專利名稱：一種廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于寄生蟲病快速檢測(cè)技術(shù)中的一種廣州管圓 線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)最早是由我國(guó)著名的陳心陶教授 首次在廣州家鼠肺血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的。螺、蛞蝓是主要的中間宿主，人因進(jìn)食了含有廣州 管圓線蟲幼蟲的生或半生的螺肉而感染廣州管圓線蟲病，又稱嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦脊髓 膜炎。廣州管圓線蟲幼蟲主要侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)為腦膜和腦炎、脊髓膜炎和脊髓 炎，可使人致死或致殘。臨床主要癥狀為急劇的頭痛，甚至不能受到任何震動(dòng)，走路、坐下、 翻身時(shí)頭痛都會(huì)加劇，伴有惡心嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直、活動(dòng)受限、抽搐等癥狀，重者可導(dǎo)致癱瘓、 死亡。診斷治療及時(shí)的情況下，絕大多數(shù)病人預(yù)后良好。極個(gè)別感染蟲體數(shù)量多者，病情嚴(yán) 重可致死亡，或留有后遺癥。廣州管圓線蟲病廣泛流行于我國(guó)臺(tái)灣、廣東、浙江、黑龍江等 地，近年來在北京、浙江溫州、福建等地均有爆發(fā)流行，嚴(yán)重危害人體健康，應(yīng)引起廣泛的重 視。廣州管圓線蟲感染常用的檢測(cè)方法包括病原學(xué)檢查和免疫學(xué)診斷，病原學(xué)檢查主 要是腦脊液中查廣州管圓線蟲蟲體，但概率很小。從我國(guó)目前的病例統(tǒng)計(jì)看，病原檢出率僅 為4. 8% ；免疫學(xué)診斷方法中的抗體檢測(cè)特異性不高，不能區(qū)分現(xiàn)癥和既往感染，與其他寄 生蟲存在著交叉反應(yīng)，而抗原的檢測(cè)雖然特異性較強(qiáng)，但敏感性不高。為有效控制廣州管圓 線蟲病，需要建立高度敏感、特異和簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有極高的靈敏 度和特異性，并已應(yīng)用于多種寄生蟲病的診斷，但PCR需要精密儀器的配套使用，無法滿足 基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。Notomi T等在2000年開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)媒恒溫?cái)U(kuò)增 法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)，胃 HC iH 禾O ffl Bst (Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)引物(FIP 由FlC和F2組成；BIP由BlC和B2組成)、外引物(F3和B3)，特異地識(shí)別靶序列上的6個(gè) 獨(dú)立區(qū)域，在等溫條件下進(jìn)行靶序列高效快速擴(kuò)增。LAMP技術(shù)從2003年開始逐步用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)，目前主要是應(yīng)用于病原微生物的檢 測(cè)和傳染性疾病的診斷，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測(cè)廣州管圓線蟲18s rRNA基因目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚無報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)廣州管圓線 蟲高靈敏度、高特異性的檢測(cè)方法，使其操作簡(jiǎn)便、成本低廉，結(jié)果易于觀察，適用于廣州管 圓線蟲的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本發(fā)明是根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)原理，針對(duì)廣州管圓線蟲的特異性片段設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，利用BstDNA酶的鏈置換特性，在等溫條件下生成 大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)擴(kuò)增廣州管圓線蟲18s rRNA基因的4條特異性引物FIP :5’ -CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3，BIP :5’ -GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3，F(xiàn)3 :5’ -TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’B3 5' -CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’提取樣品DNA后，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)體系擴(kuò)增靶DNA，LAMP檢測(cè)體系由 一套設(shè)計(jì)的引物、10XLAMP反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成，并對(duì) LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，特異性和重復(fù)性檢驗(yàn)證實(shí)該方法可靠性強(qiáng)。本發(fā)明的廣州管圓線蟲LAMP檢測(cè)試劑包括LAMP反應(yīng)液，與4條LAMP引物共同構(gòu) 成LAMP檢測(cè)體系，25 μ 1 LAMP檢測(cè)體系的具體配置為25ul LAMP反應(yīng)體系的具體配置
F3、B30. 1 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反應(yīng)緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer
鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜堿betaine1. 0 1· 6M
本發(fā)明所述廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，反應(yīng)條件為63°C恒溫60分
