專利名稱：一種用于檢測日本血吸蟲云南地理株的引物、包含該引物的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血吸蟲的檢驗檢測領域，具體涉及一種用于檢測日本血吸蟲云南地理 株的引物、包含該引物的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
日本血吸蟲病是世界衛(wèi)生組織確定的六大重點熱帶病之一，也是我國三種重大人 類疾病之一，具有重要公共衛(wèi)生及社會經(jīng)濟學意義。在我國，目前該病主要在江蘇、安徽、江 西、湖北、湖南、云南和四川7個省份流行，有約5000萬人受到威脅，約80萬人和超過10萬 頭牛受到感染。近年來，由于一些控制血吸蟲措施的廢棄及洪水、南水北調(diào)等引起的環(huán)境變 化，使得該病在一些地區(qū)又有所抬頭，給該病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。由于自然環(huán)境長期阻隔，我國各地日本血吸蟲分離株雖然存在不同程度的遺傳變 異，但環(huán)境的變化及中間宿主釘螺的遷徙，造成了不同地區(qū)分離株的變異呈現(xiàn)不規(guī)律性。因 而，有效鑒定地域株及監(jiān)測血吸蟲病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，尋找血吸蟲不同類型以及與流行區(qū) 地理位置相關的分子標記，并建立我國日本血吸蟲溯源分析方法，將為個體發(fā)病、地區(qū)性暴 發(fā)、阻斷區(qū)重新流行及國外帶蟲者帶入等的病原溯源，以及我國日本血吸蟲病的流行趨勢 預測、疾病預測、疾病預警和防控等提供理論資料。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有檢測日本血吸蟲中存在的不同地區(qū)日本血吸蟲分離 柱的變異呈現(xiàn)不同規(guī)律性的問題，提供一種可以鑒定和檢測日本血吸蟲云南地理株的引 物。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述檢測日本血吸蟲云南地理株的引物的試劑盒。本發(fā)明還有一個目的在于提供一種日本血吸蟲云南地理株的檢測方法。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)本發(fā)明通過對來自于不同流行區(qū)的日本血吸蟲分離株進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)了 線粒體C0X3部分基因序列中存在一個云南日本血吸蟲地理株特異的CAPS位點。通過測序 發(fā)現(xiàn)云南地理株與中國大陸其他地理株在該位點上有一個堿基的替代，從而造成了限制性 內(nèi)切酶位點的改變。一種用于檢測日本血吸蟲云南地理株的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。一種包含上述用于檢測日本血吸蟲云南地理株的引物的試劑盒。上述試劑盒中，包含如下組分(I)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；(2) CAPS-PCR反應液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2的混合溶液；(3) CAPS反應液限制性內(nèi)切酶Nde I和IOXH緩沖液；(4)日本血吸蟲云南地理株DNA陽性對照和其他地區(qū)日本血吸蟲陰性對照。作為一種優(yōu)選方案，上述試劑盒中，還可以添加Taq DNA聚合酶。作為一種優(yōu)選方案，上述試劑盒中，各組分的量如下所示(I)DNA裂解液，27. 5mL 為100個反應的200μ L核裂解液、50μ 1 ρΗ 8. 0的
0.5mol/L的EDTA、20 μ 蛋白酶K禾口 5yL RNase A溶液的混合溶液；(2) CAPS-PCR 反應液，2. 5mL 為終濃度 200 μ mol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP,終 濃度0. 2pmol/yL的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；(3) CAPS反應液，l.OmL:包含IU/μ L、100 μ L的限制性內(nèi)切酶Nde I禾口 10XH緩 沖液100 μ L ；(4)日本血吸蟲云南地理株DNA陽性對照100 μ L和其他地理株DNA陰性對照 100μ L ；(5) Taq DNA 聚合酶，5U/ μ L，25 μ L。本發(fā)明試劑盒的使用方法包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA的提??