專利名稱：用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白工程與細胞工程領(lǐng)域，尤其涉及一種利用西方蜜蜂(Apis mellifera)，尤其是意大利蜜蜂(Apis mellifera mellifer)王漿制備的功能蛋白RJCPs 的方法，本發(fā)明還涉及該蛋白應(yīng)用于動物細胞培養(yǎng)的具體方法。
背景技術(shù)：
動物細胞，包括昆蟲細胞、哺乳動物細胞和人體細胞的大規(guī)模培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技 術(shù)的重大發(fā)展方向之一，在如單克隆抗體、組織型纖溶酶原激活因子、紅細胞生成素、干擾 素等生物制品的生產(chǎn)中已成為起支柱作用的技術(shù)，特別是近幾年一些貴重的生物制品可來 源于異倍體細胞、腫瘤組織源的細胞及重組細胞。隨著動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)氣升式反應(yīng)器、中 空纖維系統(tǒng)、微載體等工業(yè)化規(guī)模的興起，相應(yīng)地?zé)o血清培養(yǎng)日益受到關(guān)注，人們正尋求胎 牛血清的替代物以降低生產(chǎn)成本。20世紀50年代初，Eagle發(fā)明了含有氨基酸、維生素、碳水化合物和礦物質(zhì)等的基 礎(chǔ)培養(yǎng)基。但該培養(yǎng)基仍然需要體液作支持。當(dāng)時不清楚體液的作用，只知道其為細胞生 長所必需。后來，這種培養(yǎng)基在使用20%的動物血清替代體液后，得到了廣泛的使用，人們 隨之了解到，胎牛血清含有最完全的細胞培養(yǎng)所需的營養(yǎng)成分和因子，增加牛血清后的培 養(yǎng)基具有足夠的生長因子。目前最常用的是添加10-20%胎牛血清的培養(yǎng)基。目前，牛血清是疫苗和生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細胞培養(yǎng)不可或缺的原材料，但 其質(zhì)量的高低嚴重影響產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是受外源因子污染的血清對最終產(chǎn)品的使用者將造 成嚴重威脅。我國的牛血清產(chǎn)品均以宰殺出生后的小牛獲取血清的模式生產(chǎn)，這種小牛感 染BVDV和其他外源病毒的機率很高。此外，由于不同批次牛血清間的生物活性和因子的不 一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實驗結(jié)果的重現(xiàn)性差；制品中殘留的牛血清易引起被接種者對血清的過 敏反應(yīng)。雖然目前將一些細胞的培養(yǎng)設(shè)計成無血清的培養(yǎng)體系可避免這些問題，但絕大多 數(shù)的培養(yǎng)體系仍在使用添加血清的培養(yǎng)基。ig 1997 $出片反的〈〈Medical and healthcare market place guideH^IlJ, H^^rU 場每年用于生物藥物和疫苗生產(chǎn)的胎牛血清為50萬升，價值10億美元，而使用胎牛血清后 所產(chǎn)出的產(chǎn)值為40億美元，可見目前生物技術(shù)產(chǎn)品和病毒性疫苗的生產(chǎn)大多數(shù)仍依靠細 胞培養(yǎng)來表達產(chǎn)物和擴增病毒。雖然近年來無血清培養(yǎng)基正在擴大使用，并證明是可行的， 但是需要復(fù)雜的設(shè)備，而且僅限于特殊的細胞類型。盡管人們已認識到無血清培養(yǎng)基有許 多優(yōu)點，但應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)正常細胞的目標(biāo)很難達到，目前僅用于喪失貼壁功能、具 有腫瘤特性的細胞的懸浮培養(yǎng)。因此，未來一段時間內(nèi)仍不得不采用常規(guī)添加牛血清生產(chǎn) 生物制品。以昆蟲細胞為例，目前昆蟲細胞培養(yǎng)一般是在含有10% 20%的牛血清培養(yǎng)基 中生長，由于血清成本高、來源少，批量間的質(zhì)量不穩(wěn)定、重復(fù)性差，限制了昆蟲細胞大規(guī)模 培養(yǎng)的發(fā)展及應(yīng)用，而且血清成份復(fù)雜，是支原體和其它異源病毒污染的重要來源，為重組 蛋白的下游處理帶來了困難，發(fā)展無血清培養(yǎng)基是解決這些困難的關(guān)鍵技術(shù)之一。