專利名稱：重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP1的酵母表達(dá)方法及產(chǎn)物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種重組中華蜜蜂(Apisceranacerana) 蜂王漿主蛋白AccMRJPI的酵母表達(dá)方法及產(chǎn)物用途。
背景技術(shù)：
蜂王漿是由成年工蜂頭部的外分泌腺體分泌的一種化合物，它是蜂群用于哺育 蜂幼蟲的食物的重要組分，是促進(jìn)幼蟲產(chǎn)生級(jí)型分化的最重要的營(yíng)養(yǎng)素。蛋白質(zhì)是蜂 王漿最主要的組分之一，占王漿干重的50%。一般王漿蛋白由水溶性蛋白和非水溶性 蛋白組成，其中水溶性蛋白占總蛋白含量的46%-89%，為王漿蛋白的主要部分，稱 Major Royal Jelly Proteins (MRJPs)。此外，Schmidt等根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)蜂王漿蛋白中 MRJPs 的含量可能達(dá)至IJ 90 % (Schmidt et al，1998，Cell Molecular Life Science.54 (9) 1020-1030)。Drapeau等通過(guò)對(duì)西方蜜蜂基因組研究確定，西方蜜蜂AmMRJPs家族有9 個(gè)成員，即MRJPl MRJP9，其分子量范圍在25 87kDa。其中，分子量為57kDa的 糖蛋白AmMRJPl是最主要的成員，編碼該蛋的基因序列為1299bp，由422個(gè)氨基酸殘 基組成，非糖基化蛋白的理論分子量為47kDa(Drapeau etal，2006.Genome Research. 16 1385-1394)。Tamura等研究發(fā)現(xiàn)，AmMRJPl可形成分子量為290kDa的低聚物復(fù)合體 (Oligomeric complex)，AmMRJPl含48%的必需氨基酸，因而被認(rèn)為是非常重要的功能 性食品成分。此外，AmMRJPlmRNA在新羽化蜂、哺育蜂、采集蜂頭部有不同表達(dá)， 在咽下腺，即大腦蕈體的Kenyan細(xì)胞中表達(dá)，在大腦中發(fā)揮調(diào)控作用，與其行為相關(guān) (Tamura etal, 2009.Protenomics.9 5534-5543)。Simuth等發(fā)現(xiàn)，從天然蜂王漿中分離的AmMRJPl能夠促使小鼠吞噬體釋放 腫瘤細(xì)胞壞死因子 α (Simuth et al, 2004.Joural of Agricultural and Food Chemistry.52 2154-2158) ； Kamakura等發(fā)現(xiàn)，在無(wú)牛血清培養(yǎng)基中添加天然AmMRJPl，能夠 促進(jìn)大鼠細(xì)胞分裂，促進(jìn)DNA合成和白蛋白生成(Kamakura et al, 2002.Journal of Biochemistry. 132 911-912)。Tamura等發(fā)現(xiàn)，天然AmMRJPl低聚物能夠提高和維持人 血淋巴Jurkat細(xì)胞的分裂。因而AmMRJPl被認(rèn)為是一種可替代胎牛血清用于昆蟲、動(dòng) 物、人體細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Tamura etal，2009.Protenomics.9 5534-5543)。MRJPl開發(fā)利用的在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)科研，生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的重要性已 受到國(guó)際上的高度關(guān)注。Judova等首先用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)AmMRJPl基因進(jìn)行了 重組表達(dá)，但是原核表達(dá)的AmMRJPl分子量?jī)H為48kDa，顯然缺乏糖基化修飾，同時(shí) 大部分蛋白以包涵體形式存在，因此缺乏生物學(xué)活性(Judova etal，1998.Boilogia.53 7778-7784)。隨后，Judova等利用煙草進(jìn)行了 AmMRJPl基因重組表達(dá)，但表達(dá)量很低， 且蛋白糖基化修飾程度不一(Judova etal，2004.Biol.Plant.53 7778-7784)。在目前全世界已報(bào)道的9個(gè)蜜蜂屬(Apis)成員中，只有西方蜜蜂(Apis mellifera，其中分布最廣的為意大利蜜蜂A.mellifera mellifera)和東方蜜蜂(A.cenma)得到人工馴化和規(guī)模化人工養(yǎng)殖，并用于蜂蜜生產(chǎn)。相對(duì)于西方蜜蜂來(lái)說(shuō)，東方蜜蜂 (A.cerana),包括我國(guó)特有的亞種中華蜜蜂(A.cerana cerana)因生產(chǎn)性能較低，蜂群數(shù)量 在原產(chǎn)地正處于萎縮狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外研究表明，因中華蜜蜂因長(zhǎng)期適應(yīng)于我國(guó)地理氣候環(huán) 境，具有西方蜜蜂所不具備的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物學(xué)特點(diǎn)也非常不同于 前者，在蜜蜂育種和生態(tài)多樣性保護(hù)等方面具有非常重要的利用價(jià)值(陳盛祿.2001，中 國(guó)蜜蜂學(xué).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社)。東方蜜蜂與西方蜜蜂MRJPl生化特性有一定差別，據(jù)韓 國(guó)Won等報(bào)道，雖然東方蜜蜂與西方蜜蜂MRJPl —級(jí)結(jié)構(gòu)類似，但兩者的MRJPl糖蛋 白分子量明顯不同，東方蜜蜂AcMRJPI為56kD，西方蜜蜂AmMRJPl為59kDa(Won et al.2008.Food Research Internatioanl.41 952-956)。據(jù)我們研究，編碼中華蜜蜂 AccMRJPl 蛋白的cDNA全長(zhǎng)為1302bp，蛋白由433個(gè)氨基酸殘基組成(比西方蜜蜂AmMRJPl成 熟肽多11個(gè)氨基酸殘基)，理論分子量為48.99kDa。AccMRJPl與西方蜜蜂AmMRJPl 蛋白具有90.5%的同源性，其N-端含由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，成熟肽DNA片 段長(zhǎng)1239bp，編碼413個(gè)氨基酸殘基。動(dòng)物細(xì)胞，包括昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和人體細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)是現(xiàn)代生物 技術(shù)的重大發(fā)展方向之一，在如單克隆抗體、組織型纖溶酶原激活因子、紅細(xì)胞生成 素、干擾素等生物制品的生產(chǎn)中已成為起支柱作用的技術(shù)，特別是近幾年一些貴重的生 物制品可來(lái)源于異倍體細(xì)胞、腫瘤組織源的細(xì)胞及重組細(xì)胞。隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)氣 升式反應(yīng)器、中空纖維系統(tǒng)、微載體等工業(yè)化規(guī)模的興起，相應(yīng)地?zé)o血清培養(yǎng)日益受到 關(guān)注，人們正尋求胎牛血清的替代物以降低生產(chǎn)成本。20世紀(jì)50年代初，Eagle發(fā)明了含有氨基酸、維生素、碳水化合物和礦物質(zhì)等
