專利名稱：一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體是一種簡(jiǎn)單高效的植物青蒿遺傳轉(zhuǎn) 化體系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
中藥青蒿，即黃花蒿(Artemisia annua L.)又名臭蒿，臭青蒿，為菊科蒿屬一年生 草本植物。從青篙中提取的青篙素及其衍生物是繼喹啉類和吖啶類之后的一類新的抗瘧藥 物。上世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗血吸蟲(chóng)作用，此外，青蒿類藥物還具有抗腫瘤、免疫 調(diào)節(jié)、抗心律失常等作用。世界青蒿素藥物生產(chǎn)主要依靠我國(guó)從青蒿中提取，過(guò)去主要利用 野生青蒿資源，人工栽培很少，近年來(lái)由于需求量越來(lái)越大，野生中藥青蒿資源日益枯竭， 必須依靠人工栽培種植，而人工栽培青蒿素品種青蒿素含量普遍較低，提高栽培品種的葉 片產(chǎn)量與青蒿素含量是當(dāng)前青蒿育種的主要目標(biāo)。當(dāng)前植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展為人類改 良植物品種帶來(lái)了前所未有的速度和能力，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)改良植物品種的產(chǎn)量、質(zhì)量取 得了明顯的效果，通過(guò)基因工程獲得轉(zhuǎn)基因青蒿高產(chǎn)株系是提高青蒿素產(chǎn)量的最有潛力的 途徑之一。
植物遺傳轉(zhuǎn)化始于20世紀(jì)70年代，30多年來(lái)，植物基因工程取得長(zhǎng)足發(fā)展，轉(zhuǎn)基 因作物在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的兩種方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 和基因槍法，轉(zhuǎn)化的受體組織可以是愈傷組織、原生質(zhì)體等分離細(xì)胞，也可以是完整的植物 細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化方法有以下不足(1)依賴于組織培養(yǎng)，操作復(fù)雜，操作者需要有較好的專 業(yè)知識(shí)基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)；( 過(guò)多的處理常引起受體組織的突變，影響轉(zhuǎn)化的目的性和真實(shí)性；[3]轉(zhuǎn)化植株中常出現(xiàn)基因沉默，從而大大降低目的基因的表達(dá)效率。因此，在許多植物遺 傳轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化效率低、操作周期長(zhǎng)嚴(yán)重制約著分子育種和基因功能研究。目前，在擬南芥 等模式植物的研究中，非組培方法已成為遺傳轉(zhuǎn)化的主要手段，這些方法在其它植物中也 有廣闊的應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)基因植株的得率。
本發(fā)明解決問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，其構(gòu) 建方法包括步驟如下
1)青蒿植株的栽種；
2)轉(zhuǎn)化液的配制；
3)轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)；
4)植株遺傳轉(zhuǎn)化；
5)轉(zhuǎn)化植株篩選；
所述青蒿植株的栽種包括青蒿種子于先年11月中旬播種于黑壤土 蛭石細(xì)3沙0 2 1)的混合土中，盆栽，第二年2月，放于溫室中，溫度20 22°C，相對(duì)濕度 60 % 70 %，光照16h，黑暗他，培養(yǎng)約2個(gè)月后，放于室外，長(zhǎng)至莖高IOOcm左右時(shí)，去其頂 生花序，繼續(xù)生長(zhǎng)3 5d后，即可用于轉(zhuǎn)化；
所述轉(zhuǎn)化液的配制是按照要求配制轉(zhuǎn)化液，所述轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)從加有卡那霉 素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌接種于含利福平和卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中， 280C，220r/m振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 2 1. 8 (約需48h)，離心棄上清，收集菌體重懸于轉(zhuǎn) 化液中；
所述植株遺傳轉(zhuǎn)化包括將準(zhǔn)備好的植株倒置于含轉(zhuǎn)化緩沖液的塑料桶中，套黑 色塑料袋避光放置Mh，然后按常規(guī)方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子；
所述轉(zhuǎn)化植株篩選將得到Ttl代種子，經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選，得到陽(yáng)性植株，提取陽(yáng) 性植株DNA，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定；
本方法還可以包括Tl代表型鑒定根據(jù)轉(zhuǎn)入基因特點(diǎn)，對(duì)Tl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表 型鑒定。
本方法中所述的轉(zhuǎn)化液每IOOOml中包括1/2MS大量元素(50X) 10ml，1/2MS微 量元素(50 X) IOml，蔗糖 30g,乙酰丁香酮(40mg/ml) 0. Iml，6-BA (40mg/ml)，10 μ 1，表面活 性劑 Silwet L-77, Iml ；
本發(fā)明通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化液直接浸泡花蕾的方法，將從青蒿 中克隆的ipt基因轉(zhuǎn)入青蒿中，轉(zhuǎn)化成功率為5% -8%，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ipt基因在青蒿高產(chǎn)株系 中能過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因青蒿中ipt的酶活性是非轉(zhuǎn)基因青蒿的3-4倍，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株分蘗 數(shù)明顯增加；轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素含量最高可達(dá)0.92% (DW)，是非轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含 量的1.42倍。
這種遺傳轉(zhuǎn)化體系只需將農(nóng)桿菌菌液與植株的花接觸而不需要進(jìn)行真空處理。此 體系在花蕾浸蘸轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入表面活性劑SilwetL-77，與未加入Silwet L-77的處理相 比，轉(zhuǎn)化效率顯著增高，在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中加入蔗糖，蔗糖可轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖是 主要的能源物質(zhì)，為花粉粒生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率明顯提高。此體系大大簡(jiǎn)化 了青蒿的轉(zhuǎn)化程序，提高了轉(zhuǎn)化效率，而且操作簡(jiǎn)單，適合于青蒿這類植株高大、異花授粉 物種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，這對(duì)其它物種的遺傳轉(zhuǎn)化也有很好的借鑒價(jià)值。
