專利名稱：促進(jìn)傷口愈合的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種促進(jìn)傷口愈合的組合物，特別是一種以肽為活性成分的組合物。
背景技術(shù)：
通常慢性疾病患者往往會(huì)因?yàn)樯眢w上的不適、不方便造成一些并發(fā)癥，其中，最嚴(yán)重的莫過于糖尿病所造成的衍生并發(fā)癥。糖尿病目前仍為我國十大死因之一，且在全世界均為重要疾病。如果糖尿病沒有得到足夠的控制，可能會(huì)引起一些急性或慢性的并發(fā)癥，如低血糖癥、心血管疾病、慢性腎衰竭、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及微血管(microvascular)病變等；其中，微血管病變可能導(dǎo)致勃起功能障礙(陽痿)以及傷口難以愈合。而若發(fā)生在足部，其難以愈合的傷口則可能導(dǎo)致壞疽(亦即俗稱的“糖尿病足”)，進(jìn)而導(dǎo)致患者截肢。如果糖尿病得到了足夠的控制，并且對(duì)血壓充分控制并結(jié)合良好的生活習(xí)慣(如不吸煙，保持健康的體重等)，則可以在有效的降低罹患上述并發(fā)癥的危險(xiǎn)。初期只是腳部傷口難于愈合，若處理不當(dāng)可引致截肢。若是糖尿病足未能盡快醫(yī)治，可能會(huì)演變成難以復(fù)原的問題傷口 ；如同其它的問題傷口，其雖經(jīng)由傳統(tǒng)一般內(nèi)科或外科治療方法處理，但卻不容易痊愈，這可能是為病人整個(gè)系統(tǒng)性或局部的狀況不容許傷口進(jìn)行正常的修復(fù)工作。這些包括了郁血性的血管病變、 未愈合的傷口、截肢后傷口愈合不好、及糖尿病足者等。若是無法妥善處理，將造成傷口的感染進(jìn)一步的惡化。長期糖尿病的患者，常有血管的病變及末稍神經(jīng)炎的并發(fā)癥。此類病人趾端的感覺因?yàn)樯窠?jīng)炎的關(guān)系，常常喪失知覺，因此經(jīng)常會(huì)碰撞至流血而仍不自知。此類的趾端或下肢的傷口再加上末梢血管的病變和膠原蛋白不正常，非常不容易愈合，而往往演變成慢性潰瘍。截肢的手術(shù)常常一節(jié)一節(jié)的往上切至膝蓋以上。根據(jù)Wagner’ s的分類糖尿病足可分為五度，這種分類由傷口的大小、所到的深度和在整個(gè)足部的位置來描述一種簡單的改良的分類法。它包括了潰瘍所造成的嚴(yán)重缺氧和影響肢體血液循環(huán)的程度。治療這種病人成功的主要秘訣，在于如何將缺氧和已潰爛病變部位的血管重建起來，而及時(shí)改良其惡化的環(huán)境。血管的病變可由輕度的病變到極嚴(yán)重的多處血管病變不等。為了有效治療此等特殊傷口愈合問題，美國食品藥物管理局(FDA)曾批準(zhǔn)一種重組的蛋白質(zhì)藥物Regranex用于傷口愈合以治療糖尿病患者足部潰瘍，但依據(jù)其臨床研究資料，發(fā)現(xiàn)使用“Regranex gel”的患者死于癌癥者較未使用的患者多?！癛egranex gel”是一種重組的血小板衍生生長因子(recombinant PDGF)，衛(wèi)生署核定的適應(yīng)癥為“促進(jìn)全層糖尿病潰瘍小于或等于5公分傷口的愈合”。因生長因子使細(xì)胞分化更快速，故需持續(xù)監(jiān)測(cè)使用“Regranex gel”的癌癥發(fā)生率。美國FDA會(huì)在分析評(píng)估這些臨床研究資料后，再做出對(duì)該藥品的新建議，衛(wèi)生署亦會(huì)密切注意此事的發(fā)展?fàn)顩r，監(jiān)視血小板生長因子的用藥安全，并呼吁醫(yī)師為病患處方血小板生長因子藥品時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎評(píng)估其用藥的風(fēng)險(xiǎn)與效益，以降低不良反應(yīng)的發(fā)生。可見目前市面上可購得用于促進(jìn)傷口愈合的蛋白質(zhì)藥物具有致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)，仍不甚安全。
因此，針對(duì)未來的醫(yī)療需求，亟需開發(fā)一種高安全性的蛋白質(zhì)藥物，以應(yīng)用于促進(jìn)傷口愈合。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種促進(jìn)傷口愈合的組合物，其包含SEQ ID NO. 1的肽為活性成分。本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，該組合物更包括醫(yī)藥上可接受的載體。本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，該活性成分的有效濃度為0. 1微克/毫升至200毫
克/毫升。本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，活性成分的有效濃度為10微克/毫升至150毫克/毫升。本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，該組合物為液體、膏狀、凝膠狀、或噴霧。本發(fā)明所提供的組合物，可用于接觸哺乳動(dòng)物傷口，以促進(jìn)該傷口愈合。本發(fā)明更提供一種肽，其具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明更提供一種核酸分子，其編碼SEQ ID NO. 1的肽。本發(fā)明更提供一種載體，其包含編碼SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子。本發(fā)明更提供一種轉(zhuǎn)型微生物，其包含具有編碼SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子的載體。