的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。但該培養(yǎng)基仍然需要體液作支持。當(dāng)時(shí)不清楚體液的作用，只知道其為 細(xì)胞生長(zhǎng)所必需。后來(lái)，這種培養(yǎng)基在使用20%的動(dòng)物血清替代體液后，得到了廣泛的 使用，人們隨之了解到，胎牛血清含有最完全的細(xì)胞培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分和因子，增加 牛血清后的培養(yǎng)基具有足夠的生長(zhǎng)因子。目前最常用的是添加10-20%胎牛血清的培養(yǎng)基。目前，牛血清是疫苗和生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)不可或缺的原材料， 但其質(zhì)量的高低嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是外源因子污染的血清對(duì)最終產(chǎn)品的使用者將 造成嚴(yán)重的威脅。我國(guó)的牛血清產(chǎn)品均以宰殺出生后的小牛獲取血清的模式生產(chǎn)，這種 小牛感染BVDV和其他外源病毒的機(jī)率很高。此外，由于不同批次牛血清間的生物活性 和因子的不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性差；制品中殘留的牛血清易引起被接種 者對(duì)血清的過(guò)敏反應(yīng)。雖然目前將一些細(xì)胞的培養(yǎng)設(shè)計(jì)成無(wú)血清的培養(yǎng)體系可避免這些 問(wèn)題，但絕大多數(shù)的培養(yǎng)體系仍在使用添加血清的培養(yǎng)基。據(jù)I"7 年出版的《Medical and healthcare market place guide》估測(cè)，歐美市場(chǎng)每
年用于生物藥物和疫苗生產(chǎn)的胎牛血清為50萬(wàn)升，價(jià)值10億美元，而使用胎牛血清后所 產(chǎn)出的產(chǎn)值為40億美元，可見(jiàn)目前的生物技術(shù)產(chǎn)品和病毒性疫苗的生產(chǎn)大多數(shù)仍依靠細(xì) 胞培養(yǎng)來(lái)表達(dá)產(chǎn)物和擴(kuò)增病毒。雖然近年來(lái)無(wú)血清培養(yǎng)基正在擴(kuò)大使用，并證明是可行 的，但是需要復(fù)雜的設(shè)備，而且僅限于特殊的細(xì)胞類型。盡管人們已認(rèn)識(shí)到無(wú)血清培養(yǎng) 基有許多優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)正常細(xì)胞的目標(biāo)很難達(dá)到，目前僅用于喪失貼 壁功能、具有腫瘤特性的細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。因此，未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)仍不得不采用常規(guī)添加牛血清生產(chǎn)生物制品[董關(guān)木.2007，中國(guó)生物制品學(xué)雜志.20(9) 697-700]。以昆蟲細(xì)胞為例，目前昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)一般是在含有10% 20%的牛血清培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)，由于血清成本高、來(lái)源少，批量間的質(zhì)量不穩(wěn)定、重復(fù)性差，限制了昆蟲細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)的發(fā)展及應(yīng)用，而且血清成份復(fù)雜，是支原體和其它異源病毒污染的重要來(lái) 源，為重組蛋白的下游處理帶來(lái)了困難，發(fā)展無(wú)血清培養(yǎng)基是解決這些困難的關(guān)鍵技術(shù) 之一。而進(jìn)口的無(wú)血清培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，不利于開展細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工作，因此在國(guó)內(nèi) 發(fā)展無(wú)血清培養(yǎng)，尋找使用可替代血清的多肽或蛋白生長(zhǎng)因子具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和理 論意義[張佑紅等，2006.武漢化工學(xué)院學(xué)報(bào).28 (3) 20-24]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清蛋白等的蛋白質(zhì)含有11 種必需氨基酸和7種非必需氨基酸，是目前已知的、具有促細(xì)胞生長(zhǎng)活性的細(xì)胞生長(zhǎng) 因子。如β-乳球蛋白含有兩種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，分子量約4-40kDa，在0.3 0.5% 內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的刺激作用，而當(dāng)其濃度低于0.05%時(shí)不能促進(jìn)細(xì)胞增殖[佘澤華 等.1996，生物工程進(jìn)展.16(1) 45-47]。目前已有很多采用重組基因工程方法表達(dá)人體表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的研究報(bào)道， 但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)利用酵母作為生物反應(yīng)器，通過(guò)基因重組方法生產(chǎn)蜂王漿MRJP1，更未見(jiàn) 用酵母表達(dá)的，經(jīng)糖基化修飾的，具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的中華蜜蜂AccMRJPl。