專利名稱：人骨髓多能干細胞的體外擴增和向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體涉及干細胞及細胞定向誘導分化領域，是一 種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，以及人骨髓多能干細胞定向高效安全地分化為多巴 胺能神經(jīng)元樣細胞的方法。
背景技術：
帕金森病 Parkinson，s Disease(PD)，由 James Parkinson 醫(yī)生于 1817 年發(fā)現(xiàn) 并命名，是一種慢性退行性神經(jīng)疾病，老年人發(fā)病居多，目前在全世界人口中，超過1 %的 55 歲以上老年人患有中白金森癥(Betarbet, R. ，T. B. Sherer, and J. Τ. Greenamyre, Animal models of Parkinson' s disease. Bioessays,2002. 24(4) :p. 308-18. Zhen-Xin Zhang, Gwendolyn E P Zahner,Parkinson's disease in China-prevalence in Beijing,Xian, and Shanghai. Lancet 2005 ；365 =595-97.)。帕金森癥的病理機制主要與大腦中腦黑質(zhì)部 位的多巴胺(Dopamine，簡稱DA)能神經(jīng)元進行性損傷有關，DA神經(jīng)元損傷引起多巴胺逆 軸突轉運減少，從而導致中腦黑質(zhì)與紋狀體間神經(jīng)聯(lián)系減少，產(chǎn)生一系列的運動功能障礙， 同時，PD患者黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)會出現(xiàn)lewy bodies。臨床上以靜止性震顫、肌肉強直、運動遲 緩為主要表現(xiàn)。帕金森癥中所缺乏的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺DA，已經(jīng)被研究得很深入，其主要作 用就是神經(jīng)系統(tǒng)的行為控制，以及控制大腦的情欲、感覺、興奮、開心等感覺，另外，多巴胺 還與成癮性有關。目前對于帕金森癥的治療手段就是藥物替代療法，常用藥物為左旋多巴。 但是必須指出，應用左旋多巴會導致一系列副作用，例如常見的胃腸道以及血管系統(tǒng)的不 良反應，長期應用更會導致一些神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如虛弱，不自主運動，開關現(xiàn)象等以及精神 行為異常。鑒于帕金森病目前社會影響較大，并且目前療法急需改進，而最重要的是它是由 單一種類細胞功能受損而引起的疾病，所以非常適合使用干細胞移植療法進行治療。干細胞治療需要合適的種子細胞，并把種子細胞培養(yǎng)獲得適合移植使用的目標 細胞，即多巴胺能神經(jīng)元樣細胞。目前研究使用的胚胎干細胞(Embryonic stem cell，簡 稱ESC)，是最早被分離得到的多能干細胞，體外培養(yǎng)可保持穩(wěn)定增殖能力，具有向多個胚 層方向分化的潛能，并且，ESC體外向DA神經(jīng)元分化已有報道(Buytaert-Hoefen，K. Α.， Ε.Alvarez, and C. R. Freed, Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells, 2004. 22(5) :p. 669-74.)。但是胚胎干細胞一般是來 自于異源性組織的細胞，有免疫排斥的風險。雖然已經(jīng)有成體細胞核移植獲得的ESC， 即SCNT-ES，可避免免疫排斥反應，但依然存在在體內(nèi)有形成畸胎瘤的風險，并且ESC的 倫理學爭議較多。神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，簡稱NSC)，一般是來自于胚腦神經(jīng) 組織得到的，體外也可分化為大腦中幾乎所有類型的神經(jīng)元，包括DA神經(jīng)元(Lie，D. C.， et al. ， The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. J Neurosci，2002. 22 (15) :p. 6639-49.)。但是神經(jīng)干細胞相比胚胎干細胞分化潛能低，單一譜系方向分化效率也較低，同時來源有限，且有倫理學爭議。