檢測石蠟包埋肝組織乙型肝炎病毒cccDNA的試劑盒的制作方法

專利名稱：檢測石蠟包埋肝組織乙型肝炎病毒cccDNA的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測的方法，特別是用于微量石蠟包 埋肝組織乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測的方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (HBV cccDNA)是HBV持續(xù)感染和抗病毒藥物停用 后病情反復(fù)的關(guān)鍵因素。定量檢測HBV cccDNA對于評價(jià)乙肝患者抗病毒治療效果具有十 分重要的意義，但目前在臨床上尚未得到開展。有兩個(gè)因素制約了 HBV cccDNA檢測的實(shí)際應(yīng)用。一方面是樣本來源的的問題由于乙型肝炎病毒cccDNA主要存在于肝細(xì)胞核，需要用人新鮮肝組織作為檢測 樣本，然而新鮮肝組織不容易得到。除非要求患者專為進(jìn)行該項(xiàng)檢測而接受創(chuàng)傷性的肝穿。 且新鮮肝組織保存條件苛刻，無疑給科研和臨床開展該項(xiàng)目檢測產(chǎn)生阻礙。目前常規(guī)病理檢測用甲醛固定石蠟包埋肝組織(FFPET)作為檢測對象，可保存時(shí) 間長，但現(xiàn)有的技術(shù)方法不能進(jìn)行石蠟包埋肝組織cccDNA檢測。目前國產(chǎn)試劑主要用于血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本，但是由于cccDNA是否存 在于血液尚有爭議(由于HBV cccDNA主要存在于肝組織，血清中不存在或僅在肝細(xì)胞炎性 壞死后有少量進(jìn)入外周血，單獨(dú)進(jìn)行血清HBV cccDNA檢測的意義十分有限)；而且血清和 外周血保存時(shí)間短，因此血液并不是檢測cccDNA的理想樣本。文獻(xiàn) EUR J Gastroenterol Hepatol. 2010Feb 10. [Epub ahead of print], Detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in paraffin-embedded and cryo-preserved liver biopsies of chronic hepatitis B patients.報(bào)道了“定量檢測石蠟包埋肝穿組織中乙型肝炎病毒(HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(cccDNA) ”。但該文獻(xiàn)報(bào)道的石蠟包埋肝穿組織中DNA提取方法與本發(fā)明不同，且該方 法定量cccDNA僅采用跨缺口 PCR，沒有采用PSAD酶消化和滾環(huán)擴(kuò)增，不能保證檢測的特異 性和靈敏性。另外在技術(shù)方面目前HBV cccDNA檢測主要方法為熒光探針檢測技術(shù)，其中之一是跨缺口實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)，采用跨rcDNA缺口區(qū)引物擴(kuò)增cccDNA。滾環(huán)擴(kuò)增(rolling cycle amplification, RCA)是一種體外等溫核酸擴(kuò)增方法， 其特點(diǎn)是只能擴(kuò)增閉合環(huán)狀DNA，不能有效去除PSAD酶未消化完全的非閉合環(huán)狀DNA，所以 僅用滾環(huán)擴(kuò)增方法難以完成HBV cccDNA的定量檢測。這些方法存在以下幾個(gè)問題1.檢測的特異性和靈敏性不強(qiáng)HBV cccDNA主要存在于肝細(xì)胞核中。由于HBV cccDNA的含量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HBV 松馳環(huán)狀DNA (rcDNA)，跨缺口實(shí)時(shí)熒光PCR方法和Invader方法難以保證檢測的特異性和靈敏性。2.無法區(qū)分整合DNA和cccDNAHBV慢性感染特別是肝硬化患者肝組織中存在大量整合HBV DNA,即使采用目前先 進(jìn)的PSAD酶降解非閉合環(huán)狀DNA，仍不能保證非閉合環(huán)狀DNA被完全徹底消化，也不能有效 區(qū)別cccDNA和整合HBV DNA。3.不能有效區(qū)分整合DNA、松馳環(huán)狀DNA (rcDNA)和閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)。