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組中華蜜蜂王漿主蛋白 AccMRJPl的酵母表達(dá)方法及產(chǎn)物用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組中華蜜蜂王漿主蛋白 AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，包括以下步驟(1)選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的酵母菌株作為宿主細(xì)胞；(2)將目標(biāo)基因AccMRJPl進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)基因引入所述宿主細(xì)胞；(4)誘導(dǎo)酵母宿主細(xì)胞中的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)一步地，所述AccMRJPl基因的表達(dá)為分泌型表達(dá)。所述AccMRJPl基因連
接在酵母的信號(hào)肽酶切位點(diǎn)之后。所述步驟(1)中，所述酵母是畢赤酵母或釀酒酵母。 所述步驟⑵中，所述目標(biāo)基因AccMRJPl來(lái)源于中華蜜蜂。所述步驟(3)中，使用載 體pPIC9K將目標(biāo)基因引入所述宿主細(xì)胞。一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)細(xì)胞活性方面的 用途。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明通過(guò)酵母的表達(dá)來(lái)生產(chǎn)中華蜜蜂王漿主蛋白 AccMRJPl的方法，它是利用基因工程手段，從中華蜜蜂腦cDNA文庫(kù)中篩選出含 AccMRJPl基因全長(zhǎng)的克隆，并通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的基因，將該基因優(yōu)化后連接到大 腸桿菌-酵母穿梭載體PPI9K，線性化后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，然后在誘導(dǎo)AccMRJPl表達(dá)的 條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，最終收獲表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)親合層析進(jìn)行純化，可得到與天然蛋白 糖基化程度與生物活性一致的產(chǎn)物。本發(fā)明獲得的重組AccMRJPl可用于傳代和原代昆 蟲、人體和動(dòng)物細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)，排除了血清中眾多不明細(xì)胞因子，如污染外源病
5毒和致病因子的風(fēng)險(xiǎn)，抗原、抗體、激素等干擾，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域 具有廣泛用途。
圖1是以中華蜜蜂腦cDNA文庫(kù)中篩選的，含AccMRJPl全基因序列克隆的質(zhì)粒 cDNA為模板，用引物9k-ecor-6hisek_F和MRJP-NOT-R作PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物瓊脂糖 電泳圖，DNA片段長(zhǎng)度約1300bp。圖2是大重組大腸桿菌一酵母穿梭載體pPIC9K_AccMRJPl圖。圖3是以從不同重組酵母菌株提取的基因組為模板，用AOXl引物作PCR擴(kuò)增 得到的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳鑒定圖，有8個(gè)菌株具有1500bpDNA片段(泳道1-7，9)， 表明得到了 8個(gè)陽(yáng)性克隆(M為DNA標(biāo)準(zhǔn))。圖4中，(a)是對(duì)篩選得到的8個(gè)高表達(dá)重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)小試，誘導(dǎo)表達(dá) 三天后表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖，其中1至8號(hào)(泳道1_8)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中有 3個(gè)轉(zhuǎn)化子具有分子量為58kDa的特異性蛋白條帶(泳道1、2、4，)，陽(yáng)性對(duì)照(轉(zhuǎn)化了 PPIC9K)和陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化pPIC9K)無(wú)這一特異性條帶(泳道M為蛋白標(biāo)準(zhǔn))；(b)是 以6XHis鼠單克隆抗體為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP為二抗，對(duì)重組酵母表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行的 Western blot檢測(cè)結(jié)果圖，圖中顯示58kDa重組表達(dá)蛋白與抗6 XHis鼠單克隆抗體產(chǎn)生了 明顯的免疫反應(yīng)印跡(用箭頭標(biāo)出)。圖5 是采用 AKTA explorer 100 (瑞典 Pharmacia 公司)和 HisTrpFF 親和預(yù)裝
柱層析系統(tǒng)，對(duì)重組酵母表達(dá)產(chǎn)物所作的SDS-PAGE蛋白電泳分析圖，重組酵母表 達(dá)產(chǎn)物可見(jiàn)分子量為58kDa的單一蛋白條帶(泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道1、2為重組 6 X His-AccMRJP 1純化產(chǎn)物，用箭頭標(biāo)出)。圖6中，(a)為天然蜂王漿可溶性蛋白SDS-PAGE電泳分析圖，泳道M為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白；泳道1為王漿可溶性蛋白，該泳道有一條分子量為58kDa的蛋白條帶；(b)是以 自制的GST-AccMRJPl多克隆抗體為一抗，以羊抗兔IgG-HRP為二抗，進(jìn)行的蜂王漿可 溶性蛋白和6 XHis-AccMRJPl純化產(chǎn)物Western blot分析，其中純化的重組表達(dá)產(chǎn)物可見(jiàn) 58kDa的免疫反應(yīng)印跡(用箭頭標(biāo)出)，分子量與天然蜂王漿可溶性蛋白58kDa的條帶一 致(泳道3為王漿可溶性蛋白的免疫印跡，泳道2-4重組6XHis-AccMRJPl純化產(chǎn)物的 免疫印跡)。