；(2)CAPS_PCR擴增按照擴增樣品數(shù)取PCR反應液、Taq酶混合，混勻，分裝；將陽、 陰性對照液分別加入一個管中，取各樣品的DNA加入對應反應管中；離心混勻，置于PCR擴 增儀上反應；(3) CAPS-PCR產(chǎn)物觀察取擴增后的PCR產(chǎn)物加樣于1. 0襯％瓊脂糖凝膠上，電泳 后置于紫外透射儀下觀察結果并拍照分析；(4) CAPS反應按照檢測樣品數(shù)取上述陽性PCR產(chǎn)物連同陰陽性對照PCR產(chǎn)物各 2 μ L分別與CAPS反應液和限制性內(nèi)切酶Nde I混勻，于37°C水浴中酶切30min。(5)酶切產(chǎn)物觀察取酶切后的產(chǎn)物5 μ L加樣于1. 0襯％瓊脂糖凝膠上，電泳后置 于紫外透射儀下觀察結果并拍照分析。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)所述Taq酶按每個PCR反應含1. 25U加入。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)所述PCR擴增條件為94°C預變性5min ；94°C變性 lmin、50°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 個循環(huán)；72°C后延伸 lOmin。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)所述限制性內(nèi)切酶Nde I按每個CAPS反應IU加入。本發(fā)明試劑盒PCR反應條件的優(yōu)化過程為通過對鎂離子濃度和退火溫度的調(diào)節(jié)來對PCR條件進行優(yōu)化。Mg2+濃度梯度在
1.OmM至3. OmM之間、退火溫度在45°C至55°C之間進行調(diào)整，以取得用cox3PCR擴增的最佳 Mg2+濃度和最佳退火溫度。經(jīng)試驗確定，最佳退火溫度為50°C;MgCl2的濃度為2mM ；循環(huán)數(shù) 選擇為35個循環(huán)。本發(fā)明日本血吸蟲云南地理株的檢測方法包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA提??；(2)用權利要求1所述特異性檢測引物進行PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀 察，陽性結果為未被酶切的單帶，陰性結果為被完全酶切的雙帶；
(4) PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒、50°C退火30秒、72°C延伸 30秒，35個循環(huán)；72°C后延伸10分鐘。(5) CAPS酶切反應條件為37°C酶切30分鐘。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明通過對來自于不同流行區(qū)的日本血吸蟲分離株進行遺傳變異分析，通 過測序發(fā)現(xiàn)云南地理株與中國大陸其他地理株在該位點上有一個堿基的替代，從而造成了 限制性內(nèi)切酶位點的改變。根據(jù)此云南日本血吸蟲突變酶切位點設計一種特異CAPS反應 體系，建立了用于鑒別云南日本血吸蟲的快速、特異、敏感的CAPS檢測方法；(2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應體系和反應條件，研制出一種鑒別云南日本血吸蟲的 CAPS試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強，敏感性高，結果判定客觀，不僅可用于 人和動物日本血吸蟲病的診斷與流行病學調(diào)查，還可用于研究日本血吸蟲地理標記開發(fā)與 溯源分析等科研用途，為日本血吸蟲病診斷和防治技術等進一步研究奠定基礎。
圖1為日本血吸蟲CAPS-PCR特異性電泳圖譜，其中，M為DL2000marker ； 1 16分別為陰性對照，四川西昌雄蟲(SJSXM4)，四川天全雄蟲(SJSTM3)，安徽貴池雄蟲 (SJAGF7)，湖北武漢雄蟲(SJHWM3)，江西永修雌蟲(SJJYFl)，江蘇無錫雌蟲(SJJWF4)，浙江 嘉善雄蟲(SJZJM3)，湖南君山雄蟲(SJHYM2)，湖南岳陽樓區(qū)雌蟲(SJHLF3)，湖南長沙雌蟲 (SJHCF4)，云南洱源I雄蟲(SJYEMl)，云南洱源II雌蟲(SJYEIIF3)，云南洱源III雌蟲 (SJYEIIIF2)，陽性對照，空白對照；圖2為日本血吸蟲云南地理株特異CAPS-PCR敏感性電泳圖譜，其中，M為DL2000 marker ；1 10為日本血吸蟲成蟲DNA模板質(zhì)量分別為:40、20、10、5、2. 5,1. 25,0. 63、 0. 32,0. 16,0. 1 和 0. 08ng ；11 為陰性對照。