鐘，80°C 5分鐘終止反應(yīng)。由于LAMP的擴(kuò)增效率非常高，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂，可直接通過肉眼觀察是否有 白色的焦磷酸鎂沉淀來判斷是否生成焦磷酸離子，出現(xiàn)白色沉淀為陽性結(jié)果，未出現(xiàn)白色 沉淀為陰性結(jié)果。或者通過SYBR Green I染色劑顏色變化來判斷靶基因是否存在，反應(yīng)后 的混合液中加入染色劑SYBR Green-Ι,出現(xiàn)綠色的為陽性結(jié)果，橙色的是陰性結(jié)果。另一種檢測(cè)結(jié)果的方法是取反應(yīng)后的混合液2 μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍(lán)上樣緩沖 液，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為ΙΟΟν，時(shí)間為30min，溴化乙錠(EB)染色后在紫外燈 下觀察，出現(xiàn)梯度條帶為陽性結(jié)果，如未出現(xiàn)則為陰性結(jié)果。本發(fā)明在定性檢測(cè)時(shí)可不需任何特殊設(shè)備。該方法與常規(guī)檢測(cè)方法相比，具有操 作簡(jiǎn)便快速、敏感特異、無需特殊儀器、檢測(cè)時(shí)間比普通PCR短等特點(diǎn)，適合于廣州管圓線 蟲病現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
1、圖1是LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的敏感性試驗(yàn)，采用SYBR Green I染色方法檢 測(cè)。1)是陰性對(duì)照，2)陽性對(duì)照，3)是IOOpg模板DNA，4)是IOpg模板DNA，5)是Ipg模板 DNA, 6)是 IOOfg 模板 DNA，7)是 IOfg 模板 DNA，8)是 Ifg 模板 DNA，9)是 0. Ifg 模板 DNA， 10)是O.Olfg模板DNA。從結(jié)果可看出，LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的最低檢測(cè)量是lfg。2、圖2是LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的敏感性試驗(yàn)，采用電泳方法檢測(cè)。1)是DNA 標(biāo)志物DL2000，2)是陰性對(duì)照，3)是陽性對(duì)照，4)是IOOpg模板DNA，5)是IOpg模板DNA，
46)是 Ipg 模板 DNA，7)是 IOOfg 模板 DNA，8)是 IOfg 模板 DNA，9)是 Ifg 模板 DNA，10)是 0. Ifg模板DNA，11)是0. Olfg模板DNA。從結(jié)果可看出，LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的最低檢 測(cè)量是lfg。3、圖3是LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的特異性試驗(yàn)，采用SYBR Green I染色方法檢 測(cè)。1)是陰性對(duì)照，2)是廣州管圓線蟲DNA樣本，3)是瘧原蟲DNA樣本，4)是弓形蟲DNA 樣本，5)是血吸蟲DNA樣本，6)是異尖線蟲DNA樣本。從結(jié)果可看出，廣州管圓線蟲樣本顯 示為陽性，其他樣本均為陰性，表明與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)。4、圖4是LAMP檢測(cè)廣州管圓線蟲的特異性試驗(yàn)，采用電泳方法檢測(cè)。1)是DNA標(biāo) 志物DL2000，2)是陰性對(duì)照，3)是廣州管圓線蟲DNA樣本，4)是瘧原蟲DNA樣本，5)是弓形 蟲DNA樣本，6)是血吸蟲DNA樣本，7)是異尖線蟲DNA樣本。從結(jié)果可看出，廣州管圓線蟲 樣本顯示為陽性，其他樣本均為陰性，表明與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。如無特別指明，實(shí)驗(yàn)所用的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；BstDNA聚合 酶(大片段購(gòu)自New England公司；甜菜堿(Betaine)、Mg2+購(gòu)自SIGMA公司。實(shí)施例一、特異性DNA序列查找從美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)-GENBANK檢索獲得廣州管圓線蟲18s rRNA基因序列，登錄號(hào) 為AY295804. 1，針對(duì)該保守靶序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，該特異性靶序列為1attaagccatgcatgaggagttcagctttaagtgaaactgcgaacggctcattagagcag
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二、引物的設(shè)計(jì)
LAMP方法中的引物設(shè)計(jì)是LAMP法實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的關(guān)鍵所在，應(yīng)用PrimerExplorerV3
軟件設(shè)計(jì)引物。LAMP擴(kuò)增的靶序列長(zhǎng)度控制在300bp以下，LAMP最少需要4條引物，分別 是正向內(nèi)引物FIP，由F2區(qū)段(與靶基因F2c區(qū)段完全互補(bǔ))和Flc區(qū)段(同靶基因3’末 端的Flc序列相同)組成；正向外引物F3(與靶基因F3c區(qū)段完全互補(bǔ))；反向內(nèi)引物BIP， 由B2區(qū)段(與靶基因3’末端的B2c區(qū)段完全互補(bǔ))和Blc區(qū)段(同靶基因3’末端Blc 序列完全相同)組成；反向外引物B3(與靶基因B3c區(qū)段完全互補(bǔ))。各區(qū)段的設(shè)計(jì)規(guī)則 與PCR相同。內(nèi)引物長(zhǎng)度通常超過40個(gè)堿基，外引物為20個(gè)堿基左右。除了引物的長(zhǎng)度、 堿基組成外，需要考慮引物與靶序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)等。三、LAMP1、廣州管圓線蟲基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)室建立廣州管圓線蟲的動(dòng)物感染模型。使 用Takara公司的基因組提取試劑盒提取廣州管圓線蟲的基因組DNA，分光光度分析A260/ A280 > 1. 8，為檢測(cè)體系提供模板，-80°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?、LAMP反應(yīng)的條件反應(yīng)體系包括引物FTP、BIP、F3、B3 ；dNTP、Mg2+、鏈置換型DNA聚合酶(BstDNA polymerase)、Betaine、核酸模板，終體積25 μ 1。LAMP反應(yīng)在60 65°C恒溫條件下進(jìn)行。 最佳反應(yīng)條件因引物的效率和模板DNA質(zhì)量變化而不同，因此通過比較試驗(yàn)確定最佳反應(yīng) 時(shí)間、反應(yīng)溫度和試劑濃度。每個(gè)反應(yīng)設(shè)立陰性與陽性對(duì)照。3、反應(yīng)的敏感性、特異性分析將廣州管圓線蟲基因組DNA梯度稀釋后進(jìn)行LAMP檢測(cè)，由最低DNA檢出量分析反 應(yīng)的敏感性，由圖1，圖2可知，LAMP方法的最低檢測(cè)量為Ifg ；以廣州管圓線蟲、瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、異尖線蟲等五種寄生蟲核酸為模板檢 測(cè)體系的特異性。LAMP檢測(cè)體系的特異性良好，與瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、異尖線蟲DNA沒 有交叉反應(yīng)，可以特異性地檢測(cè)廣州管圓線蟲，參見圖3，圖4。4、LAMP反應(yīng)的鑒定分析(1)直接觀察LAMP反應(yīng)中核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng) 溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂白色沉淀。它有極高的特異性，可以用肉眼觀察 或濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管中的沉淀濁度判斷擴(kuò)增與否。
