一種中國地方黃牛Pax7基因的單核苷酸多態(tài)性的PCR-RFLP檢測方法

專利名稱：一種中國地方黃牛Pax7基因的單核苷酸多態(tài)性的PCR-RFLP檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及中國地方黃牛單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標記 的篩查和檢測，特別涉及一種檢測黃牛Pax7基因第3531位與第56626位單核苷酸多態(tài)性 的方法。
背景技術(shù)：
分子標記是遺傳標記的重要組成部分。遺傳標記大致可分為兩類1類是間接反 映DNA水平遺傳變異的遺傳標記，如形態(tài)標記、細胞標記和生化標記；II類是直接反映DNA 水平遺傳變異的分子標記。分子標記之所以能反映DNA水平的遺傳變異情況主要是基于被 研究的DNA分子由于點突變、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與重排不一的重復機 制而產(chǎn)生多態(tài)性。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，DNA分子標記有許多特點，如直接以DNA的形式表現(xiàn)、 某些標記表現(xiàn)共顯性、標記數(shù)量多、多態(tài)性高等。如今分子標記在生命科學研究領域中已經(jīng) 被廣泛應用，在遺傳標記中占主導地位。應用分子標記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而提高黃 牛的生長速度和改善肉品質(zhì)的先進的有效的方法。應用分子標記育種首先是在DNA水平上 篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的遺傳標記，其次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測方 法；然后實現(xiàn)遺傳標記輔助選擇和實現(xiàn)早期診斷選擇。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后引入限制性內(nèi)切酶 進行切割，然后進行瓊脂糖或聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方 法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢 測的序列位點無特殊性要求。Pax基因家族在人類和小鼠中都存在，它包括Paxl到Pax9的九個家族成員。這些 基因在編碼蛋白質(zhì)過程中有轉(zhuǎn)錄子調(diào)節(jié)器的作用。在人和小鼠的先天性疾病發(fā)現(xiàn)了 Pax基 因家族中若干基因的突變，這表明該基因家族在所在組織中的突變可以阻礙生物的生長進 程。Pax7基因定位于人染色體lp36. 2 36. 12和鼠染色體4。基因全長104064bp，編 碼486個氨基酸。包含9個外顯子8個內(nèi)含子。Pax7屬于Pax基因家族的III組，與中樞 神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌的發(fā)育有關(guān)，是強有力的生肌性誘導物，能使多能干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯⌒?細胞，在骨骼的發(fā)育和再生過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，Pax7基因敲除小鼠的 體型比雜合型及野生型小鼠明顯偏小。除此之外，Pax7基因突變也與某些疾病有關(guān)，Maika G等人發(fā)現(xiàn)人Pax7基因內(nèi)含子發(fā)生的401處SNPs與人類橫紋肌肉瘤顯著相關(guān)(Maika G. Mitchell, Diane Tabarini, Melanie Zimanl, Single Nucleotide Polymorphisms associated with the Intronic Cis Regulatory Regions of PAX7 :APotential Linkage to Increased Tumorigenesis of Rhabdomyosarcoma elucidated via In Silico Biology and Pyrosequencing, Nature and Science. 2006 ；4 (4) :6_20)。
目前，國內(nèi)外對黃牛的Pax7基因研究甚少，主要集中在人和小鼠等方面，而且大 都集中于基因功能方面，關(guān)于家畜Pax7基因遺傳變異或者SNP研究的研究國內(nèi)外尚未見報 道。因此，對中國地方黃牛Pax7基因遺傳變異領域的研究至關(guān)重要，并且將該基因位點的 遺傳變異與黃牛生長性狀(如體重、體高、體長、日增重等性狀)關(guān)聯(lián)分析，可以為我國黃 牛分子育種提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用DNA池測序的方法篩查中國地方黃牛Pax7基因的目 的DNA序列的多態(tài)性，尋找與黃牛生長性狀相關(guān)的SNP作為分子標記，提供一種黃牛Pax7 基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，以此作為黃牛分子育種和標記輔助選擇的分子遺傳 標記，加快良種選育速度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測黃牛Pax7基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Pax7基因的待測黃牛全 基因組DNA為模板，以引物對P1和P2為引物，PCR擴增黃牛Pax7基因；然后分別用限制性 內(nèi)切酶消化PCR擴增產(chǎn)物，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠 電泳結(jié)果鑒定黃牛Pax7基因編碼區(qū)多態(tài)性。