而進口的無血清培養(yǎng)基價格昂貴，不利于開展細胞大規(guī)模培養(yǎng)工作，因此在國內(nèi)發(fā)展無血清培養(yǎng)， 尋找使用可替代血清的多肽或蛋白生長因子具有重要的經(jīng)濟意義和理論意義。據(jù)文獻報道，含有乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清蛋白等的蛋白質(zhì)含有11種 必需氨基酸和7種非必需氨基酸，是目前已知的、具有促細胞生長活性的細胞生長因子。如 β -乳球蛋白含有兩種促細胞生長因子，分子量約4-40kDa，在0. 3% -0. 5%內(nèi)對細胞生長 有明顯的刺激作用，而當(dāng)其濃度低于0.05%時不能促進細胞增殖。目前已有很多采用重組 基因工程方法表達人體表皮細胞生長因子的研究報道，但國內(nèi)尚未見利用蜂王漿制備細胞 生長因子的研究報道。蜂王漿是由成年工蜂頭部的外分泌腺體分泌的一種化合物，它是蜂群用于哺育蜂 幼蟲的食物的重要組分，是促進幼蟲產(chǎn)生級型分化的最重要的營養(yǎng)因素。蛋白質(zhì)是蜂王漿 最主要的組分之一，占王漿干重的50%。一般王漿蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白組 成，其中水溶性蛋白占總蛋白含量的46% -89%，為王漿蛋白的主要部分，稱Major Royal Jelly Proteins (MRJPs)。此外，Schmidt等根據(jù)研究結(jié)果推測蜂王漿蛋白中MRJPs的含量 可能達到 90% (Schmidt et al，1998，Cell Mol Life Sci. 54(9) 1020-1030) Drapeau 等通過對西方蜜蜂基因組研究確定，西方蜜蜂MRJPs家族有9個成員，即MRJPl MRJP9，其 分子量范圍在25 87kDa。通過對該家族基因、分子結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn)，MRJPs包含大 量的必需氨基酸，在蜜蜂營養(yǎng)中有著重要作用，其中MRJPlmRNA在新羽化蜂、哺育蜂、采集 蜂頭部有不同表達，在咽下腺，即大腦蕈體的Kenyon細胞中表達，在大腦中發(fā)揮調(diào)控作用， 與其行為相關(guān)。我國自1957年開始生產(chǎn)王漿，1959年中國農(nóng)科院蜜蜂所研究成功有王生產(chǎn)技術(shù)。 通過科研人員和蜂農(nóng)的選擇育種、雜交育種和工程育種，目前我國已陸續(xù)育成了多個意大 利蜜蜂優(yōu)良產(chǎn)漿種系，其中浙江省的浙農(nóng)大1號、平湖意蜂和蕭山意蜂成為國內(nèi)公認的高 產(chǎn)漿蜂種質(zhì)資源，王漿產(chǎn)量在1995年創(chuàng)世界最高記錄，年群單產(chǎn)達7. 7kg。自1999年以來， 我國蜂蜜和王漿產(chǎn)量和出口量一直穩(wěn)居世界第一，王漿產(chǎn)量占世界的90%以上。我國養(yǎng)蜂 業(yè)的崛起，產(chǎn)量大幅度提高的主要原因是形成了以王漿高產(chǎn)蜂種為龍頭的配套技術(shù)，高產(chǎn) 蜂種資源成為我國養(yǎng)蜂業(yè)的優(yōu)勢，并大量出口海外(陳盛祿.2001，中國蜜蜂學(xué).中國農(nóng)業(yè) 出版社)，蜂王漿成為我國出口創(chuàng)匯的主要農(nóng)產(chǎn)品之一。但是，但由于我國王漿生產(chǎn)長期停 留于傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品模式，缺乏深加工技術(shù)，國內(nèi)市場和出口產(chǎn)品主要為原王漿和王漿凍干粉， 作為居民直接消費品的主要是保健食品、化妝品，缺乏具有高新技術(shù)含量和自主知識產(chǎn)權(quán)， 產(chǎn)品附加值高的生物醫(yī)藥、生物試劑產(chǎn)品，特別是對出口依賴性大，價格波動性大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs 的方法與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs 的方法，該功能蛋白RJCPs通過新鮮蜂王漿或新鮮蜂王漿凍干粉經(jīng)PBS緩沖液溶解、離心分 離、透析除鹽、凍干等步驟制備而成。進一步地，所述蜂王漿功能蛋白RJCPs電泳后顯示的分子量范圍在25 SOkDa ； 所述蜂王漿功能蛋白RJCPs可與蜂王漿蛋白MRJPl和MRJP7多克隆抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，顯示分子量范圍在57 80kDa在Western blot印跡。一種蜂王漿功能蛋白RJCPs作為細胞生長因子應(yīng)用于任何昆蟲、動物、人體細胞 的傳代和原代體外無血清培養(yǎng)生存生長培養(yǎng)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所制備的蜂王漿功能蛋白RJCPs是一種細胞生長 因子，可替代牛血清應(yīng)用于昆蟲、動物、人體細胞的傳代和原代體外無血清培養(yǎng)生存生長培養(yǎng)。