圖7是用加N-糖基化酶(N-glycosidase F)對(duì)重組6 XHis-AccMRJPl作去糖基 化處理后的SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)圖，結(jié)果顯示處理后的重組6 X His-AccMRJPl分子 量比天然王漿MRJPl和未去糖基化處理的重組6 X His-AccMRJPl分子量減少了(泳道M 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道1為未作去糖基化處理的重組6XHiS-ACCMRJPl，泳道2為經(jīng)去糖基 化處理的處理的重組6 X His-AccMRJPl，泳道4為天然王漿可溶性蛋白)。圖8是用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的Τη-5Β1-4細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)圖。 其中無(wú)血清的培養(yǎng)基中細(xì)胞(d)已大量死亡，添加10%王漿可溶性蛋白AmSPRJ(b)及 20%重組AccMRJPl (c)的培養(yǎng)基中，細(xì)胞成梭型，連接緊密，維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，與 添加10%胎牛血清FBS的培養(yǎng)基上Τη-5Β1-4細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)(a)類似。圖9是對(duì)用不同培養(yǎng)基24小時(shí)(a)和48小時(shí)(b)細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，添加20%重組AccMRJPI的培養(yǎng)基的細(xì)胞存活率與添加10%王漿可溶性蛋白AmSPRJ及10%
胎牛血清FBS的培養(yǎng)基的細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，與無(wú)血清培養(yǎng)基(Sereum-free)中的存 活率存在顯著差異。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種用酵母工程細(xì)胞進(jìn)行AccMRJPl表達(dá)的方法，包括在誘導(dǎo) AccMRJPI基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有AccMRJPl基因的酵母細(xì)胞，并收獲表達(dá)產(chǎn)物。更具體地，本發(fā)明采用酵母細(xì)胞表達(dá)AccMRJPl的方法，包括以下步驟1、選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的酵母菌株作為宿主細(xì)胞；2、將編碼AccMRJPl成熟肽的目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3、將PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)基因連接到酵母表達(dá)載體，引入所述宿主細(xì)胞；4、誘導(dǎo)酵母宿主細(xì)胞中的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)。在將目標(biāo)基因引入宿主細(xì)胞時(shí)，為了提高成功引入的可能性，可以借助適當(dāng)?shù)?表達(dá)載體，優(yōu)選能使目標(biāo)基因在酵母細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)的那些載體。為此，需要在將 目標(biāo)基因引入宿主細(xì)胞之前，構(gòu)建目標(biāo)基因與表達(dá)載體的重組子。從提高表達(dá)能力，即 生產(chǎn)能力的方面考慮，可以使所述重組子包含盡可能多拷貝的目標(biāo)基因。為了保證表達(dá)產(chǎn)物的活性，可以將目標(biāo)基因連接在酵母的信號(hào)肽酶切位點(diǎn)之 后。從而使得表達(dá)產(chǎn)物能被準(zhǔn)確酶切，得到與天然產(chǎn)物更為接近或完全相同活性的產(chǎn) 物。為了明確指示目標(biāo)基因已成功引入宿主細(xì)胞，可以使所述重組子中的目標(biāo)基因 與報(bào)道基因相連。常用的報(bào)告基因如抗藥性基因(如氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性 基因)，螢光素酶基因等。本發(fā)明用于進(jìn)行表達(dá)的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選糖酵母屬(Saccharo ces)和畢 赤酵母屬(Picha)的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于通過(guò)酵母表達(dá)生產(chǎn)AccMRJPl的表達(dá)系統(tǒng)，它包括AccMRJI 基因，以及適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。在所述表達(dá)系統(tǒng)中，所述啟動(dòng)子可以選自 T3/T7啟動(dòng)子，PHOI啟動(dòng)子/AOXI啟動(dòng)子中的一種或多種。所述表達(dá)系統(tǒng)還可包含信 號(hào)肽序列，以達(dá)到分泌表達(dá)的目的。該信號(hào)肽序列可與目標(biāo)基因直接相連，也可通過(guò)本 領(lǐng)域常用的其它接頭序列相連。所述表達(dá)系統(tǒng)可以是一種質(zhì)粒，優(yōu)選pPIC9K載體。本發(fā)明還包括用這種方法得到的AccMRJPl產(chǎn)物，用AccMRJPl作為生長(zhǎng)因子培 養(yǎng)昆蟲、動(dòng)物、人體細(xì)胞的方法。本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，下列具體實(shí)施例應(yīng)理解為僅舉例說(shuō)明， 而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例i AccMRJI基因的克隆材料所有引物由上海生工公司合成上游弓I物例 19k-ecor-6hisek-F:5 ‘ -A |GAATTC|
CATCATCATCATCATCAT GATGACGACGACAAGA GCATTCTTCGAGGA-3,(序列 如SEQIDNO.lK*)，其中帶下劃線的序列為編碼6個(gè)組氨酸(6XHis)，便于表達(dá)產(chǎn)物親合分離；帶框的序列為酶切位點(diǎn)EcoR I，斜體為凝血酶酶切位點(diǎn)，便于從表達(dá)產(chǎn)物中 切掉6個(gè)組氨酸；酶切位點(diǎn)前的A為保護(hù)堿基，其余為AccMRJPl成熟肽5 ‘端的編碼 序列。下游弓I 物例 IMRJP-NOT-R 5，-CCG 1GCGGCCG0
