豬流感病毒和豬口蹄疫病毒的混合病毒樣顆粒、制備方法和應用的制作方法

專利名稱：豬流感病毒和豬口蹄疫病毒的混合病毒樣顆粒、制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬流感病毒和豬口蹄疫病毒的混合病毒樣顆粒，以及制備和應用。
背景技術(shù)：
豬流感是由豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的不同日齡、性別和品種豬只的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病，其臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征。各年齡、性別、品種豬均能感染，發(fā)病率高。單獨感染豬流感病毒可導致豬只生產(chǎn)性能下降，料肉比升高，增重減緩，給豬場造成一定的經(jīng)濟損失。更為嚴重的是，豬是禽、人、豬流感病毒重組和復制的“混合器”，豬流感病毒不需重組就有最大限度感染人的能力。而且早期的人流感病毒還可以儲存于豬體內(nèi)，并在一定時期內(nèi)再次感染人。目前，常見的豬流感主要有H1N1、H1N2和H3N2等3種亞型。值得重視的是，SIV更多見與其它疫病，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、 豬鏈球菌、豬附紅細胞體等并發(fā)或繼發(fā)感染，使疫情變得反復而復雜，是現(xiàn)代集約化豬場普遍存在且難以根除的豬呼吸道傳染病之一，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。甲型Hmi流感病毒的流行不僅給很多國家的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且對世界范圍內(nèi)的人民公共衛(wèi)生安全造成了一個很大的挑戰(zhàn)。2009年4月爆發(fā)于墨西哥的甲型Hmi流感全球矚目，隨后，美國和加拿大等國也相繼出現(xiàn)人感染Hmi豬流感的情況并有部分病人死亡。在短期內(nèi)研制有效疫苗來預防甲型Hmi流感病毒抑制疫情傳播和加重迫在眉睫。目前國內(nèi)生產(chǎn)的用于禽畜預防流感病毒的疫苗大部份是采用傳統(tǒng)的雞胚法培養(yǎng)增殖活病毒，經(jīng)化學試劑滅活后生產(chǎn)成疫苗。這種技術(shù)又分為兩類不同的制備法一是直接用野生型病毒感染雞胚制備，另一類是先采用反向遺傳技術(shù)改造野生病毒的遺傳性，然后用“拯救”改造的新病毒來感染雞胚，增殖病毒，生產(chǎn)疫苗。這些流感疫苗制備技術(shù)有其優(yōu)點，但亦存在著很大的缺陷。尤其是流感感毒的與眾不同特性，例如高頻率突變，雙重及多重亞型病毒之間遺傳物質(zhì)重組及抗原漂移等一使這些疫苗的長期安全性及有效性受到了極大挑戰(zhàn)，甚至產(chǎn)生了 “無效疫苗”，難以應付新的突變型Hmi流感病毒的傳染。除此以外，這些疫苗制劑還存在著以下不足1、生產(chǎn)周期長從獲得新的亞型病毒株到疫苗生產(chǎn)上市，耗時5-8個月，難以遏制新的疫情大爆發(fā)。2、生產(chǎn)條件高為預防人為的污染環(huán)境及生產(chǎn)的活病毒的泄漏擴散，整套生產(chǎn)必須按規(guī)定在生物安全三級實驗室條件下進行，病毒的滅活必須保證完全，徹底。3、無法區(qū)別被免疫過的豬只與受病毒感染的豬只?？谔阋?foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄獸，人和非偶蹄動物也可感染。國際獸疫局將口蹄疫列為A類傳染病之首，我國也把它列為家畜傳染病的第一個病?？谔阋咭坏┍┌l(fā)會導致巨大的經(jīng)濟損失，同時也影響到國家和地區(qū)的正常貿(mào)易活動。由于口蹄疫直接威脅國際貿(mào)易和國家聲譽及動物生態(tài)和人類食品衛(wèi)生，因而受到人們的普遍關(guān)注。近年更被列為生物武器安全公約組織重點檢查對象，世界各國包括無口蹄疫的國家，均對本病保持高度警惕，并大力開展病原學、診斷技術(shù)和防制技術(shù)的研究。FMDV是已知的最小的動物RNA病毒，病毒粒子呈球形，正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑20 30nm，分子量6.9X 106u，沉降系數(shù)146s，在氯化銫中的浮密度為1. 43g/mL。完整病毒含單股正鏈RNA和衣殼蛋白兩部分，無囊膜。衣殼由VP1、VP2、VP3、VP4各60分子組成，基因組RNA由約8500個核苷酸組成，可直接作為信使RNA。FMDV只含有一個ORF(開放閱讀框)，編碼病毒的前體聚蛋白。前體聚蛋白經(jīng)兩次裂解后形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4)，其中 VPl(ID)基因位于基因組的四77 3615位，編碼213個氨基酸。早期的研究表明，結(jié)構(gòu)蛋白是誘導中和抗體的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。在已發(fā)現(xiàn)的0型五個抗原位點中，有三個位于VPl上，其中140-160位氨基酸處的G-H環(huán)是最主要的保護性抗原位點，空間構(gòu)象比較復雜，具有較大的運動性，在其頂部形成了一個高度保守的Arg-Gly-Asp(RGD) 序列，是FMDV的細胞受體位點。