專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分泌核酸酶SsnA基因的分離和 克隆，將所述的基因通過(guò)大腸桿菌表達(dá)，獲得重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/ PET28a-SsnA)，利用該菌株表達(dá)豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA，并建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)鑒別診斷方法，用于區(qū)分豬鏈球菌2型滅活疫苗免疫豬與感染豬。本發(fā)明提供含有 豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA的表達(dá)質(zhì)粒(pET_28a(+))、重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA, SsnA蛋白的表達(dá)和純化方法以及用該蛋白建立的可區(qū)分豬鏈球 菌2型滅活苗免疫豬血清和感染豬血清的鑒別診斷方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(Str印tococcus suis, S. suis)是引起豬鏈球菌病的主要病原，依據(jù)豬 鏈球菌表面的莢膜多糖(CPS)可以將S. SUiS分為35個(gè)血清型，分別為1/2型和1 34 型，但最近也有人提出32型和34型應(yīng)該歸于Str印tococcus orisratti，而不應(yīng)該歸于豬 鏈球菌。在豬鏈球菌35個(gè)血清型中，豬鏈球菌2型(SS2)是流行最廣的病原(Hill J. et al.，2005)。該型亦是臨床分離頻率最高的血清型。SS2是一種重要的人畜共患病病原 體，能引起豬腦膜炎(meningitis)、心內(nèi)膜炎(endocarditi)、敗血癥(s印ticemia)、關(guān)節(jié) 炎(arthritis)、漿膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起斷奶仔豬或育肥 豬突然死亡；人類(lèi)感染該菌，可導(dǎo)致腦膜炎，引發(fā)永久性耳聾、敗血癥、心內(nèi)膜炎，甚至死亡 (Vecht U et al.，1985 ；Clifton-Hadley FA, 1983 ；Gottschalk M et al. ,2000) 我國(guó)于 1991年在廣東省首次報(bào)道了該病的發(fā)生。1998-1999年夏季在我國(guó)江蘇省部分地區(qū)豬群中 暴發(fā)流行，并導(dǎo)致特定人群致死的疫病由豬鏈球菌2型所引起。2005年夏季，四川省多個(gè)地 區(qū)發(fā)生豬鏈球菌2型病疫情，造成500多頭生豬死亡，人感染200多例，死亡30多例，進(jìn)一 步證實(shí)該病已在我國(guó)開(kāi)始廣泛流行。由于對(duì)豬鏈球菌的致病機(jī)制還不清楚，無(wú)有效的檢測(cè)和診斷方法，在很多國(guó)家豬 鏈球菌一直未得到有效的控制。特別是對(duì)豬鏈球菌抗體檢測(cè)的方法國(guó)內(nèi)外一直無(wú)商品化的 試劑盒，對(duì)于感染和免疫無(wú)法進(jìn)行有效的區(qū)分。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其第一個(gè)目的是分離和克隆豬鏈球菌2 型分泌核酸酶SsnA基因片段。其第二個(gè)目的是利用所克隆的分泌核酸酶SsnA基因片段轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，獲得一種能特異性表達(dá)該分泌核酸酶SsnA的重組大腸桿菌。本發(fā)明的第三個(gè) 目的是獲得一種蛋白，為豬鏈球菌2型的檢測(cè)診斷試劑盒和ELISA方法提供一種新抗原。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人:通過(guò)基因克隆方法，從豬鏈球菌2型中分離克隆得到一種分泌核酸酶SsnA 基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列長(zhǎng)度為1131bp，其對(duì)應(yīng)的氨基酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所示，包含377個(gè)氨基酸。將所述的分泌核酸酶SsnA基因片
3段轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得一種包含豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因并能表達(dá)該基因的重組 大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/PET28a_SsnA，將該重組大腸桿菌于2010年6月24日 送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010155o1、重組大腸桿菌的制備步驟1)以豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2, SS2)基因組為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)，通 過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因；該基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示；2)將豬鏈球菌2型分泌核酸酶基因SsnA基因插入原核表達(dá)載體pET_28a (+)(購(gòu) 自Novagen公司)的BamHI和XhoI多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建得到中間表達(dá)質(zhì)粒pET28a_SsnA ；3)將步驟2)的中間表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SsnA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用卡 那霉素抗性篩選單個(gè)重組大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)(見(jiàn)后面的詳細(xì)過(guò)程所述)得到特異性地表達(dá) 分泌核酸酶基因SsnA蛋白；其中步驟1)所述的引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物P15，-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3，，反向引物P25，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3，。