所述的黃牛Pax7基因多態(tài)性包括黃牛的Pax7基因第3531位為G > A的堿基多態(tài)性；黃牛的Pax7基因第56626位為G > A的堿基多態(tài)性。所述的引物對P1和P2(5’ _3’)為PI-F1 :5，TCTCCCACCTCCACCTCT 3，，18nt (核苷酸)；R1 :5，CTCCCTTCTTCCCTGCTC 3，，18nt (核苷酸)；P2-F2 :5，GGTTGCCATTGCCTCCT 3，，17nt (核苷酸)；R2 :5，TGTGCTATGGTGCGTGCT 3，，18nt (核苷酸)。用限制性內(nèi)切酶Hinfl消化P1擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠 電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Pax7基因第3531位的堿基多態(tài)性；用限制性內(nèi)切酶BspT104I消化P2擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的片段進行瓊脂糖 凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Pax7基因第56626位的堿基多態(tài)性。所述的PCR擴增的反應程序為PI-95°C預變性 5min ；94°C變性 30s，63. 2°C退火 30s，72°C延伸 35s，30 35
個循環(huán)；72°C延伸lOmin ；P2-95°C預變性 5min ；94°C變性 30s，66°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 35 個
循環(huán)；72°C延伸lOmin。所述的檢測P1的瓊脂糖凝膠濃度為3. 5%，通過電泳判定黃牛Pax7基因第3531 位的堿基多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為385bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為385，354和31bp條帶； GG基因型表現(xiàn)為354和31bp條帶。所述的檢測P2的瓊脂糖凝膠濃度為2%，通過電泳判定黃牛Pax7基因第56626位 的堿基多態(tài)性為GG基因型表現(xiàn)為632bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為632，343和289bp條帶； AA基因型表現(xiàn)為343和289bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把DNA池測序篩查SNP與PCR-RFLP結(jié)合起來解決了 SSCP的繁瑣和不穩(wěn)定性，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA 水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的遺傳標記，可用于黃牛的分子育種。本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對黃牛Pax7基因第3531位和第56626位上的兩處同 義密碼子突變可能產(chǎn)生編碼蛋白表達水平發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，當?shù)?531 位由G突變?yōu)锳時，原有的編碼Ala的密碼子GCG發(fā)生突變?yōu)镚CA ；相同地，當?shù)?6626位 由G突變?yōu)锳時，原有的編碼Glu的密碼子TCG發(fā)生突變?yōu)門CA，導致在轉(zhuǎn)錄的mRNA在翻譯 過程由于攜帶該氨基酸的tRNA豐度不同而影響翻譯的效率，從而影響該蛋白的表達量；本發(fā)明對上述兩個SNP進行了與黃牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，對5個中國地方黃牛 品種中的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，結(jié)果表明兩個位點均能影響黃牛的體重 和日增重，除此之外，黃牛生長環(huán)境(如華北和東北)可以影響上述兩個位點在群體內(nèi)的分 布情況?；赑ax7對家畜早期發(fā)育的重要作用，對Hinfl和BspT104I多態(tài)位點與黃牛不 同月齡的體重體尺性狀之間進行方差分析表明，這兩個位點均能影響6月齡的體重性狀， 因此，上述兩個SNP位點可以作為早期標記輔助選育(MAS)的分子標記。


圖1為黃牛Pax7基因包含第3531位突變位點的Hinfl酶切電泳結(jié)果，瓊脂糖凝膠 濃度為3.5%，圖中出現(xiàn)的三種條帶為AA基因型表現(xiàn)為385bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為385， 354和31bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為354和31bp條帶。其中，31bp片段太小在圖中無法顯 示；圖2為黃牛Pax7基因第3531位突變位點包含AA、AG和GG三種基因型的測序圖；圖3為黃牛Pax7基因包含第56626位突變位點的BspT104I酶切電泳結(jié)果，瓊脂 糖凝膠濃度為2%，圖中出現(xiàn)的三種條帶為GG基因型表現(xiàn)為632bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為 632，343和289bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為343和289bp條帶；圖4為黃牛Pax7基因第56626位突變位點包含GG、AG和AA三種基因型的測序 圖。
