專利名稱：甘蔗黑穗病菌快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體是一種快速、準(zhǔn)確、操作簡單的甘蔗黑穗病菌的檢 測方法。
背景技術(shù)：
甘蔗(officinarum)是我國最重要的糖料作物和經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是一種重要的 能源植物。目前，甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Syd.)已成為世界各植蔗區(qū)的主要病 害之一，其嚴(yán)重危害甘蔗的生產(chǎn)，對(duì)甘蔗的產(chǎn)量和含糖量影響較大，在部分高發(fā)病區(qū)甘蔗黑 穗病的發(fā)病率可達(dá)30%以上，尤其以旱地蔗區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重，因宿根年限的延長、黑穗病孢 子的積累和再侵染，甘蔗黑穗病的發(fā)生率有逐年加重的趨勢(shì)，檢測該病病原菌將有助于甘 蔗抗黑穗病育種研究。甘蔗黑穗病是由黑粉菌引起的一種真菌病害，指示植物法和電鏡技術(shù)檢測法均可 進(jìn)行甘蔗黑穗病菌的檢測，但是由于指示植物法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間且受外界因素影響， 檢測的準(zhǔn)確性和可靠性較差；電鏡技術(shù)檢測能直觀的觀察到病原菌，診斷比較可靠，但儀器 昂貴、程序繁瑣。建立一種快速有效的檢測甘蔗黑穗病的方法，將有利于在發(fā)病前期做好病 原的防治和處理，同時(shí)也為甘蔗抗黑穗病育種工作提供更加有力的證據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗黑穗病菌的檢測方法，能夠快速、準(zhǔn)確地分離并準(zhǔn) 確地檢測甘蔗黑穗病菌。本方法采用彈射接種法將甘蔗黑穗病菌接種于馬丁氏培養(yǎng)基中，使其產(chǎn)生單孢， 挑取甘蔗黑穗病的單孢于液體的馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)出大量的甘蔗黑穗病菌，并提取其基 因組DNA進(jìn)行分子檢測。只需要約一周的時(shí)間，即可以有效地分離和檢測甘蔗黑穗病。本 方法具有快速、高效、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下1.單孢分離采集初形成但尚未破出葉鞘的黑穗病甘蔗植株頂端部分，長約 30-40cm，用無菌牛皮紙信封包好，太陽下爆曬或在60度的烘箱中烤6個(gè)小時(shí)左右，以除去 甘蔗莖干中的部分水分，有利于分離甘蔗黑穗病的單孢菌落。在超凈工作臺(tái)中打開牛皮紙 信封，將采集到的黑穗病甘蔗植株用75%酒精棉球擦洗莖的表面，用手剝開兩片葉鞘，在無 菌報(bào)紙上橫向切開至可見到黑色粉末，即是黑色冬孢子，用經(jīng)滅菌的解剖針挑取少許黑色 冬孢子，彈射接種于馬丁氏培養(yǎng)基表面。為了保證能培養(yǎng)到單孢菌落，同一解剖針挑取的冬 孢子可以敲于多個(gè)培養(yǎng)皿中，28°C黑暗培養(yǎng)，觀察黑粉菌的生長情況，在馬丁氏培養(yǎng)基上獲 得純白色菌絲，密生，初步認(rèn)為分離物是甘蔗黑穗病菌。挑取單孢菌落于含10-50mg/L鏈霉 素馬鈴薯液體培養(yǎng)基中搖菌，28°C，220rpm黑暗培養(yǎng)36小時(shí)左右，可獲得大量的病原菌。2.黑穗病基因組DNA的提取離心收集甘蔗黑穗病菌體，經(jīng)液氮冷凍研磨，以CTAB 法提取甘蔗黑穗病菌的基因組DNA。操作的步驟如下
(1)離心收集甘蔗黑穗病菌體，經(jīng)液氮冷凍研磨，加入少許石英砂和PVP，迅速研 磨；(2)將樣品迅速轉(zhuǎn)移至2. Oml離心管中，加入800μ 1經(jīng)65 °C預(yù)熱的DNA提取緩沖 液(100mmol/L Tris-Cl, pH8. 0 ；20mmol/L EDTA，pH8.0 ； 1. 4mol/LNaCl ；2% CTAB ；2% PVP), 加入4ul β -巰基乙醇，混勻后65°C保溫30min，其間輕柔搖動(dòng)2_3次；(3)取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至乳白 色，室溫靜置IOmin ；(4) 10，OOOrpm,離心 IOmin ；(5)緩慢地用槍頭吸出上清液，轉(zhuǎn)移約600ul至另一 2. Oml無菌離心管中，加入2 倍體積的無水乙醇，輕緩顛倒混勻，-20°C放置30-60min ；(6) 12，OOOrpm,離心 lOmin，棄上清液；(7)用Iml 75%乙醇洗沉淀兩次，吹干，溶于800 μ 1 TE (ρΗ 8. 0)中；(8)加入 2μ 1 5mg/ml 的 RNase，37°C，溫育 Ih ；(9)加入等體積的氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提1-2次，10，OOOrpm離心IOmin ；(10)吸取上清液，加入1/10體積的的NaAc (3mol/L ρΗ 5. 2)和2倍體積的無水乙 醇-20°C放置Ih左右；(11)4°C，12，OOOrpm 離心 IOmin ；(12)棄上清，用75%乙醇洗沉淀兩次；(13)吹干，溶于50 μ 1 ddH20中，_20°C保存。取2 μ 1樣品進(jìn)行電泳分析。3.甘蔗黑穗病的檢測以甘蔗黑穗病菌基因組DNA為模板，采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)(ITS)的通用引物 ITS3 禾Π ITS4, ITS3 :5，-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3，；ITS4 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。擴(kuò)增真菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中的一段，目的片段大小 480bp，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