2、豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA的表達(dá)及純化步驟挑取單個(gè)重組大腸桿菌BL21/PET28a-SSnA菌落至LB培養(yǎng)基加卡那霉素至終濃 度50 μ g/mL, 37°C搖床培養(yǎng)12小時(shí)后放4°C冰箱過(guò)夜；用含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng) 基將該菌液按1 100比例稀釋后，分裝至細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，置37°C搖床培養(yǎng)至OD60(fe0.6,用 0. 8mmol/L的異丙基硫代- β _D_半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，每小時(shí)取樣100 μ 1，誘導(dǎo)3_4小時(shí)后 進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，誘導(dǎo)的菌體經(jīng)離心、超聲波破碎后取上清，經(jīng)純化、變性、復(fù)性等 處理后分裝于-20°C保存?zhèn)溆?。上述的豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因特異性蛋白可用于制備防制豬鏈球菌 2型的新興抗原，藥物，疫苗或診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)。更詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述1)、以豬鏈球菌2型基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到SsnA基因片段， 經(jīng)測(cè)序確定該SsnA基因片段的DNA序列如序列表SEQ ID N0:1所示。序列長(zhǎng)度為1131bp， 其編碼閱讀框?yàn)镾EQ ID NO :1所述的核苷酸序列的第l_1131bp處所顯示的區(qū)域，編碼377
個(gè)氨基酸。2)、將豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因片段插入到原核表達(dá)載體pET_28a(+) 的BamHI和XhoI多克隆位點(diǎn)，得到中間質(zhì)粒pET28a_SsnA。3)、將步驟2)所述的中間質(zhì)粒pET28a-SSnA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡 那霉素抗性篩選得到陽(yáng)性重組大腸桿菌(Escherichia coli) BL21/PET28a-SsnA,該菌株的 保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010155o4)、將步驟3)所述的重組大腸桿菌置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，western blot分析，證實(shí)該重組大腸桿菌已特異性地表 達(dá)豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白，表達(dá)的蛋白以上清的形式存在大腸桿菌BL21中，且 具有免疫學(xué)活性。
5)、從步驟4)中所述的上清中純化SsnA表達(dá)蛋白，并用該蛋白包被ELISA酶標(biāo)板 制備ELISA抗原酶標(biāo)板。用5%脫脂乳制備血清稀釋液，按照ELISA方法檢測(cè)待檢血清。根 據(jù)反應(yīng)后的吸光值確定陰性、可疑、陽(yáng)性的判斷臨界值。按照如下的配方配置包被液、洗滌 液、封閉液、底物液A、底物液B、終止液。按以下配方制備包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液):Na2C03 1. 59g，NaHC03 2. 93g，ddH20 加至 IOOOmL(pH9. 6)。20 倍濃縮洗滌液:NaC1160g, KCl 4g, Na2HP04 · 12H20 58g, KH2P04 4g, Tween-20 IOml加雙蒸水定容至1000ml。封閉液5g脫脂乳(市售)溶于IOOmL洗滌液。底物液底物液A :0. 006% H202緩沖液；底物液B 取Na2HP04 2Η2014. 2g，檸檬 酸10. 5g，用雙蒸水定容至500m配成0. ImL磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5. 0)，然后加聯(lián)苯二胺 (TMB) 10mg。使用時(shí)將底物液A和底物液B按等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液(0.025% HF)濃度 40%氫氟酸(HF) 625 μ L，雙蒸水 lOOmL。將SsnA抗原酶標(biāo)板、豬鏈球菌2型感染陽(yáng)性血清、滅活疫苗免疫陰性血清、包被 液、洗滌液、封閉液、底物液A、底物液B、終止液組裝成SsnA-ELISA鑒別診斷試劑盒。