VPl的第140 160和200 213氨基酸殘基是兩個主要的B細胞表位，能誘導抗FMDV的中和抗體，VPl第141 160氨基酸殘基中也含有至少一種T細胞表位，能誘導FMDV專一性的T細胞反應。我國對口蹄疫的防制采用疫苗免疫和撲殺相結(jié)合的政策，對豬的口蹄疫采用強制免疫。目前使用的口蹄疫疫苗主要是全病毒滅活疫苗和多肽疫苗兩種，因存在安全隱患或免疫效果差的缺陷而不能提供理想的免疫保護。因此，研究高效、安全、可靠的疫苗顯得非常必要。病毒樣顆粒(VLPs)是含有某種病毒的一個或多個主要結(jié)構(gòu)蛋白，在體外表達系統(tǒng)中自動組裝成的不包含病毒核酸的空心顆粒，它的形態(tài)和大小與真實的病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應，作為一種新型疫苗病毒樣顆粒 (VLPs)顯示出了良好的良好的免疫效力和應用前景。典型的Hmi SIV粒子呈球形或橢圓形，直徑80 120nm，HlNl流感病毒的基因組8個基因片段共編碼11種蛋白，病毒的外殼是一層由脂質(zhì)及脂蛋白構(gòu)成的膜，包裹著病毒的遺傳物質(zhì)及核蛋白。共有4種蛋白質(zhì)，屬于病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們是基質(zhì)蛋白M1，形成病毒外殼的主體蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣殼，參與病毒粒子形成；紅細胞凝集素HA，病毒外殼表面膜上的主要糖蛋白，共有 16個亞型。是誘發(fā)宿主機體產(chǎn)生抗體的主要抗原體。神經(jīng)氨酸苷酶NA，亦是病毒外殼表面膜上的一種糖蛋白，共有9個亞型，同樣是誘發(fā)抗體產(chǎn)生的主要抗原體。流感毒的表面膜蛋白HA和NA是引起機體產(chǎn)生免疫應答的主要抗原，而基質(zhì)蛋白 Ml是形成病毒外殼的主要成分，亦可作為組織型免疫應答的抗原。有關(guān)研究證明，基質(zhì)蛋白 Ml的正確表達，是保證病毒外殼形成的重要環(huán)節(jié)，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒實體從宿主細胞表面剝離下來，形成病毒顆粒，因此禽流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ml、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和Ml等3個主要結(jié)構(gòu)蛋白同時表達就可以自動組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。另外研究證明流感病毒的型特異性抗原NP 蛋白可有效刺激CTL (細胞毒T淋巴細胞)反應，抑制病毒感染，在病毒樣顆粒中加入NP蛋白將會在一定程度上提高這種新型疫苗的細胞免疫水平。豬流感病毒和口蹄疫病毒在豬體內(nèi)互為影響，同時感染會加重病情。因此開發(fā)出一種二價疫苗同時預防Hmi豬流感和豬口蹄疫的VLPs是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問
4題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種二價疫苗，該疫苗能夠同時預防Hmi 豬流感和豬口蹄疫。本發(fā)明的目的是通過一下內(nèi)容實現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白。本發(fā)明還提供豬流感和豬口蹄疫二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供制備混合病毒樣顆粒的方法。利用包含所述融合蛋白的病毒樣顆粒構(gòu)成的疫苗，可同時預防預防Hmi豬流感和豬口蹄疫，并具有明顯的優(yōu)點和效果(I)Hmi豬流感和豬口蹄疫VLP 二價疫苗能引起機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強型應答，免疫力強，持續(xù)時間長，能同時預防Hmi豬流感和豬口蹄疫。(2)由于病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結(jié)構(gòu)的VLPs在免疫動物體內(nèi)就不會發(fā)生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個生產(chǎn)過程不接觸活的有感染力的病毒， 因此非常安全。對于流感病毒和口蹄疫病毒兩種病毒來說，都無病毒擴散之虞。(3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，因為病毒樣顆粒更接近天然病毒的形態(tài)和大小，能刺激機體產(chǎn)生更好的免疫反應，免疫效果更好。(4)可區(qū)別出被人工免疫的動物與被病毒感染的動物。病毒樣顆粒不含流感病毒 NS、PB1、PB2等蛋白，因此進行血清測試時，用病毒樣顆粒顆粒疫苗免疫的動物，將不會產(chǎn)生特異性抗NS或PB的抗體，可以區(qū)分是否野毒感染。對于口蹄疫來說，用VPl蛋白之外的任何口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白如VP2蛋白、N蛋白等，以及口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白作為檢測抗原，都可以區(qū)分是否野毒感染。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下結(jié)合優(yōu)選實施例，并配合附圖，詳細說明如下。