圖1是意大利蜜蜂蜂王漿功能蛋白RJCPs的SDS-PAGE電泳分析，RJCPs的與蜂王 漿主蛋白MRJPl多克隆抗體的Western blot印跡分析，其中，(a)和(b)為意大利蜜蜂蜂 王漿功能蛋白RJCPs的SDS-PAGE電泳圖，M為標(biāo)準蛋白分子量Marker，RJ所示為蜂王漿 功能蛋白樣品，(c)為Western blot印跡分析結(jié)果，RJ所示為意大利蜜蜂王漿蛋白；箭頭 所示為AmMRJPs各成員AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3a和AccMRJP5的位置，位置的標(biāo)示參 照 Schmidt 等發(fā)表的西方蜜蜂蜂王菜(Schmidt et al, 1998, Cell Mol Life Sci. 54(9) 1020-1030)。圖2是采用Bradford法蛋白定量試劑，用酶標(biāo)儀測定不同濃度下蛋白標(biāo)準品的 OD595值建立的標(biāo)準蛋白曲線，X軸為OD595值，Y軸為蛋白濃度。圖3是標(biāo)準無血清培養(yǎng)基TNM-FH中添加RJCPs與添加胎牛血清FBS第3天，兩種 培養(yǎng)基中的粉紋液蛾細胞TN-5B1-4細胞形態(tài)比較圖，(a)添加胎牛血清FBS后3天后細胞 形態(tài)，(b)為添加RJCPs后3天的細胞形態(tài)。圖4是TN-5B1-4標(biāo)準無血清培養(yǎng)基中添加RJCPs與添加胎牛血清FBS后第3天， 兩種培養(yǎng)基中的TN-5B1-4活細胞密度比較。圖5是無血清培養(yǎng)基中DMEM中添加RJCPs與添加胎牛血清FBS后10天后，人結(jié) 腸癌細胞HCT-116細胞形態(tài)比較圖，(a)添加胎牛血清FBS后10天的細胞形態(tài)，(b)無血清 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞3天后的形態(tài)，(c)添加RJCPs后10天的細胞形態(tài)。圖6是無血清培養(yǎng)基中DMEM中添加不同濃度RJCPs (0，100, 200, 300,400, 500 μ g/ mL DMEM)與添加10 %胎牛血清FBS后第10天，每個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液中存活人結(jié)腸癌活細 胞 HCT-116 數(shù)量(Viable cell number/well)的比較圖。圖7是無血清培養(yǎng)基MEM中添加RJCPs與添加胎牛血清FBS后，不同培養(yǎng)基中人 腎上皮細胞系293T細胞形態(tài)比較圖，(a)為添加胎牛血清FBS后3天的細胞形態(tài)，(b)為無 血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的細胞形態(tài)，(c)為添加RJCPs后3天的細胞形態(tài)，活細胞數(shù)采用 臺盼藍法測定。圖8是無血清培養(yǎng)基中DMEM中添加不同濃度RJCPs (0，100, 200, 300,400, 500 μ g/ mL DMEM)與添加10%胎牛血清后FBS第10天，每個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液中存活人腎上皮細胞 系293T數(shù)量(Viable cell number/well)的比較圖，活細胞數(shù)采用臺盼藍法測定。圖9是無血清培養(yǎng)基RPMI 1640中添加RJCPs與添加胎牛血清后10天后，不同培 養(yǎng)基中卵巢癌細胞系A(chǔ)2780/cp70細胞形態(tài)比較圖，(a)為添加胎牛血清后10天的細胞形 態(tài)，(b)為無血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞10天后的形態(tài)，(c)為添加RJCPs后10天 的細胞形態(tài)。