4、樣本間的差異干擾數(shù)據(jù)分析，沒有內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不需要新鮮肝組織作為檢測樣本的乙型肝炎病毒 cccDNA定量檢測方法和檢測試劑盒，且靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單方便。本發(fā)明提供的方法是，將石蠟包埋肝組織中提取的總DNA分別加入HBV滾環(huán)引物 和跨缺口引物，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口熒光定量PCR ；所述總DNA可以從乙肝患者病理檢查 剩余的微量石蠟包埋肝組織切片中提取。且需要量非常少，僅取4-6微米厚的切片2-3片 便可完成檢測(見實(shí)施例)。具體操作步驟是(1)石蠟包埋肝組織；(2)提取肝組織總DNA ； (3)設(shè)計(jì)、合成引 物與探針；⑷滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口熒光定量cccDNA ； (5)加入內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化，消除樣本間的差異。所述石蠟包埋肝組織，包括以下步驟1、固定；2、水洗；3、脫水；4、透明；5、浸蠟； 6、包埋；7、切片。分述如下1、固定將肝組織固定于10%福爾馬林，其目的在于保存組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié) 構(gòu)及其組成，使其與生活時(shí)相似。2、水洗將組織塊用水沖洗。目的是洗去滲入組織中的固定液。3、脫水將組織塊用75% -100%乙醇脫水，乙醇濃度為每次更換新的脫水劑時(shí)從 低濃度到高濃度。目的是把組織中的水分徹底脫除，有利于組織的透明和浸蠟，便于永久保存。4、透明在二甲苯中兩次透明。目的是使組織中的乙醇被透明劑所代替，以使石蠟 能很順利地進(jìn)入組織中；還能增強(qiáng)組織的折光系數(shù)。5、浸蠟將透明好的組織塊用石蠟浸透。浸蠟?zāi)康氖菫橄乱徊桨褡鰷?zhǔn)備。6、包埋將組織塊包埋在石蠟中，待凝固冷凍，使其便于切片。7、切片。石蠟包埋肝組織的詳細(xì)操作方法見實(shí)施例。所述跨缺口熒光定量擴(kuò)增技術(shù)，優(yōu)選為Taqman跨缺口熒光定量擴(kuò)增。若在進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口實(shí)時(shí)熒光PCR方法之前，先在單管中進(jìn)行不降解質(zhì)粒 的ATP依賴的DNA酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase，簡稱為PSAD)消化非閉合環(huán)狀 DNA，則檢測效果更好。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本方法不僅可應(yīng)用新鮮肝穿組織，還可以應(yīng)用微量的福爾馬林固定 石蠟包埋肝穿組織(formalin-fixed paraffin embedded,FFPE)進(jìn)行檢測(代表性結(jié)果見 附圖3)本方法可以完全排除rcDNA和整合HBV DNA的干擾。本發(fā)明擴(kuò)增線性范圍寬相同
4PCR條件下，可擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品HBV cccDNA濃度范圍IO2-IOici拷貝/毫升(圖1)。本發(fā)明研發(fā)了可以利用微量石蠟包埋肝組織檢測cccDNA的滾環(huán)擴(kuò)增+跨缺口熒 光定量PCR新技術(shù)，尤其是突破了以往對HBV cccDNA的檢測在方法學(xué)上特異性、靈敏度不 高，不能有效區(qū)分整合DNA、松馳環(huán)狀DNA(rcDNA)和閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的技術(shù)瓶頸。 當(dāng)血清中HBV DNA含量用現(xiàn)有技術(shù)方法無法檢測到時(shí)，用本方法仍可檢測到肝組織中HBV cccDNA，最低可檢測0. 1拷貝/肝細(xì)胞。特別是不需要新鮮肝組織作為檢測樣本，采用臨床 病理檢查剩余的石蠟包埋肝組織，不需額外取樣，患者容易接受。