圖3對CAPS-PCR產(chǎn)物進行CAPS酶切反應電泳圖譜；其中，M為DL2000marker ； 1 15分別為陰性對照，四川西昌雄蟲(SJSXM4)，四川天全雄蟲(SJSTM3)，安徽貴池雄蟲 (SJAGF7)，湖北武漢雄蟲(SJHWM3)，江西永修雌蟲(SJJYFl)，江蘇無錫雌蟲(SJJWF4)，浙江 嘉善雄蟲(SJZJM3)，湖南君山雄蟲(SJHYM2)，湖南岳陽樓區(qū)雌蟲(SJHLF3)，湖南長沙雌蟲 (SJHCF4)，云南洱源I雄蟲(SJYEMl)，云南洱源II雌蟲(SJYEIIF3)，云南洱源III雌蟲 (SJYEIIIF2)，陽性對照；圖4代表性CAPS酶切反應敏感性電泳圖譜，M為DL2000 marker ；1 4分別為 0. 4U的限制性核酸內(nèi)切酶37°C酶切IOmin,0. 2U的限制性核酸內(nèi)切酶37°C酶切20min, 0. 2U的限制性核酸內(nèi)切酶37°C酶切IOmin,0. IU的限制性核酸內(nèi)切酶37°C酶切Ih ；圖5人工感染家兔日本血吸蟲病樣品CAPS檢測結果；其中，M為DL2000marker ； 1 24分別為陽性對照，云南洱源I雄蟲(SJYEIM8)，云南洱源I雄蟲(SJYEIM9)，云南洱源 I雄蟲(SJYEIM10)，云南洱源I雌蟲(SJYEIF6)，云南洱源I雌蟲(SJYEIF7)，云南洱源I雌 蟲(SJYEIF8)，云南洱源I雌蟲(SJYEIF9)，云南洱源II雄蟲(SJYEIIM56)，云南洱源II雄蟲 (SJYEIIM57)，云南洱源II雄蟲(SJYEIIM58)，云南洱源II雄蟲(SJYEIIM59)，云南洱源II 雌蟲(SJYEIIF56)，云南洱源II雌蟲(SJYEIIF57)，云南洱源II雌蟲(SJYEIIF58)，云南洱 源II雌蟲(SJYEIIF59)，云南洱源III雄蟲(SJYEIIIM8)，云南洱源III雄蟲(SJYEIIIM9)，云南洱源III雄蟲(SJYEIIIM 10)，云南洱源III雌蟲(SJYEIIIF8)，云南洱源III雌蟲 (SJYEIIIF9)，云南洱源III雌蟲(SJYEIIIF10)，云南巍山雄蟲(SJYWM3)，云南巍山雄蟲 (SJYWM4) ；25-46分別為四川西昌雄蟲(SJSXM51)，四川西昌雌蟲(SJSXF51)，四川天全雄蟲 (SJSTM51)，四川天全雌蟲(SJSTF51)，四川茅山雄蟲(SJSMM7)，四川茅山雄蟲(SJSMM8)，安 徽貴池雄蟲(SJAGM51)，安徽貴池雌蟲(SJAGF51)，湖北武漢雄蟲(SJHWM51)，湖北武漢雌蟲 (SJHWF51)，江西永修雄蟲(SJJYM58)，江西永修雌蟲(SJJYF58)，江蘇無錫雄蟲(SJJWM55)， 江蘇無錫雌蟲(SJJWF55)，浙江嘉善雄蟲(SJZJM53)，浙江嘉善雌蟲(SJZJF53)，湖南君山雄 蟲(SJHYM60)，湖南君山雌蟲(SJHYF60)，湖南岳陽樓區(qū)雄蟲(SJHLM53)，湖南岳陽樓區(qū)雌蟲 (SJHLF53)，湖南長沙雄蟲(SJHCM59)，湖南長沙雌蟲(SJHCF59)，陰性對照。
具體實施例方式與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果實施例1試劑盒的組成試劑盒內(nèi)含DNA 裂解液 27. 5mL，其中含 Nuclei lysis solution、pH8. 0 的 0. 5M 的 EDTA、蛋白酶 K(20mg/mL)和 RNase A solution (4mg/mL) ；CAPS-PCR 反應液 100 個反應 (25 μ L/ 反應)，為終濃度各 200 μ M 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP，終濃度 0. 2pmol/ μ L 的上游 引物和下游引物，2識的1%(12、139酶25“1^5"口1^ ；CAPS反應液100個反應(10 μ L/反 應)，其中含有Nde I限制性內(nèi)切酶100 μ L (1U/μ L)、10 X H buffer IOOyL;日本血吸蟲云 南地理株DNA陽性對照和其他地區(qū)日本血吸蟲陰性對照各1支。 實施例2試劑盒CAPS-PCR試驗用經(jīng)過DNA有效性驗證的日本血吸蟲云南地理株和四川、湖南、湖北、安徽、江蘇、 江西、浙江等對照樣品DNA各1 μ L為模板，按照試劑盒的反應條件進行特異PCR擴增，同時 設空白對照和試劑盒陰、陽性對照。表IPCR擴增體系 PCR擴增條件為94°C預變性 5min 72°C 后延伸 IOminPCR產(chǎn)物在1. 0% TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系 統(tǒng)攝像。結果試劑盒能夠從全部日本血吸蟲蟲株DNA中擴增出約580bp的條帶(圖1)。