TTACAGATGTATTGAAATTTTG-3，(序列如SEQ ID N0.2所示)。其中帶框的序列為 酶切位點(diǎn)NotI，酶切位點(diǎn)前的CCG為保護(hù)堿基，其余為3’端的互補(bǔ)序列。a-factor 引物為 5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3 ‘(序列如 SEQ ID N0.3 所示)，根據(jù)pPIC9K的5'端a-factor設(shè)計(jì)。上游引物例25，AOXl 5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(序列如 SEQ
IDN0.4所示)，根據(jù)載體pPIC9K的5’ -啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)，用于重組酵母載體的PCR檢 測(cè)。下游引物例2AOX1 5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3‘(序列如 SEQID N0.5所示)，根據(jù)載體pPIC9K的3’ -啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)，用于重組酵母的PCR檢測(cè)。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TGl、DH5 α由本實(shí)驗(yàn)室保存；畢徹酵母(Pichiapastoris)菌株 GSll5 購(gòu)自 Invitrogen 公司；載體pPIC9K 購(gòu)自 Invitrogen 公司。制備方法表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)大腸桿菌一酵母穿梭載體pPIC9K作為表達(dá)載體。該載體中包含大腸桿菌的 復(fù)制信號(hào)，Amp(氨芐青霉素)和Kana(卡那霉素)抗性基因，AOXl啟動(dòng)子，a因子信 號(hào)肽序列，增強(qiáng)子序列等。目的基因的獲取與優(yōu)化從中華蜜蜂腦cDNA文庫(kù)中篩選的，經(jīng)DNA測(cè)序的證實(shí)含AccMRJPl基因序 列全長(zhǎng)的質(zhì)粒pBluescript II XR plasmid為模板，采用TAKARA公司的ExTaq酶，弓I 物 9k-ecor-6hisek_F 和 MRJP-N0T-R，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5°C Imin 變性， 57°C Imin退火，72°C Imin延伸，共30個(gè)循環(huán)，72°C保溫lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電 泳分析，得到長(zhǎng)度約1300bp的DNA片段AccMRJPl (圖1)。將割膠回收的目的片段PCR產(chǎn)物AccMRJP 1和酵母表達(dá)載體pPIC9K分別用 EcoR I和Notl雙酶切，酶切產(chǎn)物再分別作電泳檢測(cè)和割膠回收，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，接種于加卡那霉素(Kana)的培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落，分 別培養(yǎng)和提取質(zhì)粒。以所提取的質(zhì)粒為模板，用引物9k-ecor-6hisek-F和MRJP-NOT-R 進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，EcoR I和Notl雙酶切檢測(cè)，將瓊脂糖凝膠電泳分析具有長(zhǎng)度 約1300bp目的條帶的克隆，即為陽(yáng)性篩選克隆。用AOXl引物，進(jìn)行DNA測(cè)序，得 到如下長(zhǎng)度為1554bp的序列(序列如SEQ ID N0.6所示)，其結(jié)構(gòu)為α -factor-EcoR 1-6 XHis-ek-AccMRJPl-TAA,其中 5，端為長(zhǎng) 272bp 的 α -信號(hào)肽，AccMRJPl 成熟肽 基因全長(zhǎng)為1242bp，該序列與預(yù)期目的基因一致。該結(jié)果證明，預(yù)期重組大腸桿菌-酵 母穿梭載體pPIC9K_AccMRJPl構(gòu)建成功(圖2)。根據(jù)AccMRJPl成熟肽基因序列推斷的氨基酸序列有413個(gè)殘基，其序列如SEQID N0.7 所示。實(shí)施例2高表達(dá)酵母重組子構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞的制備①GS115菌株劃線培養(yǎng)在YPD固體培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基配方蛋白胨 20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，加入去離子水IOOOmL。YPD固體培養(yǎng)基YPD液 體培養(yǎng)基+1.5瓊脂粉)上，37°C培養(yǎng)1 2天，挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD 培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，30°C、250_300min培養(yǎng)過(guò)夜。②次日取100- 500 μ 1的培 養(yǎng)物接種至含有500mL新鮮YPD培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28 30°C、250_300rpm培養(yǎng) 過(guò)夜，至OD6tltl值達(dá)到1.3 1.5。③將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C、1500g離心5min，用500mL 的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；④按步驟3離心，用250mL的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌 體沉淀重懸。⑤按步驟3離心，用ImL的冰預(yù)冷的IM的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸， 其終體積約為1.5mL。制備好的感受態(tài)細(xì)胞始終置于冰上，當(dāng)天使用。