通過對100例慢性乙型肝炎和HBV感染相關(guān)肝硬化、肝癌患者的新鮮冰凍及石蠟 包埋肝組織的檢測，30例非乙型肝炎患者新鮮冰凍及石蠟包埋肝組織的檢測，以及200余 例HBV感染患者及健康人血清的檢測，表明我們建立的檢測方法具有良好的特異性、靈敏 度和穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果是1、不需要新鮮肝組織作為檢測樣本，采用臨床病理檢查剩余的石蠟包埋肝組織即 可完成檢測。解決了以往只能用新鮮肝組織檢測造成HBV cccDNA檢測用量大、樣本來源困 難的難題。2、靈敏度高檢測cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度達(dá)到IO2拷貝/毫升。當(dāng)乙肝患者血清中HBV DNA含 量用現(xiàn)有技術(shù)方法無法檢測到時(shí)，用本方法仍可檢測到石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA，最 低可檢測0.1拷貝/肝細(xì)胞。從附圖2、圖3可以看出，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)后檢測靈敏度大大增強(qiáng)。3、特異性強(qiáng)通過PSAD酶消化，去除非閉合環(huán)狀DNA的干擾，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺 口 PCR，進(jìn)一步去除未消化完全的非閉合環(huán)狀DNA和整合DNA，進(jìn)一步增強(qiáng)了特異性。4、重復(fù)性好從實(shí)施例給出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)，以10個(gè)梯度稀釋的質(zhì)粒PCP10DNA (標(biāo)準(zhǔn)品)為 樣本，每個(gè)樣本分別進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，組內(nèi)組間差異無顯著性(P <0.05)。對臨床來源的 10份樣本進(jìn)行4次重復(fù)檢測，組內(nèi)組間差異無顯著性(P < 0. 05)。5、污染性小PSAD酶消化和滾環(huán)擴(kuò)增在單管中進(jìn)行，使操作過程和結(jié)果分析更簡便、省時(shí)，減少 污染機(jī)會。6、檢測結(jié)果誤差小設(shè)置內(nèi)參，消除樣本間的差異干擾數(shù)據(jù)分析。用本發(fā)明的方法可以制備檢測石蠟包埋肝組織乙型肝炎病毒cccDNA的試劑及試 劑盒。所述試劑盒中除常規(guī)檢測試劑盒應(yīng)有的試劑、工具外，還具有脫蠟及DNA提取試劑、 PSAD酶，Phi29DNA聚合酶，HBV滾環(huán)引物及相關(guān)緩沖液等。檢測方法的特征是所述脫蠟及總DNA提取的步驟詳見實(shí)施例。


圖1是HBV cccDNA檢測線性范圍IO2-IO10拷貝/毫升；
圖2是不同檢測方法擴(kuò)增電泳圖，其中a 以梯度稀釋的PCPlO質(zhì)粒DNA為模板，PSAD消化后直接跨缺口熒光定量PCR ；b 以梯度稀釋的PCPlO質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PSAD消化后用RCA+跨缺口熒光定量 PCR擴(kuò)增；圖3是不同方法檢測FFPE肝組織擴(kuò)增電泳圖，其中c =FFPE肝組織DNA經(jīng)PSAD消化后直接跨缺口熒光定量PCR ；d =FFPE肝組織DNA經(jīng)PSAD消化后用RCA+跨缺口熒光定量PCR。圖4是部分乙肝患者FFPE肝組織樣本中總HBV DNA和cccDNA的定量結(jié)果比較；圖5是HBeAg陽性與HBeAg陰性乙肝患者FFPE肝組織cccDNA水平的比較；圖6是HBeAg陽性與HBeAg陰性乙肝患者FFPE肝組織總HBV DNA水平的比較；圖7是新鮮冰凍肝組織和石蠟包埋肝組織樣本cccDNA檢測結(jié)果比較，其中上面是 新鮮冰凍肝組織，下面是石蠟包埋肝組織。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 微量石蠟包埋肝組織乙型肝炎病毒cccDNA檢測一、研究樣本研究對象為解放軍302醫(yī)院2008年5月 2009年5月期間100例慢性乙型肝炎 患者，其中男73例，女27例，年齡范圍3 68歲。診斷符合2000年第十次全國病毒性肝 炎會議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及輸血傳播病毒、巨 細(xì)胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、藥物性、自身免疫性肝病。