具體實施例方式本發(fā)明根據(jù)Pax7基因組序列設計引物，分別以5種黃牛品種的基因組DNA池為模 板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物純化，測序后得到黃牛Pax7基因的部分序列。根據(jù)BLAST 序列比對發(fā)現(xiàn)兩處SNPs，利用PCR-RFLP方法對該SNPs進行檢測。下面對本發(fā)明做詳細說 明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛Pax7基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測1、樣本采集及基因組DNA提取(1)血液樣本的采集本發(fā)明具體以5個中國地方黃牛品種的種群的1226頭黃牛作為檢測對象，具體 采集樣本見表1:南陽牛(222)，郟縣紅牛(398)，秦川牛(210)，魯西牛(163)和草原紅牛 (233)。表1樣品來源
(2)血樣基因組DNA的提取1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 ii L至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩 沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C )，棄去上清液，重復上述步驟至上清液透明、
沉淀呈淡黃色。2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 u L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C水浴lh。DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加 超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0。4°C保存?zhèn)溆谩?)加蛋白酶K 3uL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加1 P L 蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 y L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復一次。5)加氯仿500 u L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中。6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管直 至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min。7)4°C,12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。8) 4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。9)干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全 溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。2、DNA池的構(gòu)建用紫外光光度計測定DNA樣品在260歷、280歷處的0D值。計算DNA含量和0D26(1/
OD280的比值。
如0D26(I/0D28(i比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應進行純
化；若比值大于1.8，則應該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ng) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/i! L，然后從南陽牛品種30個濃度為 50ng/ ii L DNA樣品中取10 ii L混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法也構(gòu)建郟縣紅牛、秦川牛、魯西牛和草原紅牛品種DNA池。3、設計包含Pax7基因外顯子3和外顯子5的多態(tài)性引物
從NCBI 數(shù)據(jù)庫中(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲得海福特牛的 GenBank 登 錄號為NC_007300的基因Pax7DNA序列，利用Primer 5. 0設計擴增黃牛Pax7基因外顯子 3和外顯子5的兩對引物，其引物對序列如下PI-F1 :5，TCTCCCACCTCCACCTCT 3，，18nt (核苷酸)；R1 :5，CTCCCTTCTTCCCTGCTC 3，，18nt (核苷酸)；P2-F2 :5，GGTTGCCATTGCCTCCT 3，，17nt (核苷酸)；R2 :5，TGTGCTATGGTGCGTGCT 3，，18nt (核苷酸)。4、PCR克隆黃牛Pax7基因分別以5個黃牛品種的DNA池為模版，用上述設計的引物對其進行PCR擴增，PCR 反應體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應所需 的PCR反應的個數(shù)，算出各種反應組分的總量，加入到1個1. 5mL離心管中，充分混勻后瞬 時離心，再分裝到每個0. 2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進行PCR
PCR反應體系見表2 : 表2PCR反應體系
~ 體系成分體積(叫) 滅菌超純水(h20)— 2xbuffer (內(nèi)含 Mg2+、dNTPs 等)7.5 上游引物(10pmol/L)0.5 下游引物(10pmol/L)0.5 TaqDNA 聚合酶(2.50.25 DNA 模板(50ng/nL)0.45 _總體積_15_
PCR反應程序
