專利名稱：一種基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子檢測領域，具體地，本發(fā)明涉及一種基于懸浮芯片的多重固相擴 增檢測方法。
背景技術：
近10余年來，隨著現代分子生物學的迅猛發(fā)展，為臨床實驗室診斷提供了較為可 靠的核酸檢測方法，其中主要用到核酸分子雜交與核酸擴增兩種技術。核酸擴增技術的典 型代表是聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction, PCR)，該技術作為分子鑒別診斷 (molecular differential diagnoses,MDD)的基礎以其高效、快速的特點在病原體早期鑒 定中發(fā)揮重要的作用。并且該技術也在不斷的改良和創(chuàng)新以求更好的滿足準確和高效地進 行分子鑒別診斷和個體化醫(yī)療的需要。常規(guī)PCR技術在一次反應中僅能對一個基因片段進行擴增和分析，因此對于多基 因調控或由多病原體感染的疾病，如果采用常規(guī)方法，則要進行大量的反應，不僅工作量 大，耗時長，且可能耽誤控制疾病蔓延的時機。液相多重PCR是在常規(guī)PCR基礎上改進并發(fā)展起來的一項PCR技術。其基本原理 與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于液相多重PCR在同一個反應體系中，使用多對引物，對多個基因 同時進行擴增。由于該項技術具有能快速同時檢測多個基因以及節(jié)約試劑及器材等優(yōu)點， 已成功的應用于多種病原微生物的檢測，遺傳病及癌基因的分型鑒定以及實驗室的研究。 雖然理論上只需適當優(yōu)化PCR反應條件，就可以擴增多組目的片段，但是液相多重PCR遠比 常規(guī)PCR復雜，其反應體系的組成和反應條件往往受很多實驗因素影響，如引物之間的相 互作用，PCR緩沖液中各種鹽離子的濃度，Mg2+濃度和核苷酸濃度之間的平衡等。因此要建 立一個靈敏度高特異性強的液相多重PCR反應體系需要做大量的優(yōu)化工作。新開發(fā)的液相多重PCR 方法如 Tem-PCR(target enriched multiplex PCR)技術 等，在一定程度上解決液相多重PCR技術的問題，但仍然存在一些不足之處，如擴增時間較 傳統(tǒng)PCR長，靶基因的擴增和檢測尚未一體化等。針對于液相多重PCR的不足，固相橋式多重PCR技術以其獨特的優(yōu)勢逐漸發(fā)展起 來。所謂固相橋式多重PCR，是將特定的核苷酸引物通過共價連接固定在固相支持物上來擴 增目的DNA。該項技術的特點是將固相芯片上連接的引物根據模板延伸的核苷酸序列橋連 起來作為另一引物的模板，再循環(huán)擴增。該技術能消除多對引物之間的相互影響，也可避免 常規(guī)PCR擴增的一些干擾因素，如沒有引物二聚體的形成。因此固相橋式多重PCR在快速 基因分型、藥學基因組學以及疾病的分子診斷有廣泛的用途。而傳統(tǒng)固相橋式多重PCR由 于屬于固液相反應的原因，其擴增效率要明顯低于液相PCR，從而限制了其應用范圍。近年來隨著生物物理技術在分子生物學上的大量應用，新的核酸擴增模式也不斷 涌現。如介導等溫擴增法(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、鏈替代擴增 (SDA)、連接酶鏈式反應(LCR)和依賴核酸序列的擴增(NASBA)等，這些方法都具有很高的 靈敏度，但如何將這些方法應用到高通量的快速檢測是迫切需要解決的問題。
中國專利申請CN200910026137. 7公開了一種“編碼微球的制備方法”，并指出該 編碼的微球可以廣泛應用于DNA、RNA、蛋白質糖分子的檢測。
發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法。根據本發(fā)明的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法包括以下步驟1)制備帶有不同編碼的芯片，所述芯片在核酸擴增反應體系中呈懸浮或近懸浮狀 態(tài)；2)芯片表面修飾氨基，將每對特異性引物通過戊二醛的方式固定在各自被編碼的 芯片連接上；3)抽提制待檢測樣品的DNA或RNA，其中，各DNA或RNA樣品包含特異性擴增的片 段；4)以待檢測樣品的DNA或RNA、和上述固定有特異性引物的編碼芯片進行多重固 相擴增反應，并標記擴增產物；5)熒光檢測擴增產物，通過在暗場下觀察熒光的有無，判斷是否擴增，然后通過在 明場下觀察芯片圖形，判斷各擴增產物所對應的特異性片段。