本發(fā)明復(fù)提供一種制造具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的肽的方法，其是培養(yǎng)包含具有編碼SEQ ID NO. 1的肽的核酸分子的載體的轉(zhuǎn)型微生物，并自該轉(zhuǎn)型微生物的培養(yǎng)基中分離該肽。本發(fā)明的組合物是以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽為活性成分，該肽為黏液蛋白 MUC15片段的重組蛋白。已知GenBank Accession No. BC058007的MUC15蛋白質(zhì)全長為334 個(gè)氨基酸，本發(fā)明所選擇的片段為GenBank Accession No. B C058007的第觀至2 個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID NO. 1所示，將純化所得的重組蛋白進(jìn)行小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組蛋白能促進(jìn)小鼠背上的傷口愈合。本發(fā)明的組合物以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽為活性成分，而可編碼該SEQ ID NO. 1的肽序列的核酸分子均可用于本發(fā)明的選殖，在適當(dāng)?shù)男揎椩鰟h情形之下，多種核酸分子可用于表達(dá)本發(fā)明組合物的肽。本發(fā)明的組合物涂抹于哺乳動(dòng)物傷口上，以促進(jìn)該傷口的愈合。本發(fā)明的組合物依循一般的藥理常識(shí)，其劑型可為液體，包括外用液、擦液、涂液、滴液，或是膏狀，包括乳霜、油膏、軟膏、糊狀劑、以及凝膠狀、或噴霧，其為外用。本發(fā)明的組合物以具有SEQ ID NO. 1的序列的肽為活性成分，該組合物的有效濃度以該肽的具有促進(jìn)傷口愈合效果的濃度為基準(zhǔn)，可依據(jù)傷口種類、面積、以及組合物的劑型等，而分別制備不同濃度的活性成分的組合物，其有效濃度可為0. 1微克/毫升至200毫克/毫升，并可視需要而調(diào)整不同的濃度。MUC15是一種膜結(jié)合式黏液蛋白(membrane-bound mucin)，最初是從牛奶純化而來(Pallesen et al.，2002)。人類的 MUC15 具有細(xì)胞外功能區(qū)域(extracellular domain)、 穿膜功能區(qū)域、以及細(xì)胞質(zhì)尾端(cytoplasmictail)。在許多人類器官中，可通過RT-PCR檢測(cè)到MUC15 mRNA的表達(dá)。本發(fā)明所選用的具有SEQ ID NO. 1的序列的肽位于MUC15黏液蛋白的細(xì)胞外功能區(qū)域，以作為本發(fā)明的組合物的活性成分。如Singh 與 Hollingsworth 的報(bào)導(dǎo)(Trends in Cell Biology, Vol. 16，467-476， 2006)，黏液蛋白(mucins，MUC)為一類具有高度糖化的蛋白質(zhì)，表達(dá)在多種表皮細(xì)胞上， 通過細(xì)胞表達(dá)位置的不同，可將黏液蛋白分為兩類膜結(jié)合式黏液蛋白(membrane-bound mucins)以及分泌式黏液蛋白(secretory mucins) 0分泌式黏液蛋白缺乏穿膜功能區(qū)域 (transmembranedomain)，因此會(huì)分泌到細(xì)胞外，其表達(dá)局限在分泌器官與細(xì)胞，所包含的成員為MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8以及MUC19。膜結(jié)合式黏液蛋白的成員則包括 MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17 以及 MUC20。由相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)可知，黏液蛋白家族種類繁復(fù)，且其型態(tài)功能各異?，F(xiàn)有已上市的唯一治療糖尿病傷口的蛋白質(zhì)藥物為一種經(jīng)過基因工程改造的重組血小板衍生生長因子(recombinant PDGF)，若將本發(fā)明與其相比較，由于FDA警告已上市的此重組PDGF產(chǎn)品有致癌危險(xiǎn)，而本發(fā)明的組合物所選用者為大量存在于乳汁的MUC15 黏液蛋白，具有相當(dāng)?shù)纳锇踩?，因此本發(fā)明較具優(yōu)勢(shì)。故而，關(guān)于本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與精神可以藉由以下發(fā)明詳述及所附圖式得到進(jìn)一步的了解。
圖1為本發(fā)明的純化重組蛋白(rec MUC15)的電泳圖譜。圖2A與2B為濃度100微克/毫升的本發(fā)明重組蛋白促進(jìn)傷口愈合的情形。圖3A與;3B為濃度30微克/毫升的本發(fā)明重組蛋白促進(jìn)傷口愈合的情形。圖4A與4B為濃度100微克/毫升的其它黏液蛋白促進(jìn)傷口愈合的情形。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)MUC15的重組蛋白，在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組蛋白能促進(jìn)小鼠的傷口愈合。實(shí)施例1 重組蛋白的制備本發(fā)明選擇GenBank Accession No. BC058007序列的第沘至2 位氨基酸作為重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明并選殖其對(duì)應(yīng)的基因片段，以用于表達(dá)本發(fā)明的MUC15片段。