實施例3試劑盒的PCR敏感性試驗首先將日本血吸蟲提取DNA后進行稀釋，旋渦振蕩混勻，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白測定儀的操作規(guī)程，檢測其總DNA含量。按40，20，10，5，2. 5,1. 25， 0. 63，0. 32，0. 16，0. 1和0. 08ng/ μ L稀釋DNA，PCR擴增條件同上，同時設空白對照。PCR產(chǎn) 物經(jīng)1. Owt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定其敏感性。試驗結果表明該PCR檢測方法敏感性 高，最低能檢測到0. 16ng DNA的日本血吸蟲(圖2)。實施例4試劑盒CAPS酶切反應試驗取經(jīng)過CAPS-PCR有效性驗證的日本血吸蟲云南地理株和四川、湖南、湖北、安徽、 江蘇、江西、浙江等對照樣品PCR產(chǎn)物以及陰性、陽性對照PCR產(chǎn)物各2 μ L，按照試劑盒的反 應條件進行CAPS酶切反應。酶切產(chǎn)物在1. Owt % TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下 觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。結果試劑盒日本血吸蟲云南地理株樣品和陽性對照均不能被酶切，仍為約580bp 的單帶；而其他地理株樣品和陰性對照均被完全酶切成約220bp和330bp的兩條帶(圖3)。表2CAPS反應體系 實施例5試劑盒的CAPS敏感性實驗將陽性PCR擴增產(chǎn)物連同陰性和陽性對照PCR產(chǎn)物按照酶切時間在5min至60min 之間，酶量在0. IU至1. 5U之間進行敏感性檢測。酶切產(chǎn)物經(jīng)1. Owt %瓊脂糖凝膠電泳檢 測。試驗結果表明該CAPS檢測方法敏感性高，最低只需0. 4U的酶酶切IOmin或0. 2U的酶 酶切20min即可被酶切完全(圖4)。實施例4試劑盒的保存期試驗
將在4°C和-20°C保存1個月、3個月、6個月、9個月的試劑盒對已知樣品進行檢 測，擴增條件同前述。結果表明試劑盒可在4°C (Taq酶和限制性內(nèi)切酶Nde I除外，須-20°C 保存)和-20°C保存長期保存，在試驗周期的9個月內(nèi)，在合適保存條件下陽性樣品均能擴 增并酶切出目的亮帶，而陰性對照無酶切結果出現(xiàn)。實施例5試劑盒在人工感染家兔日本血吸蟲病樣品診斷中的應用1.DNA 樣品日本血吸蟲尾蚴樣品來自云南洱源、云南巍山、四川矛山、四川天全、四川西昌、安 徽貴池、湖北武漢、湖南長沙、湖南岳陽樓區(qū)、湖南君山、江蘇無錫、江西永修和浙江嘉善，然 后人工感染家兔，獲取雌、雄成蟲共230個樣品，70 %酒精保存?zhèn)溆谩?. DNA 的提取蟲體材料置于1. 5mL的離心管中，用雙蒸水反復吹打沖洗3次，移去離心管中的 水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA，56°C過夜消化16h ；消化好的蟲體懸液按 Promega 試劑盒Wizard SV Genomic DNA purification system 使用說明提取蟲體 DNA， 直接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. CAPS-PCR 擴增和 CAPS 酶切首先應用試劑盒對上述抽提的基因組DNA進行PCR擴增和CAPS酶切，同時做空白 對照、陰性對照和陽性對照。4.瓊脂糖電泳分析酶切產(chǎn)物在1. Owt % TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像 系統(tǒng)攝像。5.結果與分析獲得的日本血吸蟲云南地理株所有樣品和陽性對照均未被酶切，呈現(xiàn)約580bp的 單帶，而日本血吸蟲其他地理株樣品和陰性對照均被酶切完全呈現(xiàn)出約220bp和330bp的 兩條帶，并且擴增的條帶清晰(圖5)，證明了所建立的區(qū)分云南日本血吸蟲的CAPS方法可 用于日本血吸蟲地理株鑒定以及日本血吸蟲的溯源研究。
權利要求
一種用于檢測日本血吸蟲云南地理株的引物，其特征在于上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.一種試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的用于檢測日本血吸蟲云南地理株的 引物。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含如下組分(1)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNaseA溶液的混合溶液；(2)CAPS-PCR反應液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2的混合溶液；(3)CAPS反應液限制性內(nèi)切酶Nde I和IOXH緩沖液；(4)日本血吸蟲云南地理株DNA陽性對照和其他地區(qū)日本血吸蟲陰性對照。