根據本發(fā)明的方法，帶有特征編碼芯片可在擴增反應體系中呈懸浮狀態(tài)，增加連 接在芯片上的引物與模板的結合機會，提高擴增效率。芯片材料包括二氧化硅、磁珠、聚丙 烯酰胺、聚苯乙烯，其大小在50nm 200 μ m，該芯片編碼方式包括形狀、大小、點陣、熒光比 例混合等，目的是將不同的芯片區(qū)分開，這樣可以在不同芯片上連接不同的探針。例如，選 用微片作為固相芯片，半導體微加工工藝在其表面制作出若干的方塊可作為編碼，每種編 碼的方塊排列不同，然后每種編碼的微片連接一對特異性引物，進行多重固相擴增，擴增產 物經標記后在熒光顯微鏡下觀察，首先在暗場觀察是否有陽性擴增結果，然后轉到明場，根 據圖形或熒光編碼判斷各編碼的微片所擴增到的靶標。根據本發(fā)明的方法，優(yōu)選以SiO2微片作為固相多重擴增的芯片，本發(fā)明的發(fā)明人 進一步研究發(fā)現，在以SiO2微片作為固相多重擴增的芯片時，其表面優(yōu)選以氨基修飾，使其 既能有效的將核酸引物穩(wěn)定的固定在芯片表面，也能保證固定的引物能夠耐受部分核酸擴 增反應中熱循環(huán)的溫度而不脫落，而羧基修飾效果卻不佳。根據本發(fā)明的方法，設計多對特異性檢測引物，特異性引物5’端基為氨基、巰基、 羧基等修飾。對于特定靶標(如已知的病原微生物)，本領域普通技術人員可以通過公知常 識、并結合現有技術設計其特異性引物。PCR反應結果可通過以下多種常規(guī)方法檢測(1) Sybergreen I檢測雙鏈DNA產物；(2)通過在PCR反應的過程中加入帶有地高辛、生物素和 放射性同位素標記的dNTP反應，并采用顯色法或化學發(fā)光法來檢測標記地高辛的擴增產 物，采用偶聯了酶或熒光物質的親和素(或鏈霉親和素)來檢測標記生物素的擴增產物，使 其顯色或產生熒光，以及采用放射自顯影來檢測放射性同位素標記的擴增產物；(3)通過 標有生物素或熒光分子如FITC、CY5、CY3、HEX、R0X、ALEXA FLUOR等探針雜交檢測，終產物可 選擇通過使用堿性磷酸酶(AP)耦聯的抗體，或通過檢測生物素或熒光信號檢測雜交結果。此外，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現采用以下優(yōu)化反應條件，可達到更好的檢測效果， 1、在固相擴增反應中，需將核酸等純化，這樣可以提高擴增效率；2在設計引物時，在每條引物增加一段8 15個Poly T，使得引物擁有合適的空間取向和運動靈活度；3采用生物 素來標記產物可起到放大信號的作用，而若采用熒光FITC標記則容易被淬滅。根據本發(fā)明的方法，可檢測多條目標DNA片段，或可將總RNA片段逆轉錄成DNA片 段，再進行多通量檢測。擴增方法包括PCR(聚合酶鏈式反應)、RT-PCR (反轉錄聚合酶鏈 式反應)、LCR(連接酶鏈式反應)、RCA (滾環(huán)擴增)、LAMP (環(huán)介導的核酸等溫擴增技術)、 NASBA(自主序列復制與依賴于核酸序列的擴增)、SPIA(單引物等溫擴增)、HAD(依賴解旋 酶的等溫擴增技術)、SDA (鏈替代擴增)、RIDA (快速等溫檢測放大技術)、NEMA (切刻內切 酶核酸恒溫擴增)。根據本發(fā)明的方法，制備編碼的微球或微片的方法可參考CN200910026137. 7。本發(fā)明將編碼的微球或微片技術應用于多重固相核酸擴增檢測方法，通過優(yōu)化檢 測方法中的步驟實現了兩種技術的組合。編碼的微小芯片在溶液中呈懸浮的狀態(tài)，可以大 大的提高芯片表面引物與溶液中分子的反應效率，解決固相擴增效率低的問題，達到高效 檢測的目的。同時，通過芯片的編碼，可確定擴增產物的類型，達到高通量檢測的目的。該方 法可適用于臨床檢測、公共衛(wèi)生防疫及流行病學調查、轉基因水稻的檢測、動物疫病診斷、 SNP分型等多個研究方向。本發(fā)明能同時高效檢測多個目的片段，根據本發(fā)明的方法只需要標記一種標記物 就可以實現多種擴增結果的判讀，且有效避免引物之間的干擾，防止二聚體的產生；重復 性、靈敏度和特異性高；整個方法操作簡單，不需要專業(yè)人員，在實際使用中有廣泛的應用 前景。