圖1為通過不同特異性引物PCR擴增的HA(al)、NA(a2)、Ml (b)、NP (c)、HF(d)基因片段的電泳圖；圖 2 為重組昆蟲桿狀病毒表達質(zhì)粒 rBacmid-HA/HF-NA、rBacmid-MU rBacmid-NP 示意圖；圖3為病毒樣顆粒western blot結(jié)果。圖4為病毒樣顆粒中的Ml蛋白和Sl蛋白的間接免疫熒光結(jié)果。A、M1抗體為RBITC標記顯示橙色熒光，C、Sl抗體為FITC標記顯示綠色熒光，B、D為陰性對照。圖5A是蔗糖密度梯度離心純化后的病毒樣顆粒在電子顯微鏡下的圖象，b為a的局部放大圖。
具體實施例方式本發(fā)明以Bac-to-Bav昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)為基礎，利用Hmi豬流感病毒的基質(zhì)蛋白M和核蛋白NP，以及表面膜蛋HA和NA蛋白，共同自動組裝構(gòu)建出Hmi豬流感病毒的病毒樣顆粒(VLP)。在此基礎上，構(gòu)建Hmi豬流感病毒與豬口蹄疫病毒的二價VLPs。首先，將豬口蹄疫病毒VPl上的兩個肽段132 159(A)、200 213(B)以 A-B-A-B-A-B-A串聯(lián)的形式合成，A肽段的N端有額外5個氨基酸(MVPSR)，B肽段的C端有額外6個氨基酸(QFELEF)，A和B肽段之間加入2個氨基酸(PG) linker,在B-A連接處形成11個氨基酸(QFELEFMVPS linker，這兩個linker包含的氨基酸具有較好的柔韌性，有助于串聯(lián)片段形成一定的空間結(jié)構(gòu)，該串聯(lián)片段被命名為F多肽。將F多肽序列替換Hmi 流感病毒的HA蛋白基因的一部分，二者構(gòu)成融合基因HF，F(xiàn)多肽序列位于融合基因HF的5， 端，替換大致相等長度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因的長度與HA基因長度大致相等。然后，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將Hmi流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml、核蛋白 NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表達豬口蹄疫病毒抗原串聯(lián)多肽F和流感病毒HA 的融合蛋白HF的基因序列，構(gòu)建于昆蟲桿狀病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)，并使其重組入昆蟲桿狀病毒的遺傳物質(zhì)DNA內(nèi)，利用宿主昆蟲細胞表達這些外源蛋白，自動組裝成不含流感病毒遺傳物質(zhì)的病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成后將釋放入細胞培養(yǎng)液中。這樣形成的VLPs既具有 HlNl流感病毒的主要表面抗原，又具有豬口蹄疫病毒的主要抗原串聯(lián)多肽F，為Hmi豬流感病毒與豬口蹄疫病毒二價VLPs。需要指出的是，豬口蹄疫病毒是無囊膜的，其表面抗原蛋白沒有天然跨膜區(qū)而不能直接整合到VLP上。另外，其抗原表位分散，因此表面抗原蛋白直接融合到流感病毒HA 上會破壞HA的結(jié)構(gòu)。為了克服這些難題，本發(fā)明采用串聯(lián)抗原表位的方式，在確保多個抗原表位存在的情況下，減少了串聯(lián)抗原表位多肽的大小，可以融合到HA上。通過融合豬口蹄疫病毒的串聯(lián)抗原表位多肽到HA上，豬口蹄疫病毒的串聯(lián)抗原表位多肽能在VLP膜上表達。另外，流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白作為二價VLP的骨架是因為我們發(fā)現(xiàn)流感病毒VLP高產(chǎn)、穩(wěn)定；同時HA蛋白的整合到VLP是高效的；這樣可以保證在VLP的表面有足夠的HA蛋白，可以作為有效的疫苗使用。通過下面給出的具體實施例可以進一步清楚地理解本發(fā)明，但下述實施例并非對本發(fā)明的限定。實施列1 :M1、NP、HA、NA和融合基因HF的擴增。(1)豬口蹄疫病毒F多肽與豬流感病毒HA融合基因HF的合成融合基因HF的核酸序列見SEQ ID NO :9、其編碼的氨基酸序列見SEQ ID NO :10， 融合基因根據(jù)其核酸序列SEQ ID NO :9人工合成。F多肽含有198個氨基酸，替代HA基因的5 ‘端的184個氨基酸。