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含TaqDNA聚合酶。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括如下組分(1)DNA裂解液，27. 5mL 為 100 個反應的 200 μ L 核裂解液、50 μ 1 ρΗ 8. 0 的 0. 5mol/L 的EDTA、20 μ 蛋白酶K和5yL RNase A溶液的混合溶液；(2)CAPS-PCR 反應液，2. 5mL 為終濃度 200 μ mol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP,終濃度 0. 2pmol/yL的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；(3)CAPS反應液，l.OmL:包含IU/μ L、100 μ L的限制性內(nèi)切酶Nde I和IOXH緩沖液 100μ L ；(4)日本血吸蟲云南地理株DNA陽性對照100μ L和其他地理株DNA陰性對照100 μ L ；(5)Taq DNA 聚合酶，5U/ μ L，25 μ L。
6.權利要求5所述試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA的提?。?2)CAPS_PCR擴增按照擴增樣品數(shù)取PCR反應液、Taq酶混合，混勻，分裝；將陽、陰性 對照液分別加入一個管中，取各樣品的DNA加入對應反應管中；離心混勻，置于PCR擴增儀 上反應；(3)CAPS-PCR產(chǎn)物觀察取擴增后的PCR產(chǎn)物加樣于1. 0襯％瓊脂糖凝膠上，電泳后置 于紫外透射儀下觀察結果并拍照分析；(4)CAPS反應按照檢測樣品數(shù)取上述陽性PCR產(chǎn)物連同陰陽性對照PCR產(chǎn)物各2 μ L 分別與CAPS反應液和限制性內(nèi)切酶Nde I混勻，于37°C水浴中酶切30min。(5)酶切產(chǎn)物觀察取酶切后的產(chǎn)物5μ L加樣子1. 0襯％瓊脂糖凝膠上，電泳后置于紫 外透射儀下觀察結果并拍照分析。
7.根據(jù)權利要求6所述試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(2)中所述PCR擴增條件 為94°C預變性 5min ；94°C變性 lmin、50°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 個循環(huán)；72°C后 延伸lOmin。
8.一種日本血吸蟲云南地理株的檢測方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)日本血吸蟲DNA提?。?2)用權利要求1所述特異性檢測引物進行PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察，陽 性結果為未被酶切的單帶，陰性結果為被完全酶切的雙帶；(4)PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒、50°C退火30秒、72°C延伸30 秒，35個循環(huán)；72°C后延伸10分鐘。(5)CAPS酶切反應條件為37°C酶切30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測日本血吸蟲云南地理株的引物、包含該引物的試劑盒及檢測方法。本發(fā)明用于檢測日本血吸蟲地域株的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明引物用于檢測日本血吸蟲地域株時，是用上述引物對待測模板DNA進行CAPS-PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行CAPS酶切反應，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察，陽性結果呈現(xiàn)未被酶切的單帶，陰性結果呈現(xiàn)完全酶切的雙帶。本發(fā)明建立了用于日本血吸蟲地域株鑒別的快速、特異、敏感的CAPS方法，可準確鑒定日本血吸蟲地域株。含有本發(fā)明引物的試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強，敏感度高，結果判定客觀，適合推廣應用。
文檔編號C12N15/11GK101880726SQ20101023698
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者宋慧群, 朱興全, 李娟 , 林瑞慶, 袁子國, 趙光輝, 鄒豐才, 陳芳 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學