圖1新型固相多重PCR擴增原理；圖2氨基修飾芯片PCR擴增熒光顯影圖，圖2a為明場觀察結果，圖2b為暗場觀察 結果，圖2c為明暗場疊加結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本方法進行進一步的闡述，應理解，這些實例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講述的內容之后，本領域 技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。以中國專利申請CN200910026137. 7公開的方法制備SiO2微片。實施例1核酸固定方法的比較采用兩種方法固定核酸(一)采用3-氨丙基三甲氧基硅烷對微片表面進行氨基硅烷化，并通過戊二醛做 為“手臂分子”將氨基化的微片與5’氨基修飾核酸引物連接，固定核酸引物，并通過硼氫化 鈉等來封閉未反應的醛基。具體實驗步驟如下1、微球或微片震蕩充分，10000r/min離心lmin，棄上清，只到微球懸浮液呈中性，
置純水中保存。 2、加入6% APTES (溶劑95 %乙醇)250 μ 1，震蕩充分后超聲30s，震蕩30min， 10000r/min，離心lmin，棄上清，復加無水乙醇至lml。震蕩30s后，10000r/min，離心Imin,
棄上清，重復一次，再用PBS清洗2次。3、加入500yL的3%戊二醛(溶劑PBS)，超聲30s，室溫反應2hour，結束反應后， 用PBST (含0. 02%吐溫20)洗滌至無戊二醛。4、洗掉戊二醛后，離心管中加入100 μ M的探針2-3 μ 1，渦旋混勻IOmin直接加核 酸反應2hour。5、封閉醛基，(將多余的醛基封閉掉，減低背景)，50ml system (H2O 27.5ml; 20 X SSC 12. 5ml ；乙醇 10ml ；NaBH40. 65g)。6、將連有引物的球用于PCR檢測，模板為綠色熒光蛋白質粒DNA。PCR反應程序 為100°c熱蓋；94°C變性5min ；循環(huán)步驟為94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，進 行35個循環(huán)；最后72°C延伸5min，冷卻到16°C。 7熒光顯微鏡觀察，有擴增產物的芯片，由于擴增產物中標記的biotin能與熒光 標記的strepavidin反應，因此可清晰的檢測(如圖2所示)，而無擴增產物的芯片則無熒 光，通過明場和暗場的疊加，可清晰的判斷擴增產物的類別以及擴增量。( 二 )采用羧基芯片通過EDC交聯引物1、羧基微球 4μ 1 重懸在 Iml 0. IM MES(PH = 4. 5)中，震蕩充分，10000r/min， lmin，吸上清，重復1次2、棄上清，重懸于 50 μ L 0. IM MES (PH = 4. 5)，混勻；3、想各個離心管中加入100 μ M的探針2-3 μ 1，渦旋混勻IOmin ；4、加入 20 μ L 新鮮的 EDC (50mg/mL in EDC 0. IM MES, PH = 4. 5)；5、渦旋30min后，再加入EDC r印eat (EDC應該是可以過量的)重復四次，2hour ；6、沉淀珠子后，移走上層液體，加入1. Oml 0. 02% Tween 20，清洗2次；7、將連有引物的球用于PCR檢測，PCR反應程序為100°C熱蓋；94°C變性5min ；循 環(huán)步驟為94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，進行35個循環(huán)；最后72°C延伸5min， 冷卻到16°C
primersSequences (5，_3，)P1-T10-NH2TTTTTTTTTTGTGGATAGCGGTTTGACTCP2-T10-NH2TTTTTTTTTTCCTTGATGCCGTTCTTCT
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8、熒光顯微鏡觀察，結果無熒光。實驗結果表明采用戊二醛連接氨基修飾小球與核酸引物是比較穩(wěn)定的核酸連接 方式，能夠耐受PCR熱循環(huán)反應。實施例2金黃色葡萄球菌多重固相PCR檢測(1)檢測菌株包括 ATCC25923、TCC6538、CMCC26001、5H048、05I073、05K037、 05N074、05L198、05B008、05B012、05B033、05B038、05B041、05B059、05I056 ；(2)所有細菌菌株在37°C恒溫LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時后提取DNA，DNA提取 采用CTAB法；(3)通過NCBI以及發(fā)表文獻查找金黃色葡萄球菌的序列，并通過Primer Premier5. 