取甲醛固定石蠟包埋(FFPE) 肝組織切片4-6微米2-3片，并對其中7例病人同時(shí)進(jìn)行新鮮冰凍肝組織和石蠟包埋肝組 織樣本對比實(shí)驗(yàn)。另收集非HBV感染的石蠟包埋肝組織樣本作為陰性對照。二、方法1.制備石蠟包埋肝組織切片1.固定肝組織取材1. 5cmX0. 1cm,固定于10%福爾馬林2-3小時(shí)。固定液的用 量一般為組織體積的10 20倍。(組織離體后，組織細(xì)胞由于血液供應(yīng)停止，即可發(fā)生缺 氧，導(dǎo)致生物氧化過程停止。相反，細(xì)胞內(nèi)的無氧酵解酶類活躍，使組織內(nèi)蛋白質(zhì)、糖、脂肪 降解，導(dǎo)致組織發(fā)生自溶。另外，組織也可因污染細(xì)菌而發(fā)生腐敗。固定的目的在于保存組 織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及其組成，使其與生活時(shí)相似。)2.水洗將組織塊放在廣口瓶內(nèi)，膠管插入瓶內(nèi)接通自來水，瓶口用紗布包住，以 自來水流水沖洗30分鐘。目的是洗去滲入組織中的固定液。3.脫水乙醇脫水過程75%乙醇2小時(shí)95%乙醇I 1 2小時(shí)95%乙醇IIl 2小時(shí)100%乙醇I 2小時(shí)100% 乙醇 II 2 小時(shí)每次更換新的脫水劑時(shí)(組織塊從低濃度到高濃度)，都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影 響脫水效果。脫水的目的是把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有 利于組織的永久保存。4.透明將上述樣本在二甲苯中兩次透明，每次透明60分鐘。(透明的目的是使組織中的 乙醇被透明劑所代替，以使石蠟?zāi)芎茼樌剡M(jìn)入組織中，另外，還能增強(qiáng)組織的折光系數(shù))。5.浸蠟在60度恒溫箱中放置2個(gè)蠟杯，分別編號蠟1、蠟2。取透明好的組織塊放入上述 蠟缸中各1小時(shí)，使石蠟浸透組織(浸蠟?zāi)康氖菍⑹炌溉胝麄€(gè)組織，為下一步包埋做準(zhǔn)6.包埋(1)準(zhǔn)備包埋蠟硬蠟(56 58°C或60 62°C )，透明無雜質(zhì)。(2)準(zhǔn)備包埋框金屬的或一次性塑料包埋框。(3)點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無齒尖鑷子。(4)在包埋框中倒入融化的石蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，使包埋面 平整。室溫下冷卻。(5)待蠟塊完全凝固以后，連同包埋框放入4度冰箱45分鐘后切片。7.切片(1)固定切片刀刀刃向上，調(diào)好角度。(2)固定組織塊。(3)調(diào)整所需要的切片厚度一般在4-6微米。(4)調(diào)整組織塊與刀刃之間的角度和位置。(5)切片右手轉(zhuǎn)動搖輪，轉(zhuǎn)一圈可切下一片，切第二片與第一片連在一起，即成 連續(xù)切片。左手用鑷子或毛筆提起切片的下端，輕輕向自身方向拽，使切片成連續(xù)的帶狀。2、提取石蠟包埋肝組織總DNA 切取4-6微米厚石蠟包埋肝組織切片2-3片，采用德國Qiagen公司DNA提取試劑 盒FFPE mini kit并加以改進(jìn)。向甲醛固定石蠟包埋(FFPE)肝組織切片中加入二甲苯1毫 升，短暫渦旋、13000轉(zhuǎn)離心2分鐘，棄上清，重復(fù)上述步驟一次。加入無水乙醇1毫升，短暫 渦旋、13000轉(zhuǎn)離心2分鐘，棄上清，加入180微升裂解buffer重懸樣品；加入20微升蛋白 酶K，渦旋混勻；56度水浴3小時(shí)后，90度孵育10分鐘。加入200微升AL buffer,渦旋使 之充分混勻；加入200微升無水乙醇，渦旋使之充分混勻；將上述樣品全部加入到柱子中， 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄濾液；柱子放入新的收集管；小心開蓋并加入500微升AWl buffer, 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄濾液；柱子放入新的收集管。小心開蓋并加入500微升AW2 buffer, 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄濾液；將柱子放入新的收集管，14000轉(zhuǎn)離心3分鐘，使濾膜干透，棄 濾液；將柱子移入新的EP管中，加入60 100微升ATE，室溫孵育15分鐘，8000轉(zhuǎn)離心1 分鐘，收集洗脫液，"20度冰箱儲存。3、設(shè)計(jì)、合成引物與探針根據(jù)我國常見的HBV基因型B，C基因組全序列，設(shè)計(jì)引物及探針RCAl AATCCTCACAATA*C*C99-113