近來，誘導性 多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，簡稱IPS)的發(fā)現(xiàn)，使干細胞的應用范圍 進一步擴大，IPS具有與胚胎干細胞相類似的全能性，且細胞可來自于自體，體外分化為DA 神經(jīng)兀也有 艮道(Lewitzky, M. and S. Yamanaka，Reprogramming somatic cells towards pluripotency by defined factors. Curr Opin Biotechnol,2007.18(5) :p· 467-73·)。但 IPS在具有全能性的同時，體內(nèi)也有形成畸胎瘤的風險，并且，IPS誘導過程中所導入的外 源基因包括多能性基因以及載體序列對細胞影響的仍未明確。干細胞分化誘導方法目前已經(jīng)使用的已有多種，使用不同的細胞因子和誘導劑， 包括堿性成纖維細胞生長因子bFGF，表皮生長因子EGF，神經(jīng)生長因子NGF，腦源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子BDNF，膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF，成纖維生長因子8FGF-8，超音速刺猬因子 SHH等，同時培養(yǎng)基質(zhì)也不同。上述這些因子均與神經(jīng)營養(yǎng)或發(fā)育或分化有不同程度的相關 性，但還沒有明確證據(jù)和報道。自體組織中，骨髓中含有多能干細胞已被多次報道，且有多例臨床報道骨髓干細 胞移植可幫助治療其他非造血系統(tǒng)疾病。同時，骨髓干細胞惡性轉化僅有體外實驗報道， 體內(nèi)實驗尚未見惡性轉化。骨髓中目前已經(jīng)分離得到的干細胞包括HSC，MSC, MAPC, MIAMI 等，其中，MSC，MAPC，MIAMI等均具有向多個胚層方向分化的潛能。MAPC體外可分化為中腦 神經(jīng)元樣細胞，并表達相關標記物，不過，MAPC誘導得到的神經(jīng)元分化效率較低，且僅表達 初級分化標記物，無功能性(Jiang, Y, et al. , Neuroectodermal differentiation from mouse multipotent adult progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A,2003. lOOSuppl 1 :p. 11854-60.)。MSC向DA神經(jīng)元方向分化也有報道，全骨髓培養(yǎng)得到的MSC，在體外合適 條件和誘導因子作用下，可分化為表達DA神經(jīng)元標記物TH的神經(jīng)元樣細胞，并具有一定的 電生理活性(Trzaska，K. Α.，Ε. V. Kuzhikandathi 1, and P· Rameshwar，Specification of a dopaminergic phenotype from adult human mesenchymal stem cells. Stem Cells， 2007. 25(11) :p. 2797-808.)。但是，MSC是來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞，其細胞成分復雜， 自我更新能力較低，同時，MSC體外增殖能力一般，其后續(xù)應用于臨床細胞治療也受到限制。綜上所述骨髓中存在具有多能性的干細胞，且骨髓來源干細胞體外可向DA neuron方向分化，所以有必要培養(yǎng)一種比較純化的骨髓多能干細胞，并探索其向DA神經(jīng)元 定向分化的條件和相關機制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決細胞移植治療過程中出現(xiàn)的免疫排斥等不良反應，提高干 細胞用于臨床治療的可行性，提供一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法。本發(fā)明采用人骨髓來源的多能干細胞作為種子細胞，采用了低血清和低密度培 養(yǎng)，增加了干細胞體外的自我穩(wěn)定性，降低了接觸抑制效應，同時添加不同種類的營養(yǎng)因子 和細胞增殖刺激因子。該種培養(yǎng)方式獲得的干細胞可以在體外大量擴增，可傳代至20代， 倍增次數(shù)達到40次，表達0ct4，Sox2, Nanog等多能性基因，表達干細胞表面標記物⑶29， ⑶44，⑶106，等，體外可向三個胚層來源的細胞分化，具有多潛能分化性。本發(fā)明提供了一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法以lOOng/ml FN處理培養(yǎng) 皿底，擴增培養(yǎng)基成分包括DMEM(60%),MCDB(40% ), ITS(1 % ),LA(4. 