專利名稱：一種橙色紅曲霉的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種微生物，具體涉及一種能夠產(chǎn)酯化酶，從而提高白酒中酯類物質(zhì) 的含量的橙色紅曲霉。
背景技術(shù)：
濃香型大曲酒發(fā)酵屬于多種微生物群的共同發(fā)酵，是一個復雜的生物化學反應體 系。研究發(fā)現(xiàn)，濃香的來源及香型的形成離不開窖泥中厭氧微生物的作用，老窖泥中的己酸 菌是形成濃香型曲酒的主要功能菌，由它們發(fā)酵產(chǎn)生的己酸、丁酸和醋酸與窖內(nèi)酒醅中的 乙醇，在微生物酯化酶作用下，通過酯化反應生成相應的酯，是濃香型酒香味的主要成份， 也是產(chǎn)生濃香的主要來源。濃香型大曲酒以己酸乙酯為主體香味物質(zhì)，己酸乙酯的含量直接影響大曲酒的質(zhì) 量。它來源于棲息在窖泥中梭狀芽孢桿菌-己酸菌所產(chǎn)己酸與酒醅中酵母產(chǎn)生的乙醇的 化合。己酸與乙醇的合成反應不是一個簡單的化學反應，它是由存在于大曲和酒醅中的一 種酶——酯化酶作用的結(jié)果。己酸和乙醇在酯化酶作用下合成己酸乙酯是己酸乙酯合成的 主要途徑。而酯化酶則是大曲微生物的代謝產(chǎn)物，酯化酶在大曲中含量多少決定了大曲的 質(zhì)量。一般生產(chǎn)條件下，發(fā)酵糟內(nèi)微生物所產(chǎn)酯酶的活力不高，醇、酸等反應底物濃度較低， 酯化反應速度緩慢，限制了己酸乙酯等主體香味含量增加。大曲中的有益微生物菌群如產(chǎn) 酯酵母、酒精酵母等微生物類群不穩(wěn)定，數(shù)量、量比關(guān)系不固定等缺陷也十分明顯。如果使 用純種紅曲，與不同對象配合，用于提高出酒率和優(yōu)質(zhì)率，按一定比例加入純種培養(yǎng)的紅曲 霉，人為控制發(fā)酵過程，解決微生物數(shù)量足、功能強、類群之間的量比關(guān)系穩(wěn)定等缺點，兩者 配合使用優(yōu)勢互補，突出己酸乙酯的主體香，使得酒體豐滿協(xié)調(diào)。酯化酶制劑是生物酶和活菌體的生態(tài)混合體，在白酒生產(chǎn)中廣泛的運用，在發(fā)酵 過程不僅有傳統(tǒng)大曲的糖化功能，而且還有生香功能，從而達到縮短發(fā)酵周期，提高出酒率 和優(yōu)品率的效果。運用分離純化得到酯化菌種在釀酒行業(yè)中應用，釀造出的酒與原工藝酒 比較，口味更加醇厚、幽雅，窖香更濃，味更長。近年來，很多白酒生產(chǎn)廠應用酯化酶技術(shù)都 取得了不錯的效果。孟勤燕等人(高產(chǎn)酯力紅曲霉篩選及在西鳳濃香調(diào)味酒生產(chǎn)中的試 用，釀酒科技，2006 (5) 52-54)以20多個大曲、酒醅為原料，分離、純篩選得到一株具有較 高酯化性能的紅曲霉M-6。在35°C下酯化30d，pH3. 5，酒精度10% (v/v)，能取得較好的效 果。在釀酒生產(chǎn)試用中，加紅曲霉M-6生產(chǎn)的麩曲發(fā)酵酒比對照酒的己酸乙酯高2倍多； 在西鳳濃香酒生產(chǎn)中試用，所產(chǎn)酒己酸乙酯增高，窖香純正濃郁、酒體醇厚爽凈、回味好，質(zhì) 量優(yōu)于對照樣。唐現(xiàn)洪等人(SGAS2004. 0001酯化菌的分離及其應用，釀酒科技，2006 (5) 4952)采用透明圈等方法，結(jié)合酯化能力、耐酒能力、耐酸能力試驗指標篩選得到一株紅曲 霉菌株SGAS2004.0001，耐己酸濃度為1%，酯化能力達到10% (V/V)以上；該菌株制成 麩曲用于其公司的雙輪底酒生產(chǎn)和公司的制曲生產(chǎn)中，雙輪底酒的己酸乙酯含量平均增 加65mg/100mL，用SGAS-2004. 0001菌種接種的大曲，所產(chǎn)酒己酸乙酯的平均含量增加了 32mg/100mL。
俞艷玲等人(《7種紅曲霉的掃描電鏡觀察》，浙江中醫(yī)學院學報2005年1月第 29卷第1期)公開了一種通過掃描電鏡確定7種紅曲霉的超顯微特征的方法，主要涉及發(fā) 白紅曲霉5017、巴克紅曲霉5021、煙色紅曲霉5035、紫紅曲霉5032、紅色紅曲霉5029、橙色 紅曲霉(Monascus aurantiacus Lee) 5015和變紅紅曲霉5016這7種菌株的鑒定。該文獻 并沒有公開利用這些菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)白酒以增加己酸乙酯含量或總酯含量。潘名志等人 (《紅曲霉產(chǎn)酯化酶液體培養(yǎng)基研究》，山地農(nóng)業(yè)生物學報2009年28期)公開了一種對貴州 大學真菌資源研究所提供的4株紅曲霉Monascus ZZ,Monascus ZK、Monasuc GX、Monasucs XM進行液體發(fā)酵研究，篩選出產(chǎn)酯化酶能力較高的紅曲霉Monascus ZK，并應用單因素和正 交試驗篩選了培養(yǎng)基配方，連續(xù)進行4個批次的穩(wěn)定性試驗證明，以最佳培養(yǎng)基發(fā)酵，酯化 酶平均酶活力為293. 8U mL—1，酶活力提高了 42. 3%。顯然，該文獻沒有公開橙色紅曲霉 (Monascus aurantiacus)MN2，也沒有公開利用所篩選出的紅曲霉Monascus ZK在白酒發(fā)酵 后的己酸乙酯含量或總酯含量。