具體實施例方式蜂王漿功能蛋白RJCPs屬水溶性蛋白，通過新鮮蜂王漿或新鮮蜂王漿凍干粉經(jīng) PBS緩沖液溶解、離心分離、透析除鹽、凍干而成，分子量范圍在57 105kDa，可與蛋白 MRJPl和MRJP7多克隆抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，添加于無血清標(biāo)準培養(yǎng)基后，具有類似于胎牛血 清或小牛血清的，促進動物細胞生長與分裂的生物活性，該蛋白可應(yīng)用于動物細胞培養(yǎng)。本發(fā)明用蜂王漿制備具有促進動物細胞生長功能的生長因子的具體步驟如下1.蜂王漿功能蛋白RJCPs的制備與檢測①稱取冷凍保存的王漿凍干粉5g，溶于15mL IX磷酸緩沖液PBS(配制方法 NaCl 8g、KCl 0. 2g、KH2P040. 24g、Na2HP04 · 12H20 3. 63g，溶解 800mL 蒸餾水中，用 HCl 調(diào) 節(jié)溶液的PH值至7. 4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20min，室溫保存)。將王漿溶液置4°C 抽提24h。②將王漿溶液置離心管，用冷凍離心機在每分鐘12000rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，取 上清即為可溶性王漿蛋白MRJPs。③將RJCPs置膜徑為14k的透析袋中，將透析袋置去離子水中，在4°C下透析24h， 期間每隔6 8h換水一次，去除鹽離子。④將透析過的RJCPs置真空冷凍干燥機凍干，-20°C保存?zhèn)溆?。取此凍干粉，進行 SDS-PAGE變性電泳分析，可見分子量范圍在25 87kDa ；用純化的蜂王漿主蛋白MRJPl免 疫大白兔所制備的多克隆抗體作為一抗，進行Western blot檢測，RJCPs蛋白顯示35、57、 87、105kDa的免疫印跡。⑤取此RJCPs凍干粉溶于無菌去離子水，用Bradford試劑盒對該溶液進行蛋白質(zhì) 含量測定，定容為每毫升含蛋白80 100 μ g ；溶液用孔徑為0. 22 μ m的過濾膜進行過濾除菌。2.用蜂王漿功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培養(yǎng)昆蟲細胞①無血清昆蟲細胞培養(yǎng)基配制稱取TNM-FH培養(yǎng)基干粉(美國Sigma公司生產(chǎn))δ1· 2g,NaHCO3O. 35g，溶于800mL 滅菌雙蒸水，置磁力攪拌器攪拌至完全溶解；用lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6. 0，定容至 IL ；溶液用孔徑0. 22 μ m的過濾膜過濾除菌，得無血清標(biāo)準培養(yǎng)基。②添加蜂王漿功能蛋白RJCPs的昆蟲培養(yǎng)基配制在無血清標(biāo)準培養(yǎng)基中添加10-20%體積比的蜂王漿功能蛋白RJCPs，混勻。③培養(yǎng)昆蟲細胞取35mm細胞培養(yǎng)皿，接種1 X 105Τη-5Β1_4單層細胞，加入2mL含胎牛血清的培 養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)48h至細胞長至對數(shù)生長 期；用無血清的TNM-FH培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞2次；加含10% RJCPs的TNM-FH培養(yǎng)基；分別 在72h、96h后，用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、貼壁情況，拍照、計數(shù)細胞增殖數(shù)量。3.用蜂王漿功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞HCT-116用添加蜂王漿功能蛋白RJCPs的MEM培養(yǎng)基(GIBC0公司產(chǎn)，含100U/L青霉素、含 100U/L鏈霉素)培養(yǎng)起始密度為30%的人結(jié)腸癌細胞HCT-116，于37°C、50ml/L CO2的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可維持細胞正常生長10天以上，活性明顯優(yōu)于牛血清。