PI :95°C 預變性 5min ；94°C變性 30s, 63. 2°C退火 30s，72°C延伸 35s, 33 個循環(huán)； 72°C延伸 lOmin ；P2 :95°C預變性 5min ；94°C變性 30s，66°C退火 30s，72°C延伸 50s，33 個循環(huán)；72°C 延伸lOmin。5、PCR產(chǎn)物純化和測序PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳，然后進行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在 紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回 收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作。把以五個品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送南京金斯瑞測序有限公司進行雙 向測序。對黃牛Pax7基因外顯子3目的片段385bp和外顯子5目的片段632bp的測序峰 圖進行分析，其中在同一位點有兩個不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變，序列中有兩處發(fā)生 了單核苷酸的突變，均出現(xiàn)了 G、A兩種檢測結(jié)果，即本發(fā)明篩查到了黃牛Pax7基因的2個 SNP多態(tài)性，分別為黃牛的Pax7基因第3531位為G或A的堿基多態(tài)性，黃牛的Pax7基因 第56626位為G或A的堿基多態(tài)性，如圖2 (AG型)、圖4 (AG型)。黃牛Pax7基因第3531位點及第56626位點都發(fā)生了由G到A的突變，可以表示
為 G > A。b、黃牛Pax7基因多態(tài)位點的PCR-RFLP檢測1、多態(tài)位點分析當Pax7基因第3531位點發(fā)生G > A突變時，原來的Hinfl限制性內(nèi)切酶識別序 列GANTC也相應地變成g ANTC，從而破壞了 Hinfl限制性內(nèi)切酶識別序列；同樣地，當?shù)?56626位點無論發(fā)生G > A突變時，原來的BspT104I限制性內(nèi)切酶識別序列TTCGAA也相應 地變成TTC:@AA，從而破壞了 BspT104I限制性內(nèi)切酶識別序列，因此，所述的兩處SNPs可 以用 Hinfl-PCR-RFLP 和 BspT104I_PCR_RFLP 方法直接檢測。2、PCR產(chǎn)物酶切及RFLP檢測對于PCR擴增后的產(chǎn)物首先分別進行Hinfl和BspT104I酶切，然后根據(jù)電泳結(jié)果 判定其SNP多態(tài)性。1)酶切體系為20iiL，包括liiL(10U/iiL)限制性內(nèi)切酶，10yL PCR產(chǎn)物，2yL 酶切Buffer，7uL滅菌蒸餾水。2)酶切消化條件37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h。3)酶切消化后將樣品置于65°C水浴5min終止酶切反應，120V電壓進行瓊脂糖凝 膠電泳，EB染色檢測酶切結(jié)果，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并 判型、記錄其基因型。由于P1擴增外顯子3的385bp片段中不包含其它的Hinfl酶切識別 位點，因此含“G”的PCR擴增片段會被切為兩個片段；P2擴增外顯子5的632bp片段中不 包含其它的BspT104I酶切識別位點，因此含“G”的PCR擴增片段也會被切為兩個片段。4)由于黃牛為2倍體，所以黃?；蚪M的Pax7基因第3531位和第56626位發(fā)生 突變時經(jīng)PCR-RFLP檢測其各種基因型，結(jié)果為如圖1所示，經(jīng)3. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，泳道1和泳道3不包含385bp條 帶，表現(xiàn)為AA基因型個體，泳道2同時包含385bp、354bp和31bp條帶，為雜合子AG基因型 個體，泳道4包含354bp和31bp條帶，為GG基因型個體，泳道M為Marker I (600bp, 500bp, 400bp，300bp，200bp，100bp)。注由于膠濃度較大，3 lbp無法顯示。如圖3所示，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，泳道1和泳道2包含632bp條帶， 表現(xiàn)為GG基因型個體，泳道3同時包含632bp、343bp和289bp條帶，為雜合子AG基因型個 體，泳道4包含343bp和289bp條帶，為AA基因型個體，泳道M為D2000 (2000bp, lOOObp, 750bp,500bp,250bp,lOObp)。5)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證利用ABI 377和ABI 3730測序儀對所述的兩處多態(tài)位點的不同基因型個體PCR 產(chǎn)物分別進行正反雙向測序；同時，進行SNP位置分析，結(jié)果表明對于Hinfl位點，雜合子 AG基因型個體第3531位的測序圖的確表示為A或G，如圖2a所示，自左向右第7個峰為兩 個峰，而GG基因型、AA基因型分別為G、A，如圖2b、c所示；對于BspT104I位點，雜合子AG 基因型個體第56626位的測序圖的確表示為A或G，如圖4a所示，自左向右第6個峰為兩個 峰，而GG基因型、AA基因型分別為G、A，如圖4b、c所示。c、黃牛Pax7基因SNP位點的頻率統(tǒng)計及其與生長性狀關(guān)聯(lián)分析1、基因和基因型頻率
基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。PAA =NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；Nm表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式
+NAan).