重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC 9K/AccMRJP線性化將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒AccMRJP-pPIC9K用Sac I內(nèi)切酶單酶切(酶切體系 為(線性化反應(yīng)體系為70uL體系，具體為ddH20 52 μ L、IOXH緩沖液7 μ L、PPIC 9Κ/AccMRJP 1質(zhì)粒10 μ L、Sac I 1 μ L)，充分混勻后37°C酶切過(guò)夜，然后取3 μ L酶切 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否完全線性化。酶切完全后，將混合物12000rpm離 心5min，上清加入1/10量的3M NaAC(pH 5.2)和2.5倍量的冷無(wú)水乙醇，-20°C放置 60min。之后12000rpm離心5min，回收沉淀。用70%的冷乙醇清洗沉淀2次，置超凈 臺(tái)內(nèi)微風(fēng)干燥后，用30 μ L雙蒸水溶解。電擊轉(zhuǎn)化①取200ul GSl 15酵母感受態(tài)細(xì)胞與30 μ L經(jīng)線性化的pPIC9K/AccMRJP 1質(zhì)粒 混合，在冰上放置30min，轉(zhuǎn)置于電穿孔轉(zhuǎn)化杯中(石英電轉(zhuǎn)化杯預(yù)先用70%乙醇清洗 浸泡半個(gè)小時(shí)后，紫外燈下照射半個(gè)小時(shí))。②將轉(zhuǎn)化杯外壁水分擦干。放到電轉(zhuǎn)化槽 中。電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件電壓為1680V;③電擊后，將電擊轉(zhuǎn)化杯迅速放在冰上，加 入ImL IM山梨醇，30°C培養(yǎng)箱放置4小時(shí)后，涂MD平板[1.4% YNB (酵母基礎(chǔ)氮源培 養(yǎng)基)、4X10_5生物素、2%葡萄糖、1.5%瓊脂、100mg/mL)，將涂好的平板置于30°C 正面放置至表面半干，然后倒置培養(yǎng)，3 5天后觀察轉(zhuǎn)化子情況；④篩選白色菌落， 接種到5mLYPD液體培養(yǎng)基(蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，加去離子水 IOOOmL)中，30°C、200-250rpm培養(yǎng)過(guò)夜；⑤吸取1.5mL YPD培養(yǎng)液，提取酵母基因 組，進(jìn)行PCR鑒定。取菌液1.5mL，提取酵母基因組作為模板，用AOXl引物進(jìn)行PCR 鑒定，具有1500bpDNA片段的克隆為陽(yáng)性克隆，結(jié)果得到8個(gè)陽(yáng)性克隆(圖3)。G418抗生素高表達(dá)重組酵母篩選將G418試劑(加量5mg/LYPD)加入到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中，配出5個(gè)梯度的濃 度Omg/mL，0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL 的 YPD 平板，用滅菌牙簽挑取 MD平板[1.34% YNB(酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基)、4X10_5生物素、1.5%瓊脂]上的菌株， 一對(duì)一點(diǎn)到G418濃度Omg/mL的YPD平板上培養(yǎng)3天，之后將G418濃度Omg/mL 的YPD上的菌種再一對(duì)一分別點(diǎn)到G418濃度0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和4mg/ mL的YPD平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)4-5天，5天后，挑選能在G418濃度2mg/mL和4mg/mLYPD平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌株，將這些菌再一對(duì)一點(diǎn)到MM平板(1.34% YNB> 4X IO"5生物 素、2%甲醇、1.5%瓊脂)上培養(yǎng)3天。將MM平板上的單克隆分別接種到3mL YPD培 養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24小時(shí)后提取酵母基因組DNA，以a-factor和3’ -AOXl為引物，
PCR鑒定酵母轉(zhuǎn)化子。 誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析挑選單菌落，置于裝有25mL BMGY培養(yǎng)基[生長(zhǎng)培養(yǎng)基IOg酵母提取物， 20g蛋白胨溶700mL蒸餾水中，高壓滅菌20min，冷卻至50°C左右，加入IOOmL IOOmM/ L磷酸鉀緩沖液，IOOmL 10XYNB[10XYNB配方34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無(wú)硫酸 銨)，IOOg硫酸餒，溶于IL水中，過(guò)濾除菌]，2mL0.02%生物素，20mL 10%甘油。添 加0.3mg/mL氨芐青霉素和0.1mg/mL卡那霉素]的250mL搖瓶中，于30°C，300min培 養(yǎng)至OD6tltl = 6; 1500g離心5min，收集菌體，用BMMY[誘導(dǎo)培養(yǎng)基[IOg酵母提取物， 20g蛋白胨溶700mL蒸餾水中，高壓滅菌20min，冷卻50°C左右，加入IOOmL 100mM/L 磷酸鉀緩沖液，IOOmL 10XYNB，2mL 0.02%生物素，IOOmL 5%甲醇，添加0.3mg/mL 氨芐青霉素和O.lmg/mL卡那霉素]重懸菌體(約10 20mL)，置于IOOmL的搖瓶中， 30°C、300rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；每12h添加100%甲醇至終濃度1.0%，培養(yǎng)72h后離 心，用SDS-PAGE檢測(cè)甲醇誘導(dǎo)O、24、48、72h重組蛋白的表達(dá)效果。以GS115/pPI9K 為分泌表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照，以GS115宿主菌為空白對(duì)照。取500 μ L發(fā)酵液，離心取40 μ L上清，加入10 μ L 5Χ上樣緩沖液，混勻，煮 沸5分鐘，12000rpm離心5min，取20 μ L上清進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳分析。