RCA2ACCTATTCTCCTOOCRCA3CCTATGGGAGTGG*G*CRCA4CCTTTGTCCAAGG*G*CRCA5ATGCAACTTTTTC*A*CRCA6CTAGCAGAGCTTG*G*TRCA7TAGAAGAAGAACT*C*CRCA8GGGCCCACATATT*G*T
2599-2585 1523-1540
1758-1744
510-524
2689-2675
1686-1700
29-15
2240-2254p82 5-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3p83 5-AGGCACAGCTTGGAGGC-3
1886-1870探針5-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-31825-18454、Plasmid safe ATP_d印endent DNase 酶消化設(shè)定反應(yīng)體系為樣品DNA 6. 8μ 1，PSAD酶0. 4μ 1，ATP應(yīng)用液0. 8μ 1，反應(yīng)緩沖 液2μ 1。反應(yīng)條件為37°C 30min，70°C滅活30min。5、滾環(huán)擴(kuò)增上述產(chǎn)物作為模板力口入RCAU RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8 八個(gè)弓 | 物，每個(gè)引物 0. 0625 μ 1，共 0. 5 μ 1。95°C 3min，50°C 15s, 30 °C 15s, 20°C IOmin ；再加入 上述八個(gè)引物:0· 0625 μ 1/ 每個(gè)引物，共 0. 5 μ 1，Phi29 酶 1 μ 1，Phi29buffer 1 μ 1，BSA 0. 2μ 1, d NTP 1.6 μ 1，無菌去離子水 4.2 μ 1。30 °C 16 個(gè)小時(shí)。6、跨缺口熒光定量PCR 取上述產(chǎn)物3μl，dNTP5y l，Mg2+3. 5mM，PCR緩沖液2. 5 μ 1，跨缺口引物0. 5 μ 1 (終 濃度5 μ Μ)，Taq酶0. 5 μ 1 (終濃度2. 5U)，探針0. 2 μ 1 (終濃度2 μ Μ),剩余體積用無菌去 離子水補(bǔ)足，總體系為25μ 1，94°C 3min，94°C 10s，60°C 45s，單采光，40個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的質(zhì)粒PCP10DNA梯度稀釋后建立。7、加入內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化，消除樣本間的差異設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin的引物β-up、β-down和探針擴(kuò)增內(nèi)參β-actin基因。反應(yīng) 體系和條件同上。8、特異性、靈敏度和可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別用有文獻(xiàn)報(bào)道的方法PSAD消化HBV非閉合環(huán)狀DNA后直接用跨缺口熒光定 量PCR法及PSAD消化HBV非閉合環(huán)狀DNA后用RCA+跨缺口熒光定量PCR法(本發(fā)明方法) 進(jìn)行cccDNA定量，檢測本研究方法的特異性；同時(shí)以10個(gè)梯度稀釋的質(zhì)粒PCPlODNAG^f 品)為樣本，每個(gè)樣本分別進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測組內(nèi)組間差異；對臨床來源的10份樣本 分別進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測組內(nèi)組間差異。此外還以梯度稀釋的已知濃度DNA為模板，評 價(jià)本方法的檢測靈敏度和線性范圍。以新鮮冰凍、FFPE非乙肝患者肝組織及血清DNA作為 陰性對照。9、HBeAg陽性及陰性患者HBV cccDNA檢測采用PSAD消化后用RCA+跨缺口熒光 定量PCR方法分別對100例HBeAg陽性及陰性乙肝患者進(jìn)行cccDNA水平檢測，同時(shí)檢測相 應(yīng)樣本肝組織中總HBV DNA含量及血清中HBV DNA含量。10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16. 0軟件完成，通過線性相關(guān)、Pearson檢驗(yàn)及直線回歸分析等方法對