6
(2)顯色反應(yīng)直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBR Green-I，無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈 橙色，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。(3)瓊脂糖凝膠電泳取反應(yīng)后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在 2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為ΙΟΟν，時(shí)間為30min。EB染色劑染色后在紫外燈下觀察。 LAMP反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生各種片斷長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在電泳圖譜中顯示為從點(diǎn)樣孔 處開始的拖尾條帶現(xiàn)象。5、根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，確定了最佳的LAMP檢測(cè)體系，在實(shí)際操作中可以存在一定的浮 動(dòng)范圍，具體如下F3、B30. 1 ~ 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反應(yīng)緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer
鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜堿betaine1. 0 1· 6M
權(quán)利要求
一種廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)恒溫核酸擴(kuò)增方法的技術(shù)原理，針對(duì)廣州管圓線蟲的特異性片段設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，利用BstDNA酶的鏈置換特性，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)擴(kuò)增廣州管圓線蟲18s rRNA基因的4條特異性引物為FIP5’ CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG 3’BIP5’ GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT 3’F35’ TTGTCGAGGAGCTTCCCG 3’B35’ CACCAACTAAGAACGGCCAT 3’提取樣品DNA后，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)體系擴(kuò)增靶DNA，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)體系由一套設(shè)計(jì)的引物、10×LAMP反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成，并對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于四條 LAMP引物的廣州管圓線蟲LAMP檢測(cè)試劑，還包括LAMP反應(yīng)液，與四條LAMP引物共同構(gòu)成 LAMP檢測(cè)體系，25 μ 1 LAMP檢測(cè)體系的具體配置為F3、B30· 1 0· 2μΜF(xiàn)IP, BIP1· 2 1· 6μΜdNTP1· 4 2. 8mMMg2+6 16mM反應(yīng)緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U甜菜堿 betaine1. O 1. 6M
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于所述試 劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為63°C恒溫60分鐘，80°C 5分鐘終止反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增結(jié) 果的檢測(cè)可以直接觀察反應(yīng)混合液中是否出現(xiàn)白色沉淀，出現(xiàn)白色沉淀為陽性結(jié)果，未出 現(xiàn)白色沉淀為陰性結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)后 的混合液中加入染色劑SYBR Green-Ι,出現(xiàn)綠色的為陽性結(jié)果，橙色的是陰性結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的廣州管圓線蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，另一 種檢測(cè)結(jié)果的方法是取反應(yīng)后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%的瓊 脂糖凝膠中電泳，電壓為100伏，時(shí)間為30分鐘，溴化乙錠(EB)染色劑染色后在紫外燈下 觀察，出現(xiàn)梯度條帶為陽性結(jié)果，如未出現(xiàn)則為陰性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于寄生蟲病快速檢測(cè)技術(shù)中的一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)廣州管圓線蟲的方法。該方法包括兩對(duì)用于檢測(cè)廣州管圓線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物FIP、BIP、F3與B3，和一種利用上述兩對(duì)引物檢測(cè)廣州管圓線蟲的LAMP方法，其中包括反應(yīng)模板的制備、LAMP反應(yīng)體系、LAMP反應(yīng)程序和檢測(cè)結(jié)果判斷。其操作簡(jiǎn)便、成本低廉，結(jié)果易于觀察，非常適用于廣州管圓線蟲的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101899521SQ20101024223
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者卓敏敏, 張儀, 樓滌, 童群波, 陸紹紅, 陳睿 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所