中國專利CN1160764公開了一種從江蘇省軍區(qū)運西農(nóng)場所 屬江蘇華威保健品廠紅曲霉菌的曲粉中經(jīng)選育出的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)， 保藏號為CGMCCNo. 0285。該發(fā)明人采用上述新菌株經(jīng)培育、發(fā)酵、蒸餾、過濾等步驟，可得含 酯300mg/100ml的調(diào)味酒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2。該菌株所 產(chǎn)的酯化酶具有合成較長直鏈酯的酯化活性，能夠催化濃香型曲酒中的以己酸乙酯為主的 四種酯的合成，從而達到縮短發(fā)酵周期，提高出酒率和優(yōu)品率的目的，同時解決了發(fā)酵糟內(nèi) 微生物所產(chǎn)酯酶的活力不高，以及醇、酸等反應底物濃度較低，酯化反應速度緩慢的問題。發(fā)明人通過大量試驗篩選，最終獲得了本發(fā)明的橙色紅曲霉 (Monascusaurantiacus)MN2，并于2010年7月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 號為 CCTCC NO. M2010176。本發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2具有以下形態(tài)特征于400倍顯微鏡觀察紅曲霉MN2的菌絲體形態(tài)，菌株形態(tài)特征為菌絲體分枝甚 繁、有隔，產(chǎn)橙色油滴，直徑3. 0 u m-7. 0 u m，幼時有內(nèi)含物，分生孢子球形或洋梨形、無色， 子囊果球形、無色、短柄，橢圓形(5.0-7.0) umX (4. 5-5.0) u m0本發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2具有以下培養(yǎng)特征橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7d，菌 落最大，稍凸起，有細小絨毛，疏松，具較強蔓延性，正面中間淺灰色，周邊棕紅色，背部紫紅 色，菌落大小為(3. 5-4. 5) cmX (5. 5-6. 5) cm，生長速度快(參見圖1)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在麩皮瓊脂培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7d，菌 落較大，凸起，疏松，呈皮膜狀，有放射狀，正面中間淺粉色，背部紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較快(參見圖2)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在PDA瓊脂培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7d， 菌落較大，稍凸起，疏松，呈絨氈狀，蔓延性一般，正面中間淺粉色，背部深紅色，菌落大小 (3. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm,生長速度較快(參見圖 3)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在察氏瓊脂培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7d，菌落小，凸起最高，呈絨氈狀，疏松，蔓延性差，正面淺紅色，背部紅色，菌落大小(2. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較慢(參見圖4)。本發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2的生物學特性如下生長溫度為20°C 45°C，最適生長溫度為30°C 35°C，在pH2. 0 7. 0的范圍內(nèi) 均能生長，在乙醇濃度是5%左右生長比較好，耐乙醇濃度小于10%。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基 和PDA瓊脂培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)7d,連續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化， 該菌株的生物學性狀基本穩(wěn)定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌株具有如 下有益的技術(shù)效果1)通過實施例1可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備的 酯化粗酶制劑，其酯化力可達65. 6mg/g. 100h，而桔霉素含量小于lmg/L或lmg/kg。2)通過實施例2、3可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備 的酯化粗酶制劑，其對催化己酸合成己酸乙酯的能力最強，合成乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸 乙酯能力較弱，說明該酶制劑是一類專一性很高的酶。