8數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立如附圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0. 994，HBV cccDNA檢測線性范圍IO2-IO10
拷貝/毫升2、方法特異性、靈敏度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別以梯度稀釋的已知濃度的PCP10HBV基因組重組質(zhì)粒DNA和FFPE肝組織DNA 為模板，分四組進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，a組PCP10質(zhì)粒DNA經(jīng)PSAD消化后直接跨缺口熒光定量 PCR (文獻(xiàn)報(bào)道方法)；b組PCP10質(zhì)粒DNA經(jīng)PSAD消化后用RCA+跨缺口熒光定量PCR擴(kuò) 增(本發(fā)明方法)；c組FFPE肝組織DNA經(jīng)PSAD消化后直接跨缺口熒光定量PCR ;d組 FFPE肝組織DNA經(jīng)PSAD消化后用RCA+跨缺口熒光定量PCR。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR結(jié)果，如圖2所示，梯度稀釋PCPlO質(zhì)粒DNA經(jīng)過RCA反應(yīng)之后電泳條帶(圖2b)明顯 亮于未經(jīng)RCA反應(yīng)的相應(yīng)電泳條帶(圖2a)；這種趨勢在石蠟包埋樣本DNA表現(xiàn)的更加明 顯，如圖3所示，未經(jīng)過RCA反應(yīng)的石蠟包埋肝組織DNA，僅高濃度的樣品出現(xiàn)目的條帶，其 他較小濃度的樣品，由于cccDNA含量甚微達(dá)不到檢測要求不能檢測到(圖3c)，而經(jīng)過RCA 反應(yīng)的樣品從IO7拷貝/毫升到IO2拷貝/毫升1均能出現(xiàn)目的條帶(圖3d)。以非乙型肝 炎病人肝組織DNA及血清DNA作為陰性對照，均未檢測出條帶。表明本發(fā)明方法具有較好 的特異性。用本發(fā)明方法RCA+跨缺口熒光定量PCR方法最低可檢測到FFPE組織中IXlO2 拷貝/毫升，經(jīng)內(nèi)參校準(zhǔn)后最低可檢測到相當(dāng)于0. 1拷貝/細(xì)胞的cccDNA。表明本發(fā)明方 法具有較好的靈敏性。采用本發(fā)明方法，以10個(gè)梯度稀釋的質(zhì)粒PCP10DNA(標(biāo)準(zhǔn)品)為樣本，每個(gè)樣本 分別進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，組內(nèi)組間差異無顯著性(ρ < 0. 05)。對臨床來源的10份樣本進(jìn)行 4次重復(fù)檢測，組內(nèi)組間差異無顯著性(P < 0. 05)。表明本方法穩(wěn)定性及可重復(fù)性較好。3、FFPE肝組織中總HBV DNA和cccDNA水平的比較對100例患者進(jìn)行FFPE肝組 織cccDNA、總HBV DNA、血清中HBV DNA定量，以β-actin為內(nèi)參照，參照文獻(xiàn)報(bào)道的每個(gè) 細(xì)胞中含有人類基因組DNA6. 667pg進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的計(jì)算。利用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測條 帶是否為目的條帶，F(xiàn)FPE非乙肝患者肝組織及血清DNA作為陰性對照。肝組織總HBV DNA 和cccDNA水平的檢測部分結(jié)果見圖4，二者間呈正相關(guān)(P < 0. 05)。通過分析100例乙肝患者石蠟包埋肝組織中cccDNA含量可知，肝組織中cccDNA 含量大多集中于10 100拷貝/細(xì)胞，且肝組織中cccDNA的含量與肝組織中總HBV DNA成 正相關(guān)(P < 0. 01)，符合理論要求。