挑 選8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小試誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)三天的結(jié)果SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，其中1 至8號(hào)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中，有3個(gè)轉(zhuǎn)化子具有分子量為58kDa的特異性蛋白條帶，陽(yáng)性對(duì)照 (轉(zhuǎn)化了 pPIC9k)和陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化pPIC9k)無(wú)這一特異性條帶(圖4A)。表達(dá)產(chǎn)物Western Blot檢測(cè)將SDS-PAGE蛋白電泳膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以6XHis鼠單 克隆抗體為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的58kDa 特異性蛋白與抗6XHis鼠單克隆抗體His抗體發(fā)生了很強(qiáng)的免疫反應(yīng)印跡(圖4B)。實(shí)施例3重組表達(dá)AccMRJPI的分離鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分離純化與鑒定利用全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。根據(jù)需要進(jìn)行培養(yǎng)基成分添加，待甘油耗盡后 (OD600 = 1-10),進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，發(fā)酵溫度30°C。在誘導(dǎo)階段，將pH控制在3.5-7.5 的范圍內(nèi)，溶氧量控制在10-30的范圍內(nèi)。整個(gè)發(fā)酵時(shí)間視工程菌生長(zhǎng)情況確定。發(fā) 酵液預(yù)處理，先進(jìn)行4000g離心20min，上清用0.45 μ m膜超濾，純化采用的層析系統(tǒng)為 AKTA explorer 100 (瑞典Pharmacia公司)禾Π HisTrp FF親和預(yù)裝柱。用5倍柱床體積的 結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉、0.5MNaCl、20_40mM、pH 7.4)平衡柱子，將樣品注射到預(yù) 裝柱，用5-10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗柱子，結(jié)合目的蛋白；然后用5-10個(gè)柱體積的 洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉、0.5MNaCl、500mM、pH 7.4)；當(dāng)監(jiān)控視屏中出峰時(shí)，收集 洗脫液，即為N端帶6個(gè)組氨酸的重組AccMRJPl，凍干后_20°C冷凍保存。純化表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)對(duì)重組AccMRJPl洗脫液作SDS-PAGE蛋白電泳分析，可見(jiàn)分子量為58kDa的單一蛋白條帶(圖5)，以天然意大利蜜蜂(Apis mellifera mellifera)蜂王漿可溶性蛋白為 對(duì)照，王漿可溶性蛋白也可見(jiàn)58kDa的條帶(圖6A)。將SDS-PAGE蛋白電泳膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以自制的 GST-AccMRJPl多克隆抗體為一抗，以羊抗兔IgG-HRP為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)， 可見(jiàn)58kDa的免疫反應(yīng)印跡，與蜂王漿可溶性蛋白58kDa的條帶一致(圖6B)。去糖基化及N-端氨基酸分析取純化的重組AccMRJP 1凍干粉于eppendorf管，置100°C處理1 Omin，然后 加N-糖基化酶(N-glycosidase F，1000U,美國(guó)NEB公司)及緩沖液，在37 V保溫 1小時(shí)。同時(shí)以未作處理的重組AccMRJPI為對(duì)照。處理完畢，進(jìn)行SDS-PAGE蛋 白電泳分析，可見(jiàn)AccMRJPl蛋白條帶分子量變小到48kDa左右，明顯小于對(duì)照(圖 7)。將此SDS-PAGE蛋白電泳膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，一半樣品用 GST-AccMRJPl多克隆抗體進(jìn)行Western Blot顯色，另一半切根據(jù)顯色條帶的位置，從硝 酸纖維膜切下，送生物科技有限公司用Edman degration測(cè)序儀進(jìn)行N_末端5個(gè)氨基酸序 列分析，經(jīng)與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照，確定序列為N-S-I-L-R-G，與根據(jù)AccMRJPl成熟 肽基因推測(cè)的氨基酸序列的N-末端5個(gè)氨基酸完全一致。從純化工藝上來(lái)看，畢赤酵母的表達(dá)上清中雜蛋白含量很低，減低了純化難 度，降低了純化成本；從表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)上來(lái)看，把酵母的信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)直接設(shè)計(jì) 在成熟肽的前面，試驗(yàn)證明酵母細(xì)胞能準(zhǔn)確識(shí)別該位點(diǎn)，所以能得到結(jié)構(gòu)和天然蛋 白糖基化程度完全一致的產(chǎn)物；另一方面，酵母分泌的AccMRJPl，其活性接近天然蛋 白，完全消除了大腸桿菌包涵體產(chǎn)物過(guò)高，缺乏后加工機(jī)能的缺陷，并且酵母發(fā)酵生產(chǎn) 成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)施例4重組表達(dá)AccMRJPl對(duì)昆蟲細(xì)胞的活性檢測(cè)取12個(gè)35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，分別加入2mL含胎牛血清的培養(yǎng)基，接種IXlO5 昆蟲細(xì)胞(粉紋野蛾Trichoplusia ni) Τη_5Β1_4 (美國(guó)GIBCO BRL公司，為重組昆蟲桿狀 病毒的宿主細(xì)胞，廣泛用于真核基因重組表達(dá))單層細(xì)胞，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分 散均勻，28°C培養(yǎng)2天至細(xì)胞均勻貼壁。