4.用蜂王漿功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培養(yǎng)人腎上皮細胞系293T用添加蜂王漿功能蛋白RJCPs于DMEM高糖培養(yǎng)基(含100U/L青霉素、含100U/L 鏈霉素)培養(yǎng)人大腸癌細胞HCT-116，培養(yǎng)起始密度為30%，于37°C、50mL/L CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)3天，具有明顯優(yōu)于牛血清的活性。意大利蜜蜂王漿是蜜蜂哺育工蜂頭部王漿腺分泌的乳狀物，含豐富的活性蛋白。 本發(fā)明的蜂王漿功能蛋白RJCPs為發(fā)展蜂王漿深加工，開發(fā)高科技生物制品，提供有利于 克服胎牛血清弊病，確保細胞工程產(chǎn)品安全的新方法，及其大規(guī)模的生產(chǎn)并應(yīng)用于抗菌方 面打下了基礎(chǔ)。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1 蜂王漿功能蛋白RJCPs的制備與檢測1.可溶性王漿蛋白抽提稱取冷凍保存的王漿凍干粉5g，溶于15mL磷酸緩沖液IXPBS (配制方法=NaCl 8g、KCl 0. 2g、KH2PO4O. 24g、Na2HP04 · 12H20 3. 63g，溶解 800mL 蒸餾水中，用 HCl 調(diào)節(jié)溶液 的pH值至7. 4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20min，室溫保存)，將溶液置4°C抽提24h。2.可溶性王漿蛋白分離將王漿溶液置離心管，用冷凍離心機在每分鐘12000g/轉(zhuǎn)速下離心30min，取上清 即為可溶性王漿蛋白MRJPs。3.透析脫鹽 將可溶性蜂王漿蛋白RJCPs溶液置膜徑為14kDa的透析袋中，扎緊袋口，將透析袋 置去離子水中，置冰箱內(nèi)冷藏室內(nèi)，在4°C溫度下透析24h，期間每隔6 8h換水一次，以去 fe ik罔子ο4.凍干將已經(jīng)透析處理的RJCPs溶液置冰箱內(nèi)冷凍，然后置真空冷凍干燥機凍干。將凍 干粉密封容器內(nèi)，-20°C保存?zhèn)溆谩?.蛋白質(zhì)電泳檢測取此凍干粉，進行SDS-PAGE變性電泳分析，可見分子量范圍在25 87kDa(附 圖1A)；用純化的蜂王漿主蛋白MRJPl免疫大白兔所制備的多克隆抗體作為一抗，進行 Western blot檢測，RJCPs蛋白顯示同樣的kDa的免疫印跡(附圖1B)。6.使用液配制取此RJCPs凍干粉溶于無菌去離子水，用Bradford試劑盒對該溶液進行蛋白質(zhì)含 量測定。按照Bradford法蛋白定量試劑盒的說明稀釋蛋白標(biāo)準品，用酶標(biāo)儀測定不同濃度 下標(biāo)準品及樣品的0D595值(見表1)，建立標(biāo)準曲線(圖2)，公式為y = 14. 441χ-8. 1249。 將MRJPs溶液的吸光度(X)代此公式，MRJPs溶液濃度(Y)為80. 9 μ g/mL。將此溶液用孔 徑為0. 22 μ m的過濾膜進行過濾除菌即得。表1蛋白標(biāo)準品及樣品的吸光度(0D值)測定
權(quán)利要求
一種用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，該功能蛋白RJCPs通過新鮮蜂王漿或新鮮蜂王漿凍干粉經(jīng)PBS緩沖液溶解、離心分離、透析除鹽、凍干等步驟制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，所述蜂王漿 功能蛋白RJCPs電泳后顯示的分子量范圍在25 80kDa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，所述蜂王漿 功能蛋白RJCPs可與蜂王漿蛋白MRJPl和MRJP7多克隆抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，顯示分子量范 圍在57 80kDa在Western blot的印跡。
4.一種蜂王漿功能蛋白RJCPs作為細胞生長因子應(yīng)用于任何昆蟲、動物、人體細胞的 傳代和原代體外無血清培養(yǎng)生存生長培養(yǎng)方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用蜂王漿制備功能蛋白RJCPs的方法，該功能蛋白RJCPs通過新鮮蜂王漿或新鮮蜂王漿凍干粉經(jīng)PBS緩沖液溶解、離心分離、透析除鹽、凍干而成；本發(fā)明所制備的蜂王漿功能蛋白RJCPs是一種細胞生長因子，可替代牛血清應(yīng)用于昆蟲、動物、人體細胞的傳代和原代體外無血清培養(yǎng)生存生長培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/07GK101948518SQ20101025616
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者張偉光, 張瑮文, 沈立榮, 莫寅元, 袁鵬, 賴超強, 陳益 申請人:浙江大學(xué)