3)通過實施例4、5可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制 備的酯化液應用于回窖發(fā)酵試驗中時，其蒸餾前段酒中四大酯含量明顯提高，尤以己酸 乙酯含量增加較多，可達196. 7mg/100mL,總酯含量高達509. 18mg/100mL ；另外，經(jīng)感官 品評對比可以看出，回窖發(fā)酵后的酒，有窖香更濃郁，風味更協(xié)調(diào)，口感更醇和，余味長等 特點。與中國專利CN1160764公開的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)菌株相比，本 發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)麗2發(fā)酵生產(chǎn)的白酒，其己酸乙酯含量高達 己酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL，具有顯著的進步。4)通過實施例6可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制 備的酯化液應用于串蒸提香試驗時，蒸餾前段酒中四大酯的含量明顯增加，尤其是己 酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL;另外，用不同串蒸方式提香時，香醅串蒸優(yōu)于底鍋串蒸。從表6中感官 品評可知串蒸后的酒，有酒體香濃、酒味協(xié)調(diào)、余味長等特點，香醅串蒸酒口感優(yōu)于底鍋 串蒸。與中國專利Cm 160764公開的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)菌株相比，本 發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascusaurantiacus)麗2發(fā)酵生產(chǎn)的白酒，其己酸乙酯含量高達 己酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL，具有顯著的進步。本發(fā)明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2能夠以麩皮和玉米粉作為發(fā)酵 基質(zhì)，通過人工純培養(yǎng)方式獲得紅曲酯化酶，利用酯化酶提高白酒中酯類的含量，可提高出 酒率和優(yōu)質(zhì)率。利用本發(fā)明的橙色紅曲霉(M0nasCuSaurantiaCuS)MN2的釀酒工藝，操作簡 單，效果明顯，不改變原有的生產(chǎn)流程，且酒的質(zhì)量和風味都穩(wěn)定。既經(jīng)濟又環(huán)保，減少企業(yè) 開支，提高經(jīng)濟效益。
圖1為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上的菌落圖
圖2為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在麩皮瓊脂培養(yǎng)基上的菌落3為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株麗2在PDA瓊脂培養(yǎng)基上的菌落4為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在察氏瓊脂培養(yǎng)基的菌落5為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在400倍顯微鏡菌絲體形態(tài)圖6為本發(fā)明所述的橙色紅曲霉菌株麗2在26S rDNA D1/D2區(qū)域PCR產(chǎn)物的電 泳圖，其中 Marker 為 DL-2000 ；1 為 26S rDNA
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步作描述，但是本發(fā)明 的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā) 明的保護范圍之內(nèi)。實施例1利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備酯化粗酶制劑取橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌種，在無菌條件下，挑取少許菌絲 體，轉(zhuǎn)接于無菌麥芽汁試管培養(yǎng)基中，在30°C 32°C培養(yǎng)48h 52h，即為一級試管斜面種 子。在500mL的三角瓶中加入大米培養(yǎng)基20g、無菌水200mL，于121°C高壓滅菌20min，在 無菌條件下，接入試管斜面種子，于32°C、200rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h 52h，即為二級三角 瓶種子。向滅菌好的500L種子罐中加入大米培養(yǎng)基15Kg，無菌水200L，在120°C 125°C 溫度下滅菌30min，待種子罐冷卻至35°C 40°C時，按種子罐中物料體積總量的0. 10% 0. 