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(2) HlNl亞型豬流感病毒RNA抽提和RT-PCR按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書(方法)進行。分別取250 μ L豬流感病毒Hmi亞型毒株感染尿囊液和750 μ L TRIzol LS，加入1.5mL 微量離心管內(nèi)，用吸管吹打充分混勻，室溫放置IOmin ；加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15min ；取上清于一新的滅菌1. 5mL離心管內(nèi)，加入 500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin，在4°C下12000rpm離心IOmin ；傾去上清，沉淀中加入70%的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000rpm離心15min，棄去上清，風干；加入10 μ L用DEPC水處理的無RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀)，直接用于RT-PCR 或_80°C保存?zhèn)溆谩⒄誘aKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明進行，在20 μ L反應體系中分別加入以下組分:RNA :3μ L ；5XRT buffer :4 μ L ； dNTPs :4 μ L ； RNA 酶抑制劑0. 5μ L ；引物 UP :1 μ L ；引物 DN :1 μ L ；AMV :2 μ L ；DEPC 水補至 20 μ L?；靹蚝螅覝胤胖?10min，42°C 保溫lh，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴增或_20°C保存。(3)M1、NP、HA、NA、HF 基因的 PCR 擴增根據(jù)HA基因序列(序列表1和序列表2)設計的1對引物，用于擴增HA基因，其兩端分別加上了》ιο I和Nco I /酶切位點，位于PlO啟動子下，引物序列如下HA Xho I :5，-5，GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3，(SEQ ID NO: 11)HA Nco I :5，-GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 12)根據(jù)NA基因序列(序列表3和序列表4)設計的1對引物，用于擴增NA基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點位于Pph啟動子下，這2個引物序列分別是NA Sal I :5，-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3，(SEQ ID NO 13)NA HindIII :5，-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3，(SEQ ID NO: 14)根據(jù)Ml基因序列(序列表5和序列表6)設計的1對引物，用于擴增Ml基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點位于Pph啟動子下，這2個引物序列分別是Ml Sal I 5，-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3，(SEQ ID NO 15)Ml HindIII :5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，(SEQ ID NO: 16)根據(jù)NP基因序列(序列表7和序列表8)設計的1對引物，用于擴增NP基因，其兩端分別加上了》ιο I和Nco I /酶切位點，位于PlO啟動子下，引物序列如下NP Xho I ，5，-AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3，(SEQ ID NO 17)NP Nco I :5，-CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 18)根據(jù)融合基因HF的序列(序列表9和序列表10)，設計的1對引物，用于擴增融合基因HF，其兩端分別加上了 B10 I和Sph I酶切位點，位于PlO啟動子下，引物序列如下HF Xho I :5，-CCGCTCGAGATGGTTCCGTCTCGTG-3，(SEQ ID NO 19)HF Sph I :5，-ACATGCATGCTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 20)采用Ml、NP、HA、ΝΑ、HF各自特異性引物，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物或合成的DNA片斷直接用作PCR擴增Ml、NP、HA、ΝΑ、HF基因的模板。PCR反應條件為94°C預變性3min，94°C變性 40S，56°C退火90s，72°C延伸90s，循環(huán)30次，最后延伸lOmin，PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠 (含0. 5ug/ml溴化乙錠，EB)電泳檢測。PCR擴增的HA基因的長度約1. 7Kb (圖la)，NA基因的長度約1. 35Kb (圖la)，Ml基因的長度約0. 75Kb (圖lb)，NP基因的長度約為1. 5Kb (圖 Ic)，融合基因HF的長度約為1. 7Kb (圖Id)。