用無(wú)血清的TNM-FH培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公 司)輕輕洗滌細(xì)胞2次；將培養(yǎng)皿分為4組，每組3個(gè)，①加10%的牛血清TNM-FH 培養(yǎng)基(陽(yáng)性對(duì)照)；②加10%天然蜂王漿可溶性蛋白(AmSPRJ)，將凍干粉溶解于無(wú) 菌水，用Bradford法蛋白定量試劑盒測(cè)定溶液蛋白濃度，將原液濃度控制在80 μ g/mL) 的TNM-FH培養(yǎng)基；③加20% AccMRJPl表達(dá)產(chǎn)物(將原液濃度控制在40 μ g/mL)的 TNM-FH培養(yǎng)基；④無(wú)牛血清TNM-FH培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)。隨后繼續(xù)培養(yǎng)，在24、 48h后后，倒置顯微鏡觀察拍照觀察細(xì)胞形態(tài)。具體是在200倍鏡下，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿中心 拍照一張，即每組拍3張照。將照片置電腦視屏上進(jìn)行活細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)(梭形和多角形 為活細(xì)胞，球形和飄浮細(xì)胞為死細(xì)胞)計(jì)數(shù)，最后用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行細(xì)胞存活率[存 活率(％ )=活細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)X 100% )DunCan新復(fù)極差分析(p《0.05為差異顯著)]。24h和48h觀察結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的Τη_5Β1_4細(xì)胞狀態(tài)已出現(xiàn)很大 變化。無(wú)血清的培養(yǎng)基中細(xì)胞已大量死亡，添加10% AmSPRJ及20% AccMRJPl的培 養(yǎng)基中，細(xì)胞成梭型，連接緊密，維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，與添加10% FBS的培養(yǎng)基上 Τη-5Β1-4細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)類似(圖8)。
對(duì)24h和48h細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖9)顯示，添加20% AccMRJP 1的培養(yǎng)基
的細(xì)胞存活率與添加10% AmSPRJ及10% FBS的培養(yǎng)基的細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，與無(wú) 血清培養(yǎng)基中的存活率存在顯著差異。該結(jié)果顯示，酵母表達(dá)的重組AccMRJPl具有作 為細(xì)胞生長(zhǎng)因子替代胎牛血清的前景。
權(quán)利要求
1.一種重組中華蜜蜂(Apis cerana cerana)王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的酵母菌株作為宿主細(xì)胞。(2)將目標(biāo)基因AccMRJPl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)將PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)基因引入所述宿主細(xì)胞。(4)誘導(dǎo)酵母宿主細(xì)胞中的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征 在于，所述AccMRJPl基因的表達(dá)為分泌型表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征 在于，所述AccMRJPl基因連接在酵母的信號(hào)肽酶切位點(diǎn)之后。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征 在于，所述步驟(1)中，所述酵母是畢赤酵母或釀酒酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征 在于，所述步驟(2)中，所述目標(biāo)基因AccMRJPl來(lái)源于中華蜜蜂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl的酵母表達(dá)方法，其特征 在于，所述步驟(3)中，使用載體pPIC9K將目標(biāo)基因引入所述宿主細(xì)胞。
7.一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJPl作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)細(xì)胞活性方面的用
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP1的酵母表達(dá)方法及產(chǎn)物用途，該方法是利用基因工程手段，從中華蜜蜂腦cDNA文庫(kù)中篩選出含AccMRJP1基因全長(zhǎng)的克隆，并通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的基因，將該基因優(yōu)化后連接到大腸桿菌-酵母穿梭載體pPIC9K，線性化后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，然后在誘導(dǎo)AccMRJP1表達(dá)的條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，最終收獲表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)親合層析進(jìn)行純化，可得到與天然蛋白糖基化程度和生物活性一致的產(chǎn)物。本發(fā)明獲得的重組AccMRJP1可用于傳代和原代昆蟲、人體和動(dòng)物細(xì)胞的體外無(wú)血清培養(yǎng)，排除了血清中眾多不明細(xì)胞因子，如污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險(xiǎn)，抗原、抗體、激素等干擾，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的用途。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102010867SQ20101025616
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者張偉光, 張瑮文, 沈立榮, 莫寅元, 袁鵬, 賴超強(qiáng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)