0設計檢測的特異性引物，引物序列見表1，并將引物稀釋到100 μ M ；表1檢測金黃色葡萄球菌的擴增引物 (4)以SiO2微片作為固相多重PCR的芯片，并通過半導體微加工工藝在其表面制 作出若干的方塊可作為編碼，每種編碼的微片其表面上的方塊的排列不同，如圖2所示；(5)將5 10 μ L(10，000 50，000個)微片懸浮于純水中，加入6% APTES (溶 劑95%乙醇)250 μ L，震蕩充分后超聲30s,震蕩30min, 10000r/min,離心lmin,棄上清，復 加無水乙醇至lmL。震蕩30s后，10000r/min，離心lmin，棄上清，重復一次。再用PBS清洗 2次。(6)加入500μ 1的3%戊二醛(溶劑PBS)。超聲30s，室溫反應2hour，結束反應 后，用PBST (含0. 02 %吐溫20)洗滌至無戊二醛；(7)偶聯引物，約在4，000 10，000個每種編碼的微片中，分別加入一對引物各 5 10 μ 1 (濃度為10 μ Μ)，常溫下反應2小時，期間不斷渦旋及超聲；(8)連接過后，通過NaBH4封閉多余的醛基，減低背景，50mL體系包括(H2027. 5mL ； 20 X SSC 12. 5mL ；乙醇 IOmL ；NaBH40. 65g)；
(9)采用25 μ L的PCR體系，包括1 μ L模板DNA ；IU rTaq DNA聚合酶； 1 X TaqBuffer (200mM Tris-HCl (pH 8.4) ；200mM KCl ； IOOmM (NH4)2SO4)；濃度 LOmM 的 MgCl2 ；dNTP 混合液包括 0. 25mM dATP, dCTP, dGTP, ImM biotin-11-dTTP，1. 5mM dTTP ；連好 不同引物對的微片各1，000個；最后加入無菌水至25 μ 1體系。(10) PCR反應程序為100°C熱蓋；94°C變性5min ；循環(huán)步驟為94°C變性30s，54°C 退火30s，72°C延伸30s，進行35個循環(huán)；最后72°C延伸5min，冷卻到16°C。(11) PCR產物通過與1 μ L0. 5mg/mL的Alex標記的鏈霉親和素反應，通過熒光顯微 鏡檢測PCR產物。實施例3人副流感病毒的多重固相RT-PCR檢測(1)檢測病毒HPIV-I、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。病毒株在室溫條件下復蘇，取 200 μ L病毒液接種在生長有70%的LLC-MK2 (Rhesus monkey kidney cells)細胞的培養(yǎng) 板中。每天觀察細胞病變，直到CPE(cyt0pethic effect)出現，收獲培養(yǎng)液及細胞_70°C備 用；(2)來自感染細胞的病毒總RNA用德國QIAGEN公司的QIAamp Kit抽提，抽提方法 詳見說明書。200 μ 1細胞培養(yǎng)液被抽提，終產物RNA用50 μ 1 DEPC處理水洗脫，洗脫液放 置_70°C備用；(3)將總RNA反轉錄成cDNA是通過日本TAKARA公司的M-MLV RTasecDNASynthesis Kit完成，反轉錄方法具體見說明說。終產物20 μ 1 cDNATE Buffer 溶解；放置在-20°C ；(4)通過文獻資料來確定檢測的片段見表2表2人副流感病毒的多重RT-PCR的擴增引物 (5)以SiO2微片作為固相多重PCR的芯片，并通過半導體微加工工藝在其表面制 作出若干的方塊可作為編碼，每種編碼的微片其表面上的方塊的排列不同，如圖2所示；(6)將5-10 μ 1(10，000 50，000個)微片懸浮于純水中，加入6% APTES (溶劑 95%乙醇)250 μ 1，震蕩充分后超聲30s，震蕩30min，10000r/min，離心lmin，棄上清，復加 無水乙醇至lml。震蕩30s后，10000r/min，離心lmin，棄上清，重復一次。再用PBS清洗2 次。(7)加入500μ 1的3%戊二醛(溶劑PBS)。超聲30s，室溫反應2hour，結束反應 后，用PBST (含0. 