所有的PCR產(chǎn)物樣品經(jīng)電泳凝膠抽提后，獲得純化的Ml、NP、HA、NA、HF基因DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I /Nco I (消化HA片段)、 Sal/Hind III (消化 NA 片段)，Xho I /Nco I (消化 NP 片段)、Sal I /Hind III (消化 Ml 片段)Jho I /Sph I (消化HF片斷)37°C分別消化后，再進一步純化，以備下一步構(gòu)建重組質(zhì)粒用。具體操作如下制備瓊脂糖凝膠含0. 5ug/ml溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內(nèi)，設置電壓100V，電泳時間40min在長波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)說明書，抽提純化Ml、 NP、HA、HF和NA基因DNA片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶37°C過夜消化后，用膠回收試劑盒(Qiagen 公司產(chǎn)品)，按照說明指導，離心過柱，純化回收酶切消化后的Ml、NP、HA、NA、HF片段。實施例2 構(gòu)建表達Ml、NP、HA、ΝΑ、HF基因的昆蟲桿狀病毒表達質(zhì)粒及在昆蟲細胞中合成重組的昆蟲桿狀病毒(1)構(gòu)建表達Ml和NP基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒質(zhì)粒PFastBac-dual (Invitrogen公司產(chǎn)品)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I /見11(1111371酶切3小時后，用膠回收試劑盒回收純化酶切后的質(zhì)粒？!^5^肌-(1皿1。在 T4 DNA連接酶的作用下，酶切后的質(zhì)粒與酶切后的Ml DNA片段于16°C連接過夜。反應體系如下10XT4連接緩沖液1ml，Ml酶切回收的DNA片段:3ml，酶切PFastBac-dual質(zhì)?；厥债a(chǎn)物lul，T4DNA連接酶lul，ddH20補至IOul。采用熱休克方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導入ToplO 感受態(tài)細胞中加入到于一小塑料離心管中，輕輕混合后將小管置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C 水浴中熱休克90s，迅速放回冰上5分鐘，想其中加入200ulLB培養(yǎng)液。37°C搖床培養(yǎng)1小時。取IOOul菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐和慶大霉素兩種抗生素)上，37°C培養(yǎng) 16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進行菌液PCR，抽提質(zhì)粒后用Ml I /HindIII進行單雙酶切鑒定。DNA序列測定后，獲得重組質(zhì)粒PFastBac-dualMl。表達NP基因的重組質(zhì)粒PFastBac-dualNP的構(gòu)建方法同上。(2)構(gòu)建表達HA/HF和NA基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒表達質(zhì)粒PFastBac-dual經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho I /Nco I酶切后， 在T4DNA連接酶的作用下，將被同樣的內(nèi)切酶消化后的HA基因DNA片段插入到PlO啟動子的下方，此連接產(chǎn)物隨后經(jīng)熱體克法轉(zhuǎn)導入ToplO感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)、抽提數(shù)個陽性克隆菌落的重組質(zhì)粒DNA，菌液PCR和Bio I /Nco I單雙酶切鑒定及DNA序列測序確定無誤后，挑選其中的一個重組質(zhì)粒DNA，進行第二次酶切。所用的限制性內(nèi)切酶為Ml I / Hind III。用同樣的內(nèi)切酶酶切NA基因DNA片段，并將其插入到重組質(zhì)粒的另一個啟動子Pph的下方，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、培養(yǎng)、抽提，獲得二度重組的質(zhì)粒。DNA測序后，即為所需的重組昆蟲桿狀病毒表達質(zhì)粒PFastBac-dual-HA-NA。整個實驗操作步驟及條件與上述構(gòu)建 PfastBac-dualMl質(zhì)粒所述相同。同時表達融合基因HF和NA基因的重組質(zhì)粒PFastBac-dual-HF_NA的構(gòu)建方法同上。(3)重組昆蟲桿狀病毒基因組的合成及提取將純化的重組PfatBac-dual-Ml、PfatBac-dual-NP、PFastBac-dual-HA-NA 和 PFastBac-dual-HF-NA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導入特殊的Ε. coli感受態(tài)細胞株DH 10 Bac細胞中(美國hvitrogen公司產(chǎn)品)。DHlOBac細胞含有一特殊的大分子質(zhì)粒Bacmid，其內(nèi)包含有昆蟲桿狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達質(zhì)粒整合入大分子質(zhì)粒Bacmid的特別