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的有益效果之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的原核表達(dá)載體 pET-28a是分子生物學(xué)中常用的原核表達(dá)載體，沒(méi)有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的原核表 達(dá)載體pET-28aSSnA也沒(méi)有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21/pET-28aSSnA是將原核 表達(dá)載體pET-28aSSnA轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)卡那霉 素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明所用的抗原酶標(biāo)板是用豬鏈球菌2型的免疫 原性蛋白制備的，制備過(guò)程中不涉及豬鏈球菌2型，因此不存在豬鏈球菌2型的逃逸、擴(kuò)散 的潛在危險(xiǎn)。2、本發(fā)明的有益效果之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的豬鏈球菌2型鑒別診斷 方法和診斷試劑盒所需抗原是豬鏈球菌2型免疫原性蛋白。該蛋白可以通過(guò)重組大腸桿菌 BL21/pET-28aSSnA在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。而目前還沒(méi)有關(guān)于豬鏈球 菌2型鑒別診斷的試劑盒。3、本發(fā)明的有益效果之三是可以提供區(qū)分豬鏈球菌2型野毒感染動(dòng)物和滅活疫 苗免疫動(dòng)物鑒別診斷方法和鑒別診斷試劑盒。本發(fā)明ELISA鑒別診斷方法和試劑盒所用抗 原為豬鏈球菌2型SsnA蛋白。Michaelc. Fontaln對(duì)分泌核酸酶(SsnA)的研究報(bào)道，SsnA 表型在豬深層組織和淺層組織分離的細(xì)菌中具有顯著差異_即深層組織分離的細(xì)菌大部 分表現(xiàn)為SsnA陽(yáng)性，而淺層組織分離菌則表現(xiàn)為陰性(Fontaine MCet al.，2004)。針對(duì)這 一現(xiàn)象，推測(cè)SsnA蛋白可能可以作為區(qū)分豬鏈球菌感染已否的一個(gè)指標(biāo)。目前我國(guó)臨床上 還沒(méi)有檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè)試劑盒。對(duì)于豬鏈球菌2型感染和免疫血清的試劑盒 也沒(méi)有，因此本實(shí)驗(yàn)方法能填補(bǔ)國(guó)內(nèi)這一空白。4、本發(fā)明的有益效果之四是提供的鑒別診斷試劑盒使用方便。本發(fā)明在提供了鑒 別診斷方法的基礎(chǔ)上，還將該方法所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡(jiǎn)單易行，非常適合 豬鏈球菌2型的臨床大規(guī)模檢測(cè)。
序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的泌核酸酶SsnA基因的部分核苷酸序列，序列 全長(zhǎng)為1131bp。序列表SEQ ID NO 2是本發(fā)明克隆的泌核酸酶SsnA基因的氨基酸序列，編碼377
個(gè)氨基酸。圖1 是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2 本發(fā)明使用的報(bào)道的基因序列的登錄號(hào)及其在鏈球菌98HAH33中所處的位 置(括號(hào)內(nèi)顯示為有下劃線的為所述的抗原基因序列在Genebank的登錄號(hào)，其后的冒號(hào)后 的數(shù)字為該登錄號(hào)所示基因序列在豬鏈球菌98HAH33基因組中的位置，該位置后顯示的加 粗斜體字為所述的豬鏈球菌的菌株號(hào))。圖3 是本發(fā)明使用的pET_28a(+)載體質(zhì)粒圖譜。圖4 重組蛋白基因PCR圖。圖中泳道，1和2為擴(kuò)增的SsnA基因片段，3為DNA 分子 marker ο圖5 重組中間質(zhì)粒pET28a-SSnA的雙酶切鑒定圖圖中泳道，1為質(zhì)粒雙酶切圖 譜，2 為 15000bp 的 DNA 分子 marker，3 為 2000bp 的 DNA 分子 marker。 圖6 重組抗原純化SDS-PAGE電泳圖中泳道1，3和5均為0小時(shí)表達(dá)，泳道2為 誘導(dǎo)后1小時(shí)表達(dá)，泳道4為誘導(dǎo)后3小時(shí)表達(dá)，泳道6為誘導(dǎo)后6小時(shí)表達(dá)。圖7 重組蛋白純化圖譜1，2用考馬斯亮藍(lán)染色；3，4為用銀染。圖8 :ffestem-blot分析圖中泳道1，2為SsnA蛋白。圖9 =SsnA-ELISA試劑盒的敏感性分析圖譜。圖10 制備的SsnA-ELISA試劑盒進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA的表達(dá)序列的克隆1)豬鏈球菌2型(SS2)的培養(yǎng)將豬鏈球菌2型菌種CVCC606株(購(gòu)白中國(guó)北京，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種于 含有10%滅活新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基(購(gòu)自Sigma公司)上，挑取單個(gè)菌落接種于 TSB液體培養(yǎng)基(購(gòu)自Sigma公司)中，置于搖床中(150r/min)，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2) SS2基因組DNA的提取及目的基因的擴(kuò)增遵照TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒(購(gòu)自武漢大風(fēng)生物技術(shù)有限公司)，按照 該試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的操作方法提取豬鏈球菌2型基因組DNA。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5. 0，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增分泌核酸酶信號(hào)肽后的377個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)的引物對(duì)的DNA序列 如下 Pl 5' -GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3，弓丨入酶切位點(diǎn) BamH IP2 5，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3，引入酶切位點(diǎn) Xho I該引物對(duì)由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1所示。表IPCR 反應(yīng)(25 μ L 體系)