7ug/ml)，LAA(IuM)，HSA(lmg/ml)，Pen/Strep (1% ) ,FBS(2% ), Dex (InM)，EGF(lOng/ml)，PDGF(lOng/ml)共 11 中成分，從人體骨髓中獲得多能干細胞，培養(yǎng)過程采用克隆化的純化方式，從而獲得可穩(wěn)定 增殖20代以上的骨髓多能干細胞。本發(fā)明的另一目的在于提供人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細胞定向分 化的方法。人骨髓多能干細胞體外誘導向多巴胺能神經(jīng)元分化過程中， 采用分期誘導法，第 一期維甲酸加bFGF共同誘導7天，第二期SHH因子誘導14天后可以大幅提高骨髓多能干細 胞體外分化為多巴胺能神經(jīng)元的效率，表達多巴胺能神經(jīng)元的特異性標記物Tujl，Nurrl, ΤΗ, NeuN等。流式檢測表明誘導后多巴胺能神經(jīng)元標記物TH陽性率可達到70%左右。本發(fā)明還提供了一種人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細胞定向分化的方 法在低密度培養(yǎng)(匯合度< 30% )時，采用分期誘導法，第一期采用基礎培養(yǎng)基+bFGF+RA 誘導7天，第二期采用Neurabasal+SHH因子誘導14天，整個過程約21天即3周以上時 間。基礎培養(yǎng)基成分包括:DMEM (60% ), MCDB (40% ),ITS(1% ),LA (4. 7ug/ml)，LAA (IuM)， HSA(lmg/ml),Pen/Strep (1 % ),Dex (InM) 誘導成分bFGF 100ng/ml,RA IOnM, SHH250ng/ ml。本發(fā)明獲取人骨髓來源的多能干細胞的方法可用于細胞移植治療方面本發(fā)明誘導人骨髓來源的多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分化的方法可用于 帕金森病治療方面。
圖1為相差顯微鏡觀察原代和克隆化培養(yǎng)后的骨髓多能干細胞(10X20)其中A 原代培養(yǎng)，仍有血細胞漂浮，細胞形態(tài)不一 ；B 克隆化培養(yǎng)后細胞更為純 化，形態(tài)均一。圖2為PCR檢測克隆化培養(yǎng)后的骨髓多能干細胞表達多能性基因0ct4，Sox2, Nanog的凝膠電泳圖。圖3為流式細胞儀檢測克隆化培養(yǎng)后的骨髓多能干細胞表面標記物的表達的流 式圖。圖4為免疫熒光檢測第一期誘導后多能性基因表達變化的熒光圖。其中第一期誘導后0ct4表達下降，a 誘導分化前0ct4(紅色)，A 一期誘導分化 后0ct4表達(紅色)；而Sox2表達升高，b 誘導分化前Sox2 (綠色)，B —期誘導分化后 (綠色)。DAPI襯染細胞核(藍色)。結果表明骨髓多能干細胞開始向神經(jīng)細胞方向分化。圖5為RT-PCR檢測第二期誘導分化過程中相關基因Nurrl，Ptx3的凝膠電泳圖。圖6為免疫熒光檢測分期誘導后多巴胺能神經(jīng)元相關標記物Tau，NestinNeuNJH 和Tujl的熒光圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1 人骨髓多能干細胞的體外擴增1、骨髓多能干細胞的原代培養(yǎng)
采用臨床患者自體來源的骨髓，對其進行PBS沖洗2次，使用4°C預冷的0. 16M Tris-NH4C1破紅處理5mins，1000轉/分離心5mins，去除裂解后紅細胞，PBS洗去多余的 Tris-NH4Cl,加入少量擴增培養(yǎng)基均勻分散后，剩余單個核細胞置于lOOng/ml FN纖連蛋白 預先處理過的細胞培養(yǎng)皿底部。CO2培養(yǎng)箱(飽和濕度；95% air-5% C02 ；37°C )中培養(yǎng)3 天后全量換液，PBS洗去除懸浮未貼壁細胞，以后每3d半量換液1次，約IOd左右達100% 匯合后，0.25% Trypsin-EDTA消化成單細胞懸液，1 2進行傳代，采用相同的培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)。擴增培養(yǎng)基成分如下
權利要求