'2N
可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+.式中，PA表示等位基因A頻率，Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表示 群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基因A的n個互不相同的復等位基因。統(tǒng) 計結(jié)果見表3。表3基因及基因型頻率統(tǒng)計
基因型頻率
等位基因型頻率 從表4中可以看出，在Hinfl位點，等位基因型A的頻率變化范圍為0.336 0. 584，等位基因型G的頻率變化范圍為0. 416 0. 664 ；在BspT104I位點，等位基因型A的 頻率變化范圍為0. 349 0. 659，等位基因型G的頻率變化范圍為0. 341 0. 651。對于所 述的兩個位點，在NY、JX、QC和LX牛中G為優(yōu)勢等位基因型，而草原紅牛群體內(nèi)A為優(yōu)勢等 位基因型，這說明基因型分布受黃牛生長環(huán)境的影響。2、基因效應的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)HinfI識別的基因型(AA、AG和GG)BspT104I 識別的基因型(GG、AG 和 AA)生產(chǎn)數(shù)據(jù)南陽牛6月齡、12月齡、18月齡和24月齡的各種生長性狀(包括體重、 日增重、體高、體長和胸圍)。關(guān)聯(lián)分析模型利用SPSS(16. 0)軟件分析基因位點的各種基因型和年齡與生長性狀的相關(guān)性。 先對數(shù)據(jù)進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù) 特征，利用多元線性模型分析基因型效應。模型如下Yijkimn = U +Genotypei+AgeJ+Xn+eiJklnm其中yijklm為個體表型記錄；Genotype為各個位點的基因型效應；Agem為年齡效 應；Xn為兩個因素的互作效應AgeXGenotype，eij為隨機誤差；運用SPSS(16. 0)軟件對數(shù) 據(jù)進行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型間生長性狀進行差異顯著性檢驗，結(jié)果見表4。表4兩個位點不同基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析 注具有相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。結(jié)果表明，在BspT104I檢測的SNP位點，三種基因型對不同月齡的黃牛生長性狀 影響均不顯著(P > 0. 05)；在Hinfl檢測的SNP位點，AG型6月齡個體的體重和日增重都 明顯高于AA型和GG型個體，且表現(xiàn)顯著水平，而其各種基因型與12，18和24月齡的各種 生長性狀都不顯著相關(guān)。因此，本發(fā)明首次成功利用Hinfl和BspT104I PCR-RFLP方法檢測了中國地方黃 牛Pax7基因的SNP位點。并通過關(guān)聯(lián)分析驗證，Hinfl位點的AG基因型可以作為黃牛早 期分子育種的分子標記。
權(quán)利要求
一種中國地方黃牛Pax7基因的單核苷酸多態(tài)性的PCR RFLP檢測方法，其特征在于，以中國地方黃?；蚪MDNA序列為模板，在Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg++、dNTPs存在的情況下，利用聚合酶鏈式反應引物，在PCR條件下進行擴增，然后利用HinfI和BspT104I限制性內(nèi)切酶對其進行酶切，再通過電泳檢測即可準確鑒定黃牛單核苷酸多態(tài)性。所述的聚合酶鏈式反應引物見下表
2.權(quán)利要求1所述的黃牛Pax7基因單核苷酸多態(tài)性的PCR-RFLP檢測方法，其特征在 于，所述PCR反應程序為PI-95°C預變性 5min ；94°C變性 30s，63. 2°C退火 30s，72°C延伸 35s，30 35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin ；P2-95°C預變性 5min ；94°C變性 30s，66°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，用于檢測第3531位點的限制性 內(nèi)切酶為Hinfl ；用于檢測第56626位點的限制性內(nèi)切酶為BspT104I ；酶切體系為20，包括liiL(10U/iiL)限制性內(nèi)切酶，lOiiL PCR產(chǎn)物，2iiL酶切 Buffer，7 iiL滅菌蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-RFLP檢測方法，其特征在于，中國地方黃牛Pax7基因編 碼區(qū)的多態(tài)性包括基因組第3531位EXon3的G > A突變與基因組第56626位EXon5的G > A突變。
5.權(quán)利要求1所述的PCR-RFLP檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠濃度為 3. 5%，通過電泳判定黃牛Pax7基因第3531位的堿基多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為385bp條 帶；AG基因型表現(xiàn)為385、354和31bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為354和31bp條帶。
6.權(quán)利要求1所述的PCR-RFLP檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠濃度為2%， 通過電泳判定黃牛Pax7基因第56626位的堿基多態(tài)性為GG基因型表現(xiàn)為632bp條帶；AG 基因型表現(xiàn)為632、343和289bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為343和289bp條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測中國地方黃牛Pax7基因的單核苷酸多態(tài)性的PCR-RFLP方法。首先，以包含Pax7基因的黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P(包括P1(F1，R1)和P2(F2，R2))為引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer(緩沖環(huán)境)、Mg2+、dNTPs存在的情況下，PCR擴增黃牛Pax7基因；用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Pax7基因編碼區(qū)第3531位G或A的單核苷酸多態(tài)性與第56626位G或A的單核苷酸多態(tài)性。Pax7基因與家畜的早期骨骼肌發(fā)育有關(guān)，該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的分子遺傳標記，為黃牛的標記輔助選育(MAS)提供基礎資料，進而可推廣至黃牛分子育種領域。
文檔編號C12Q1/68GK101921857SQ20101025596
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者劉金彪, 徐瑤, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學