權(quán)利要求
一種分離克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的部分核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種分離克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.一種重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/PET28a_SsnA，其包含序列表 SEQ ID NO 1所述的基因，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2010155o
4.一種豬鏈球菌2型的抗原蛋白，它是由序列表SEQ ID N0:1所述的基因轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，得到保藏號(hào)為CCTCC N0.M2010155的重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/ PET28a-SsnA所表達(dá)的。
5.一種豬鏈球菌2型抗原蛋白的制備方法，其步驟包括1)設(shè)計(jì)引物對(duì)，通過(guò)PCR方法，從豬鏈球菌2型中克隆得到一種分泌核酸酶SsnA基因， 它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示；2)將豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)的BamHI和 XhoI多克隆位點(diǎn)，得到中間質(zhì)粒pET28a-SsnA ；3)將步驟2)所述的中間質(zhì)粒pET28a-SSnA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩 選得到陽(yáng)性重組大腸桿菌BL21/PET28a-SsnA，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2010155 ；4)將步驟3)所述的重組大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半 乳糖苷誘導(dǎo)，western blot分析，得到具有免疫學(xué)活性的豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋 白；5)將步驟4)中所得到豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白包被ELISA酶標(biāo)板，得到 ELISA抗原酶標(biāo)板，按照ELISA方法檢測(cè)待檢血清，判定結(jié)果；其他核心試劑還包括如下組分包被液為25mmol/L碳酸鹽緩沖液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加雙蒸水至IOOOmL, ρΗ9· 6 ；20 倍濃縮洗滌液:NaC1160g, KC14g, Na2HPO4 · 12H20 58g, KH2P044g, Tween-20 IOml 加 雙蒸水定容至1000ml ；封閉液濃度為5g脫脂乳溶于IOOmL洗滌液中；底物液底物液A :濃度為0. 006%的H2O2緩沖液；底物液B 取Na2HPO4 · 12H20 14. 2g， 檸檬酸10. 5g，用雙蒸水定容至500ml配成濃度為0. ΙΜ,ρΗ為5. 0的磷酸鹽檸檬酸緩沖液， 然后加聯(lián)苯二胺IOmg ；終止液濃度為40%的氫氟酸625 μ L，加雙蒸水定容至IOOmL ；其中步驟1)所述的引物對(duì)的DNA序列如下所示正向引物Pl 5，-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3’，反向引物Ρ2 5，-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3’。
6.權(quán)利要求1或2所述的基因在制備豬鏈球菌2型的抗原蛋白中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型鑒別診斷試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述的抗原蛋白在制備豬鏈球菌2型鑒別診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分泌核酸酶SsnA基因的分離和克隆，將所述的基因通過(guò)大腸桿菌表達(dá)，獲得重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET-28aSsnA)，利用該菌株表達(dá)豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒別診斷方法，用于區(qū)分豬鏈球菌2型滅活疫苗免疫豬與被感染豬。本發(fā)明提供含有豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA的表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a(+))、重組大腸桿菌菌株BL21/pET28a-SsnA、SsnA蛋白的表達(dá)和純化方法以及用該蛋白建立的可區(qū)分豬鏈球菌2型滅活苗免疫豬血清和感染豬血清的鑒別診斷方法。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101935668SQ20101023156
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者康超, 張安定, 李冉, 滑亞峰, 金梅林 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué);武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司