8位點后，經(jīng)3種抗菌素(慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素)的篩選及IPIG的誘導和X-Gal底物反應進行藍白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌落呈蘭色。實驗條件均按照hvitrogen公司提供的實驗手冊指導而設定。挑選的陽性克隆置于3ml的LB培養(yǎng)液中 (含上述3種抗生素)，經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)對小時，按照實驗手冊標明的大分子質(zhì)粒Bacmid小量制備法，提取純化帶有Ml基因、NP基因、HA-NA或HF-NA基因的重組大分子質(zhì)粒Bacmid。(4)重組昆蟲桿狀病毒的制備將昆蟲細胞株sf9細胞(美國hvitrogen公司產(chǎn)品)培養(yǎng)于無血清的sf_900II 昆蟲細胞培養(yǎng)液中anvitrogen公司產(chǎn)品)，溫度設置為27 °C，根據(jù)hvitrogen公司提供的實驗手冊，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將純化的重組大分子質(zhì)粒Bacmid與脂質(zhì)溶液 eellfectin (Invitrogen公司產(chǎn)品)混合，轉(zhuǎn)染入sf9細胞中，27°C培養(yǎng)4至5天后，收集細胞培養(yǎng)上清液，3000rpm離心10分鐘收集上清液，獲得低滴度的重組昆蟲桿狀病毒，再用此上清液感染新培養(yǎng)的sf-9細胞；3天后收集細胞培養(yǎng)上清液，即為所需的放大培養(yǎng)后的高濃度重組昆蟲桿狀病毒，命名為Bac-Ml，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HF_NA。對獲取的用于放大培養(yǎng)和蛋白表達的重組昆蟲桿狀病毒進行蝕斑實驗，確定病毒的噬斑形成單位(Plaque forming units, PFU)。1)用含10% FBS的Grace's培養(yǎng)基將Sf9細胞傳代接種到六孔培養(yǎng)板中，細胞密度為約IX IO6個cells/ml，每孔加2ml (6孔板)，輕輕混勻室溫使細胞貼壁1小時以上。2)將P3代種毒液用不含F(xiàn)BS的Grace’ s培養(yǎng)基做10倍倍比稀釋待用。3)棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基清洗細胞3次，然后將上述稀釋好的重組病毒液加入孔中，每個稀釋度做兩個復孔，室溫下感染1小時。4)制備覆蓋液(以下為一塊六孔板的量):7ml 2XGrace's medium+140 μ 1的雙抗+7ml2%的高壓滅菌agarose膠+1. 4ml FBS，輕輕地混勻，然后將瓶再放置42°C水浴，病毒感染Ih后吸盡每孔中的病毒液，并快速用上述制備的覆蓋液覆蓋細胞。5)待瓊脂糖凝固后將六孔板用保鮮膜包好并置于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。6)加入Iml濃度為lmg/ml的中性紅，室溫孵育2小時后吸去染液，觀察到重組病毒形成的近似透明的小點即為空斑。計算統(tǒng)計觀察病毒空斑的形成情況(PFU)。用于放大培養(yǎng)重組桿狀病毒Bac-Ml，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HF-NA的細胞離心沉淀物，經(jīng)細胞裂解緩沖液處理后，4°C離心(13，OOOrpm) 10分鐘(或者將細胞在冰浴的情況下進行超聲波破碎)，收集上清液，進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析基質(zhì)蛋白Ml (或者NP、 HA、HF和NA蛋白)是否在昆蟲細胞Sf9中表達。簡單而言，將IOul上清液樣品中加入IOul 的2XSDS上樣緩沖液，100°C處理5min后，IOOOOrpm離心5分鐘，將所有20ul的上清樣品加入4%-12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠anvitrogen公司產(chǎn)品)的點樣孔中。設置電泳條件為恒定電壓100V，溫度為4°C，電泳時間約3小時。待指示液溴酚蘭接近凝膠底部時，停止電泳。凝膠置于R型考馬斯亮藍染色液中，搖晃染色1小時，然后置于脫色液中脫色過夜。實施例3 :MU NP、HA、HF和NA基因在共同轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞sf_9中的表達將200ml sf-9細胞混合液懸浮培養(yǎng)于1升體積的三角搖瓶中，細胞培養(yǎng)液為無血清的 sf-900II (或 hvitrigen 公司的 Grace insect medium)，搖床的搖速為 lOOrpm，溫度恒定于 27°C。當細胞濃度達到 2 X IO6 細胞 /ml 時，用 Bac-Ml、Bac-NP、Bac-HA-NA、Bac-HF-NA 昆蟲桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染sf9細胞。