15% (v/v)接入培養(yǎng)好的三角瓶種子，在轉(zhuǎn)速240rpm、溫度32°C 34°C、灌壓0.05Mpa 0. 07Mpa、無菌空氣流量8m3/h 10m3/h的條件下，培養(yǎng)48h得三級生產(chǎn)用菌種。將麩皮70%、玉米粉30%投入蒸料罐內(nèi)，旋轉(zhuǎn)混合時間lOmin ；向蒸料罐內(nèi)加水， 料水質(zhì)量比為1 0. 4 ；然后在121°C溫度下蒸料30min ；在內(nèi)壓位0，溫度為90°C下涼料， 得基料；將基料從蒸料罐內(nèi)放出，轉(zhuǎn)入發(fā)酵池，基料溫度冷卻至35°C 40°C，得冷卻好的基 料。向冷卻好的基料中加入三級生產(chǎn)用菌種，接種量為基料的20% (v/w，毫升/克)，混合 拌種，加入基料總量0.1% (v/w，毫升/克)的乳酸，接種后溫度維持32°C 35°C，得拌種 基料。將拌種基料堆厚40cm 50cm，表面覆以滅菌的麻袋，自然室溫，發(fā)酵培養(yǎng)10h 15h，得發(fā)酵基料。當發(fā)酵基料的溫度達到48°C 50°C時，攤薄發(fā)酵基料至15cm 20cm，室 溫20°C 25°C，自動通風維持品溫32°C 35°C，發(fā)酵培養(yǎng)3d 5d，每天翻料一次，得發(fā)酵 好的基料。將發(fā)酵好的基料低溫((65°C )烘干至水分< 12%，得低溫烘干基料。將低溫 烘干基料粉碎，細度為100%過40目，得酯化酶粗酶制劑，其水分含量和酯化力參見表1。表1酯化粗酶制劑水分含量和酯化力
權(quán)利要求
1.橙色紅曲霉(Monascusaurantiacus)MN2 菌株 CCTCC N0.M2010176。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的培養(yǎng)特征為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)7d,菌落稍凸起，有細小絨毛，疏松，具較強蔓延性，正 面中間淺灰色，周邊棕紅色，背部紫紅色，菌落大小為(3. 5-4. 5) cmX (5. 5-6. 5) cm ；麩皮瓊脂培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)7d,菌落凸起，疏松，呈皮膜狀，有放射狀，正面中間淺粉色， 背部紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm ；PDA瓊脂培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)7d，菌落稍凸起，疏松，呈絨氈狀，蔓延性一般，正面中間淺粉 色，背部深紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm ；察氏瓊脂培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)7d,菌落小，凸起最高，呈絨氈狀，疏松，蔓延性差，正面淺紅 色，背部紅色，菌落大小(2. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較慢。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的形態(tài)特征如下在400倍顯微鏡觀察，菌絲體分枝甚繁、有隔，產(chǎn)橙色油滴，直徑3 μ m-7 μ m，幼時有內(nèi) 含物，分生孢子球形或洋梨形、無色，子囊果球形、無色、短柄，橢圓形(5-7) μ mX (4. 5-5) μ m0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的生物學特性為生長溫度為20°C 450C，在pH2. 0 7. 0的范圍內(nèi)均能生長，在乙醇濃度是5%左右生長比較好，耐乙醇濃度小 于 10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于它的生長溫度為30°C 35°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基和PDA瓊脂培養(yǎng)基 30°C培養(yǎng)7d，連續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，它的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，生物學性狀基本穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌株。該菌株所產(chǎn)的酯化酶具有合成較長直鏈酯的酯化活性，能夠催化濃香型曲酒中的以己酸乙酯為主的四種酯的合成，從而達到縮短發(fā)酵周期，提高出酒率和優(yōu)品率的目的，同時解決了發(fā)酵糟內(nèi)微生物所產(chǎn)酯酶的活力不高，以及醇、酸等反應底物濃度較低，酯化反應速度緩慢的問題。
文檔編號C12N1/14GK101993825SQ20101023739
公開日2011年3月30日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者方尚玲, 鎮(zhèn)達, 陳茂彬 申請人:湖北工業(yè)大學