本實(shí)施例還針對肝細(xì)胞中的cccDNA含量與血清HBVDNA 含量的相關(guān)性進(jìn)行了分析，分析結(jié)果顯示HBeAg陽性患者肝組織HBV cccDNA與血清中總 HBV DNA水平相關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道HBV cccDNA與HBeAg陽性與否關(guān)系密切，本實(shí)例HBeAg 陽性患者肝組織HBV cccDNA及HBV DNA水平都高于HBeAg陰性患者(P < 0. 05)(圖5、圖 6)。4、新鮮冰凍肝組織和石蠟包埋肝組織樣本cccDNA檢測結(jié)果比較新鮮冰凍肝組織 cccDNA水平較石蠟包埋肝組織樣本cccDNA水平略高，但同一病人二者趨勢一致(圖7)。以上實(shí)施例中所用的材料、試劑的來源如下脫蠟及DNA提取試劑=Qiagen產(chǎn)品；
PSAD Sl (Plasmid safe ATP—dependent DNase) =Epicentre Ληππ ；Phi29DNA 聚合酶New England Biolab 產(chǎn)品；滾環(huán)引物見實(shí)施例方法中2設(shè)計(jì)、合成引物與探針一節(jié)。
權(quán)利要求
石蠟包埋肝組織的乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測方法，特征是先將肝組織進(jìn)行石蠟包埋，然后將從中提取的總DNA分別加入HBV滾環(huán)引物和跨缺口引物，進(jìn)行滾環(huán)加跨缺口熒光定量擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1所述的方法，具體操作步驟是(1)石蠟包埋肝組織；(2)提取肝組織總 DNA ； (3)設(shè)計(jì)、合成引物與探針；⑷滾環(huán)擴(kuò)增加跨缺口熒光定量HBV cccDNA ； (5)加入內(nèi) 參照標(biāo)準(zhǔn)化，消除樣本間的差異。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述石蠟包埋，包括以下步驟1)固定；2)水洗；3)脫 水；4)透明；5)浸蠟；6)包埋；7)切片。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述石蠟包埋，包括以下步驟1)固定將肝組織固定于10%福爾馬林；2)水洗將組織塊用水沖洗；3)脫水將組織塊用75%-100%乙醇脫水；4)透明在二甲苯中處理兩次，使組織塊透明；5)浸蠟將透明好的組織塊用石蠟浸透；。6)包埋將組織塊包埋在石蠟中，待凝固冷凍；7)切片。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述跨缺口熒光定量擴(kuò)增技術(shù)，是Taqman跨缺口熒光定量擴(kuò)增。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，在加入滾環(huán)引物和跨缺口引物之前，先在單管中進(jìn)行不 降解質(zhì)粒的ATP依賴的DNA酶消化非閉合環(huán)狀DNA。
7.—種乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測試劑盒，其特征是含有脫蠟及DNA提取的試劑、 PSAD酶、Phi29DNA聚合酶和滾環(huán)引物。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒，其檢測方法的特征是先進(jìn)行樣本的脫蠟及總DNA提取， 然后在單管中將總DNA分別加入PSAD酶、Phi29DNA聚合酶和滾環(huán)引物，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。
全文摘要
石蠟包埋肝組織的乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測試劑盒，特征是對肝組織進(jìn)行石蠟包埋，然后將從中提取的總DNA分別加入HBV滾環(huán)引物和跨缺口引物，進(jìn)行滾環(huán)加跨缺口熒光定量擴(kuò)增。本試劑盒不需要新鮮肝組織作為檢測樣本，檢測特異性好，靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK101948933SQ20101023728
公開日2011年1月19日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者任曉強(qiáng), 徐東平, 鐘彥偉, 韓佳琪 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院