一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于采用人體骨髓，加入擴增培養(yǎng)基均勻分散后，剩余單個核細胞以100ng/ml纖連蛋白處理培養(yǎng)皿底，采用克隆化的純化方式，獲得可穩(wěn)定增殖20代以上的骨髓多能干細胞，所述的擴增培養(yǎng)基成分由60％的DMEM、40％的MCDB、1％的ITS、4.7ug/ml LA、luM的LAA、1mg/ml的HAS、1％的Pen/Strep、2％的FBS、lnM的Dex、10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于該方法具體 步驟如下A、骨髓多能干細胞的原代培養(yǎng)采用患者自體來源的骨髓，對其進行PBS沖洗2次，使用4°C預冷的0. 16MTris-NH4Cl 破紅處理5mins，1000轉/分離心5mins，去除裂解后紅細胞，PBS洗去多余的Tris-NH4Cl, 加入少量擴增培養(yǎng)基均勻分散后，剩余單個核細胞置于lOOng/ml纖連蛋白預先處理過的 細胞培養(yǎng)皿底部；CO2培養(yǎng)箱(飽和濕度；95% air-5% C02 ；37°C )中培養(yǎng)3天后全量換液， PBS洗去除懸浮未貼壁細胞，以后每3d半量換液1次，約IOd左右達100%匯合后，0. 25% Trypsin-EDTA消化成單細胞懸液，1 2進行傳代，采用相同的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；擴增培養(yǎng)基成分如下
3、根據(jù)權利要求1或2所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于獲得的 人骨髓多能干細胞采用分期誘導法，第一期維甲酸加bFGF共同誘導7天，第二期SHH因子 誘導14天，定向分化成多巴胺能神經(jīng)元樣細胞。
4、根據(jù)權利要求1或2所述的人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，其特征在于獲得的 人骨髓多能干細胞，在匯合度< 30%低密度培養(yǎng)時，采用分期誘導法，第一期采用基礎培養(yǎng) 基 +100ng/ml 的 bFGF+ΙΟηΜ 的 RA 誘導 7 天，第二期采用 Neurabasal+250ng/ml 的 SHH 因子 誘導14天，所述的基礎培養(yǎng)基成分由60 %的DMEM、40 %的MCDB、1 %的ITS、4. 7ug/ml的LA、IuM的LAA、lmg/ml的HAS、1 %的Pen/Str印和InM的Dex組成，定向分化成多巴胺能神經(jīng) 元樣細胞。
5.一種人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細胞定向分化的方法，其特征在于采用 分期誘導法，第一期維甲酸加bFGF共同誘導7天，第二期SHH因子誘導14天。
6.根據(jù)權利要求5所述的人骨髓多能干細胞向多巴胺能神經(jīng)元樣細胞定向分化的方 法，其特征在于在匯合度< 30%低密度培養(yǎng)時，采用分期誘導法，第一期采用基礎培養(yǎng)基 +100ng/ml 的 bFGF+ΙΟηΜ 的 RA 誘導 7 天，第二期采用 Neurabasal+250ng/ml 的 SHH 因子誘 導14天，所述的基礎培養(yǎng)基成分由60%&DMEM、40%&MCDB、l%m ITS、4. 7ug/ml的LA、 IuM 的 LAA、lmg/ml 的 HAS、1 % 的 Pen/Str印和 InM 的 Dex 組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細胞及細胞定向誘導分化領域。帕金森病可使用細胞移植療法進行治療，治療難點在于合適的干細胞細胞來源及穩(wěn)定誘導干細胞分化的條件。骨髓是自體干細胞的重要來源，對骨髓中混雜細胞進行分離和純化培養(yǎng)，獲得骨髓來源的多能干細胞，并摸索其向多巴胺能神經(jīng)元的分化條件，對于帕金森病的臨床治療具有重大意義。本發(fā)明提供一種人骨髓多能干細胞的體外擴增方法，使用多種培養(yǎng)成分作為培養(yǎng)基和克隆化培養(yǎng)方法，從人骨髓中獲得多能干細胞，體外可穩(wěn)定增殖，表達相關多能性標記物。本發(fā)明還提供了人骨髓多能干細胞定向高效安全地分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細胞的方法。經(jīng)過RA+bFGF和SHH因子分期誘導法誘導分化兩個周期后，該骨髓來源的多能干細胞可體外向DA神經(jīng)元樣細胞分化。
文檔編號C12N5/0775GK101935635SQ20101024190
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權日2010年7月30日
發(fā)明者劉厚奇, 范力星 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學