02 %吐溫20)洗滌至無戊二醛；(8)偶聯引物，約在4，000 10，000個每種被編碼的微片中，分別加入一對引物各 5 10 μ L (濃度為10 μ Μ)，常溫下反應2小時，期間不斷渦旋及超聲；(9)連接過后，通過NaBH4封閉多余的醛基，減低背景，50ml體系包括(H2O 27. 5ml ； 20 X SSC 12. 5ml ；乙醇 IOml ；NaBH4O. 65g)；(10)采用25 μ 1的PCR體系，包括1 μ 1模板DNA ；IU rTaq DNA聚合酶； 1 X TaqBuffer (200mM Tris-HCl (pH 8.4) ；200mM KCl ； IOOmM (NH4)2SO4)；濃度 LOmM 的 MgCl2 ；dNTP 混合液包括 0. 25mM dATP, dCTP, dGTP, ImM biotin-11-dTTP，1. 5mMdTTP ；連好 不同引物對的微片各1，000個；最后加入無菌水至25 μ 1體系。(11) PCR反應程序為100°C熱蓋；94°C變性5min ；循環(huán)步驟為94°C變性30s，54°C 退火30s，72°C延伸30s，進行35個循環(huán)；最后72°C延伸5min，冷卻到16°C。(12) PCR產物通過與1 μ 10. 5mg/mL的Alex標記的鏈霉親和素反應，通過熒光顯微 鏡檢測PCR產物。
權利要求
一種基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)制備帶有不同編碼的芯片，所述芯片在核酸擴增反應體系中呈懸浮或近懸浮狀態(tài)；2)芯片表面修飾氨基，將每對特異性引物通過戊二醛的方式固定在各自被編碼的芯片連接上；3)分別制備多種待檢測樣品的DNA或RNA，其中，各DNA或RNA樣品包含每對特異性引物特異性地擴增的片段；4)以待檢測樣品的DNA或RNA、和上述固定有特異性引物的編碼芯片進行多重固相擴增，并標記擴增產物；5)熒光檢測所得的擴增產物，通過在暗場下觀察熒光的有無，判斷是否擴增得到特異性產物，然后通過在明場下觀察熒光的圖形，判斷各擴增產物所對應的待測樣品，其中，每種編碼芯片在明場在具有特征熒光或圖形。
2.根據權利要求1所述的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于，所述 芯片的材料為二氧化硅、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、磁性材料。
3.根據權利要求1、2或3所述的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于， 所述芯片的大小為50nm 200 μ m。
4.根據權利要求1所述的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于，芯片 的編碼方式包括形狀、大小、點陣、熒光比例混合。
5.根據權利要求1所述的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于，在每 條特異性檢測引物的3’末端增加一段8 15個Poly T。
6.根據權利要求1所述的基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法，其特征在于，擴增 產物以生物素來標記。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子檢測領域，具體地，本發(fā)明涉及一種基于懸浮芯片的多重固相擴增檢測方法。根據本發(fā)明的方法包括以下步驟1)制備帶有不同編碼的芯片；2)修飾芯片表面，將每對特異性引物分別固定在特定編碼的芯片連接上；3)分別制備多種待檢測樣品的DNA或RNA；4)進行多重固相擴增；5)熒光檢測擴增產物。本發(fā)明能同時高效檢測多個目的片段，且有效避免引物之間的干擾；重復性、特異性、靈敏度都較好；整個方法操作簡單，不需要專業(yè)人員，在實際使用中有廣泛的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101906476SQ201010242540
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權日2010年7月30日
發(fā)明者呂卓璇, 姜麗, 曹榕, 李炯, 段德民, 鮑芳 申請人:中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所