混勻，稍離心，置于PCR儀上擴(kuò)增，程序如下預(yù)變性94°C，3min ；循環(huán)參數(shù)為94°C，30s ；53°C，30s ；72°C,40s ；30cycles，最后 72°C，7min，4°C保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 瓊 脂糖凝膠電泳分析并照相。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果添加有孟加拉紅與鏈霉素的馬丁氏培基養(yǎng)可抑制放線菌和細(xì)菌生長，在此基礎(chǔ)上 再用馬鈴薯液體培養(yǎng)基對(duì)病原菌進(jìn)行培養(yǎng)，使甘蔗黑穗病的真菌性病原菌能很好地被分離 出來，并能獲得大量的病原菌菌體，效果比較明顯。本發(fā)明用經(jīng)滅菌的解剖針彈射接種法將黑色冬孢子接種于馬丁氏培養(yǎng)基表面，使 用同一解剖針挑取的冬孢子敲于多個(gè)培養(yǎng)基中，保證能培養(yǎng)到病原菌的單個(gè)孢子。與常規(guī) 的利用無菌水稀釋，顯微鏡觀察的方法相比，此方法具有快速、簡單易行、分離效果好等特
點(diǎn)ο利用離心的方法收集菌絲體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的棉花過濾方法，并以CTAB法提取甘蔗黑 穗病菌的基因組DNA，應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，以通用引物對(duì)甘蔗黑穗病菌的基因組DNA進(jìn) 行PCR檢測，通過測序還可以對(duì)分離獲得的真菌進(jìn)行分類鑒定分析等研究，總之，本方法具 有快速、高效、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。
權(quán)利要求
一種甘蔗黑穗病菌快速檢測方法，其特征是在甘蔗黑穗病病發(fā)的甘蔗植株中提取分離獲得甘蔗黑穗病菌，對(duì)甘蔗外表面進(jìn)行的無菌處理，在分離真菌的馬丁氏培養(yǎng)基中篩選獲得單孢菌落，取單孢菌落于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到大量的病原菌；通過CTAB法提取甘蔗黑穗病菌的基因組DNA，以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的通用引物ITS3和ITS4，擴(kuò)增真菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中的一段，目的片段大小480bp，若能擴(kuò)增獲得480bp的目的片段，則初步證明分離獲得了甘蔗黑穗病菌，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序則進(jìn)一步證明分離獲得了甘蔗黑穗病菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗黑穗病菌快速檢測方法，其特征是從田間取回尚未破 出葉鞘的黑穗病甘蔗植株頂端部分，取其頂端30-40cm長的一段作為材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘蔗黑穗病菌快速檢測方法，其特征是將材料置于干 凈的牛皮紙袋子中在太陽下曬或在60度的烘箱中烤6個(gè)小時(shí)左右；在超凈工作臺(tái)中，利用 75%的乙醇對(duì)甘蔗莖干進(jìn)行表面除菌后，剝開兩片甘蔗葉鞘，在無菌報(bào)紙上橫向切開甘蔗， 用接種針挑取橫切面中的黑色冬孢子，采用彈射接種法將一次挑取的黑粉接種于多個(gè)馬丁 氏培養(yǎng)基中，經(jīng)28°C黑暗培養(yǎng)約兩天，得到甘蔗黑穗病的單孢菌落。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗黑穗病菌快速檢測方法，其特征是在馬丁氏培養(yǎng)基上 獲得純白色菌絲，密生，初步認(rèn)為分離物是甘蔗黑穗病菌，利用馬鈴薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得 大量的甘蔗黑穗病菌。
全文摘要
一種甘蔗黑穗病菌檢測方法，在甘蔗黑穗病病發(fā)的甘蔗植株中提取分離獲得甘蔗黑穗病菌，對(duì)甘蔗外表面進(jìn)行的無菌處理，在分離真菌的馬丁氏培養(yǎng)基中篩選獲得單孢菌落，取單孢菌落于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到大量的病原菌；通過CTAB法提取甘蔗黑穗病菌的基因組DNA，以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的通用引物ITS3和ITS4，擴(kuò)增真菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中的一段，目的片段大小480bp，若能擴(kuò)增獲得480bp的目的片段，則初步證明分離獲得了甘蔗黑穗病菌，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序則進(jìn)一步證明分離獲得了甘蔗黑穗病菌。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101880720SQ20101023053
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者劉家勇, 盧文潔, 吳才文, 吳轉(zhuǎn)娣, 夏紅明, 昝逢剛, 李文鳳, 楊昆, 趙俊, 趙培方, 黃應(yīng)昆 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所