病毒的MOI比例為3 (Bac-Ml和Bac-NP) 1 (Bac-HA-NA) I(Bac-HF-NA)。轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)恒溫搖動培養(yǎng)3天后，收集所有樣品，4°C離心30分鐘，離速為3000rpm，收集上清液。離心下來的細胞沉淀物用細胞裂解液處理后，4°C離心10分鐘，離速10，000rpm。保留離心后的上清液。實驗進行的同時構(gòu)建合成的野生型昆蟲桿狀病毒用于轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的sf-9細胞，MOI為5。作為設置的陰性對照，轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)、樣品的收集及細胞裂解的條件與步驟與上述實驗一樣。收集的所有樣品，用于Western blots分析。其實驗操作如下每個樣品(包括陰性對照)分別取IOul的細胞裂解抽提液及細胞培養(yǎng)上清液，再各自加入IOul的2 X SDS上樣緩沖液。100°C處理5min后，將所有20ul的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔中。設置恒定電壓120V，溫度為4°C， 時間3小時，當藍色指示劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時，停止電泳，取出凝膠。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(PVDF膜)及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡5分鐘后與凝膠、 濾紙一起浸入預冷2小時以上的轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙——凝膠——硝酸纖維素膜——濾紙的順序安裝入轉(zhuǎn)印夾。將夾中靠近凝膠的一側(cè)接負極，恒壓25V轉(zhuǎn)移電泳Ih.用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而后轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉/PBS溶液中，搖蕩封閉1小時。用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入一塑料袋中， 加入:3ml以1 500稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中抗Hmi豬流感病毒雞源多克隆抗體(一抗)，置于4°C平緩搖動過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次10分鐘， 將此硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑料袋中，加入5ml以1 10000稀釋于5%脫脂奶粉/ PBS中的辣根過氧化物酶標記的驢抗雞IgG (二抗)，室溫下?lián)u動溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗后的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液，可見在各自相對應的分子量位置上，M1、NP、HA/HF和NA的特異性條帶，說明M1，NP，HA/ HF和NA在轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的SF-9昆蟲細胞中已經(jīng)有效地表達。實施例4 病毒樣顆粒的純化及間接免疫熒光檢測和電鏡觀察。將上述離心收集的細胞上清液裝入13ml的超速離心管內(nèi)，稱重、平衡、封管后，放入超速離心機(Bechmem公司產(chǎn)品)內(nèi)，4°C 100，OOOrpm離心1小時，然后取出離心管，小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4°C冰箱內(nèi)，溶解M小時。 次日，在另一個13ml的超速離心管內(nèi)，先小心地加入Iml 60%的庶糖溶液，然后依次加入 lml30%及;3ml20%的庶糖溶液，最后將5ml的溶解后的樣品液置于其上。精確稱重、平衡后，封管上超速離心機。4°C 100，OOOrpm離心1小時。取出離心管，分別收集位于20%與 30%及30%與60%濃度交界處的二條帶，即純化的病毒樣顆粒。Weatern blots分析純化濃縮后的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述實施例3中Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進行了稀釋，即Iul的病毒樣顆粒樣品，加入9ul的水，再加入IOul的2XSDS上樣緩沖液。100°C變性5min后，上樣入4% -12%聚丙烯酰氨凝膠樣品槽內(nèi)，Western blots 結(jié)果顯示，從這二條帶所獲得的大分子顆粒，的確是由M1、NP、HA/HF和NA構(gòu)成的病毒樣顆粒。尤其是從30%與60%濃度交界處取得的似病毒顆粒含量大，特異性條帶濃度深。