將含有戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因的EHA105農(nóng)桿菌菌液浸蘸法轉(zhuǎn)入青蒿，得Ttl代 種子，抗Kan篩選得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR檢測(cè)，初步證明外源ipt基因已整合到青蒿基因組 中。T1代植株從幼苗期開(kāi)始表現(xiàn)分蘗多，一般有5-7個(gè)分蘗，與對(duì)照品種的差異達(dá)到極顯著 水平，后期植物生長(zhǎng)茂盛，分枝多，開(kāi)花期延長(zhǎng)，耐冷性增強(qiáng)。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因可 引起細(xì)胞分裂素大量合成，對(duì)植物的抗逆、防衰老、多分蘗等產(chǎn)生重要作用。轉(zhuǎn)基因植株表 型正是ipt基因過(guò)表達(dá)的結(jié)果。
圖1是轉(zhuǎn)基因植株與野生型比較照片。
圖2是轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)照片。
具體實(shí)施方式
一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，其構(gòu)建方法包括步驟如下
1)青蒿植株的栽種青蒿種子于先年11月中旬播種于黑壤土、蛭石、細(xì)沙的混合 土中盆栽，其中黑壤土、蛭石、細(xì)沙重量比例為4 2 1，第二年2月，放于溫室中，溫度 20 22°C，相對(duì)濕度60 % 70 %，光照16h，黑暗他，培養(yǎng)約2個(gè)月后，放于室外，長(zhǎng)至莖高 IOOcm左右時(shí)，去其頂生花序，繼續(xù)生長(zhǎng)3 5d后，即可用于轉(zhuǎn)化；
2)轉(zhuǎn)化液的配制按照要求配制轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液每IOOOml中包括1/2MS大量 元素(50X)10ml，l/2MS 微量元素(50X) 10ml，蔗糖 30g，乙酰丁香酮(40mg/ml)0. lml， 6-BA(40mg/ml)，10 μ 1，表面活性劑 Silwet L-77，lml。
3)轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)從加有卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌接種于含 利福平和卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，280C，220r/m振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 2 1. 8 (約 需48h)，離心棄上清，收集菌體重懸于轉(zhuǎn)化液中；
4)植株遺傳轉(zhuǎn)化將準(zhǔn)備好的植株倒置于含轉(zhuǎn)化緩沖液的塑料桶中，套黑色塑料 袋避光放置Mh，然后按常規(guī)方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子；
5)轉(zhuǎn)化植株篩選將得到Ttl代種子，經(jīng)含利福平和卡那霉素的MS選擇培養(yǎng)基篩 選，得到陽(yáng)性植株，提取陽(yáng)性植株DNA，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定；
6)Tl代表型鑒定以轉(zhuǎn)入基因的功能為參考，對(duì)Tl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，其構(gòu)建方法包括步驟如下1)青蒿植株的栽種；2)轉(zhuǎn)化液的配制；3)轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)；4)植株遺傳轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化植株篩選；所述青蒿植株的栽種包括青蒿種子于先年11月中旬播種于黑壤土、蛭石、細(xì)沙的混 合土中盆栽，其中黑壤土、蛭石、細(xì)沙重量比例為4 2 1，第二年2月，放于溫室中，溫度 20 22°C，相對(duì)濕度60 % 70 %，光照16h，黑暗他，培養(yǎng)約2個(gè)月后，放于室外，長(zhǎng)至莖高 IOOcm左右時(shí)，去其頂生花序，繼續(xù)生長(zhǎng)3 5d后，即可用于轉(zhuǎn)化；所述轉(zhuǎn)化液的配制是按照要求配制轉(zhuǎn)化液；所述轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)從加有卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌接種于含利 福平和卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中J8°C，220r/m振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 2 1. 8，離心 棄上清，收集菌體重懸于轉(zhuǎn)化液中；所述植株遺傳轉(zhuǎn)化包括將準(zhǔn)備好的植株倒置于含轉(zhuǎn)化緩沖液的塑料桶中，套黑色塑 料袋避光放置Mh，然后按常規(guī)方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子；所述轉(zhuǎn)化植株篩選將得到Ttl代種子，經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選，得到陽(yáng)性植株，提取陽(yáng)性植 株DNA，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建方法，其步驟還包括Tl代 表型鑒定根據(jù)轉(zhuǎn)入基因特點(diǎn)，對(duì)Tl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。
3.一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化液每IOOOml 中包括=IAMS大量元素(SOX)IOmiaz^MS微量元素(50X) 10ml，蔗糖30g，乙酰丁香酮 (40mg/ml) 0. Iml，6-BA(40mg/ml) 10 μ 1,表面活性劑 Silwet L—77，Iml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，其構(gòu)建方法包括如下步驟1)青蒿植株的栽種；2)轉(zhuǎn)化液的配制；3)轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)；4)植株遺傳轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化植株篩選；6)T1代表型鑒定。本發(fā)明提供的一種簡(jiǎn)單高效的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系可以提高轉(zhuǎn)基因植株的得率。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102031271SQ201010231800
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月17日
發(fā)明者佘朝文, 蔣向輝, 趙旺 申請(qǐng)人:佘朝文, 懷化學(xué)院, 蔣向輝