基的濃度為500mg/L ；所述共培養(yǎng)的時(shí)間為3天，所述共培養(yǎng)的溫度為25°C，所述共培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述抑菌培養(yǎng)的時(shí)間為5天，所述抑菌培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抑菌培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為3周，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為25°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為連續(xù)光照；所述抗性篩選培養(yǎng)的時(shí)間為10周，所述抗性篩選培養(yǎng)的溫度為25°C，所述抗性篩選培 養(yǎng)為連續(xù)光照；所述繼代抗性篩選培養(yǎng)的方法為依次按照如下I和II所示步驟進(jìn)行培養(yǎng)I在連續(xù)光照、25°C，在如下培養(yǎng)基中繼代3次培養(yǎng)，I所用的培養(yǎng)基按照如下方法配 制向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到I所用的培養(yǎng) 基；所述6-芐氨基嘌呤在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L，所述1-萘乙酸在I所用的 培養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為20mg/L，所述頭孢 霉素在I所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L ；II在連續(xù)光照、25°c，在如下培養(yǎng)基中繼代2次培養(yǎng)，II所用的培養(yǎng)基按照如下方法 配制向MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和頭孢霉素，得到II所用的培 養(yǎng)基；所述6-芐氨基嘌呤在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為1. Omg/L,所述1-萘乙酸在II所用 的培養(yǎng)基中的濃度為0. lmg/L，所述潮霉素在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L，所述頭 孢霉素在II所用的培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟I中，所述繼代3次按照每10-13天的間隔進(jìn)行繼代；所述步驟II中，所述繼代2次按照每15天的間隔進(jìn)行繼代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述RsTyrDC蛋白的編碼基因 為下述1)或2)或3)1)序列表中的序列1的自5’末端第69位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中的序列1的自5’末端第63位到第1592位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中的序列1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者 單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為景天科植物，所述景天科植物優(yōu)選為紅景天屬植物，所 述紅景天屬植物尤其優(yōu)選為高山紅景天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用RsTyrDC制備紅景天甙的方法。本發(fā)明提供的制備紅景天甙的方法，包括如下步驟1)將RSTYRDC蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏耐庵搀w，得到轉(zhuǎn)基因的愈傷組織；2)從所述轉(zhuǎn)基因的愈傷組織中提取紅景天甙，得到紅景天甙；所述RSTYRDC蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明內(nèi)容為利用高山紅景天轉(zhuǎn)基因愈傷組織系統(tǒng)過表達(dá)紅景天甙生物合成途徑關(guān)鍵酶—酪氨酸脫羧酶(RSTyrDC)提供了具有創(chuàng)新性和實(shí)用性的相關(guān)技術(shù)方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101928308SQ20101026196
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者于寒松, 師光祿, 張繼星, 王有年, 馬蘭青 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院