說明轉(zhuǎn)染后，病毒樣顆粒在宿主細胞中有效地自我組裝，并釋放入細胞培養(yǎng)上清液中，進一步的間接免疫熒光實驗和電鏡結(jié)果證實了這一點(圖4、圖5)。間接免疫熒光實驗操作步驟如下將sf9細胞種到M孔板中，每孔10萬細胞，將VLP按照MOI = 3的感染復數(shù)對所種細胞進行感染，感染72小時后，用PBS將細胞洗滌3次， 每次5分鐘，然后加入100%預冷的甲醇-20°固定細胞10分鐘，在再加入0. 05%的Triton x-100室溫處理10分鐘，加入3%的BSA四度封閉過夜，第二天用PBS將細胞洗滌3次，每次5分鐘，然后向孔中加入RBITC標記的A型流感特異的Ml單克隆抗體，或者FITC標記的豬抗口蹄疫F的單抗，37°反應1小時，反應結(jié)束后用PBS將細胞洗滌3次，每次5分鐘，洗滌結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察。用抗Ml的單抗和F的單抗進行免疫電鏡觀察，可以看到熒光標記的病毒樣顆粒，其中抗Ml的抗體為RBITC標記，顯示橙色熒光(圖4A)，抗F的抗體為FITC標記，顯示綠色熒光(圖4C)，而對照沒有熒光信號((圖4B、D)。電鏡拍片實驗操作如下將少量的純化濃縮后的似病毒顆粒樣品固定處理后，置于新制備的無負荷的塑膠/碳包被網(wǎng)絡格上，用數(shù)滴蒸餾水輕輕沖洗幾次后，加上2%磷鎢酸鈉溶液進行負染色。電子透視顯微鏡下觀察并拍片，如圖5所示，病毒樣顆粒的外觀及體積大小相近。實施例5 =HlNl豬流感和豬口蹄疫二價VLPs免疫小鼠BALB/C小鼠購自中山大學動物實驗中心，各組免疫動物具體免疫實施方式見表
1。6-8周齡的SPFBALB/C小鼠在免疫3次后15天眼球取血，各組小鼠血清用來檢測IgG 抗體水平和HI抗體水平。Hmi豬流感IgG采用IDEXX公司Hmi流感抗體ELISA試劑盒檢測，口蹄疫IgG抗體采用馬靜云等000 方法檢測，用OD45tl值表示抗體水平。HI抗體檢測采用HI實驗參照甘孟侯(第二版，中國農(nóng)業(yè)出版社)進行。結(jié)果表明，Hmi豬流感和口蹄疫二價VLPs免疫6-8周齡BALB/C小鼠，免疫小鼠血清中既有抗Hmi豬流感的抗體(表
2、表3)，也產(chǎn)生了抗口蹄疫病毒的抗體(表3)。表IHmi豬流感和豬口蹄疫二價VLPs免疫BALB/C小鼠實驗方案
權(quán)利要求
1.混合病毒樣顆粒，其特征在于，包含流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml ；流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA ；一個融合膜蛋白，其包含豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中所述豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白是一種融合蛋白，其含有多個抗原肽段。
5.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQID N0:10所
6.豬流感和豬口蹄疫二價疫苗，其特征在于，包含如權(quán)利要求1-5所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。
7.制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達載體，其表達載體含有流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，或一個融合膜蛋白，其包含豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；用所述構(gòu)建的昆蟲桿狀病毒表達載體按比例同時感染昆蟲細胞，包裝出混合病毒樣顆粒，其表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白。
8.如權(quán)利要求6制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達載體還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
9.如權(quán)利要求6或7制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達載體還含有流感病毒的核蛋白NP，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的核蛋白NP。
全文摘要
本發(fā)明提供一種混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5’端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和豬口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣殼蛋白。本發(fā)明還提供豬流感和豬口蹄疫二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供制備混合病毒樣顆粒的方法。
文檔編號C12R1/93GK102370976SQ20101024865
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉大才, 曹永長, 薛春宜 申請人:中山大學