為了將選擇的基因片段序列接入細(xì)菌表達(dá)蛋白載體中，設(shè)計(jì)5’端具有KpnI限制酶切位的引物(其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示)、以及3’端含有B10I限制酶切位的引物(其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示)，使用前述的引物對(duì)進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)，以選殖標(biāo)的核苷酸片段。將所選殖得到的標(biāo)的核苷酸片段、蛋白質(zhì)表達(dá)載體pET30 (+)(購自Novagen， Madison, WI, USA)分別經(jīng)過限制酶 KpnI (購自 NEB, Ipswich, England)、以及 XhoI (購自 NEB, Ipswich, England)處理后，利用 T4 DNA 結(jié)合酶(Τ4 DNA ligase，購自 TAKARA, Shiga, Japan)作用，使標(biāo)的核苷酸片段與載體接合，再將接合的重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5 α大腸桿菌。隨后利用限制酶圖譜(restriction enzyme mapping)進(jìn)行篩選，再將正確大小的重組載體進(jìn)行DNA測(cè)序確認(rèn)。
將確認(rèn)的重組載體再次轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21大腸桿菌菌株，以表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白。 將轉(zhuǎn)化的BL21菌液涂抹于培養(yǎng)皿上，經(jīng)過37°C、12至14小時(shí)的培養(yǎng)后，挑選一菌落接種于 1毫升(ml)的LB培養(yǎng)液，再經(jīng)過5至8小時(shí)培養(yǎng)后，吸取100微升(μ 1)菌液加入100毫升LB培養(yǎng)液置于250毫升錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液的0. D. 600nm吸光值達(dá)到0. 3時(shí)，加入 ImM 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG ； 購自Sigma-AldrichJt. Louis，M0，USA)以刺激細(xì)菌大量表達(dá)重組蛋白；再培養(yǎng)12至14小時(shí)的后，將菌液打散于含有IOmM咪唑(imidazol ；購自Sigma-Aldrich, St. Louis, M0, USA) 的結(jié)合緩沖液(bind buffer)，再利用超音波震碎。依據(jù)供貨商建議的步驟，將此菌液利用 Ni-NTA His-Bind 樹脂(Ni-NTAHis-Bind resins ；購自 Novagen，Madison, WI, USA)純化， 之后將純化蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析，確定蛋白質(zhì)的大小與產(chǎn)量，其結(jié)果如圖1所示。圖1為本發(fā)明的純化重組蛋白的電泳圖譜。純化后的重組蛋白大約為30kDa，且與對(duì)照組的血清蛋白(BSA)比較后，確定培養(yǎng)100毫升的菌液能純化獲得1毫克的重組蛋白。實(shí)施例2 動(dòng)物傷口愈合試驗(yàn)取14周大、公的、C57B L/6的小鼠8只，先以4%的水化氯醛(10ml/kgchloral hydrate ；購自Merck，Darmstadt, Germany)將小鼠麻醉，刮去小鼠背上的毛發(fā)，并替小鼠背上的皮膚消毒，隨后使用直徑1公分的打洞器在小鼠背上打出兩個(gè)傷口。以2%海藻酸鈉作為對(duì)照組，將濃度100微克/毫升的本發(fā)明重組蛋白(溶于2%海藻酸鈉)作為實(shí)驗(yàn)組，每天分別將溶液涂抹于小鼠背上的傷口，并在隔天拍攝小鼠傷口的情況。以Image-Pro Plus software(購自Media Cybernetics,Bethesda,MD,USA)分別定量不同天數(shù)的的傷口面積， 利用Mudent，s-test統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其結(jié)果如圖2A與2B所示。圖2A與2B為濃度100微克/毫升的本發(fā)明重組蛋白促進(jìn)傷口愈合的情形。由圖2A可見，相較于2%海藻酸鈉的對(duì)照組，本發(fā)明具有顯著地促進(jìn)傷口愈合的效果。以第7 天的情形為例，對(duì)照組的傷口大小為42. 42 士 18. 69平方毫米，而實(shí)驗(yàn)組僅剩24. 75 士 15. 73 平方毫米；至第10天時(shí)，對(duì)照組的傷口大小尚余14. 10士5. 00平方毫米，而實(shí)驗(yàn)組更僅剩 6. 71 士3. 17平方毫米；其統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)如圖2B所示，可見本發(fā)明確實(shí)具有良好的促進(jìn)傷口愈合的效果。另取7周大、公的、C57BL/6的小鼠9只改以較低濃度進(jìn)行測(cè)試，其結(jié)果如圖3A與 3B所示。由圖3A可見，當(dāng)濃度降為30微克/毫升時(shí)，本發(fā)明重組蛋白相較于2%海藻酸鈉的對(duì)照組，圖3B仍明顯具有促進(jìn)傷口愈合的功效。此外，改以MUC20黏液蛋白進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)，以佐證本發(fā)明的功效。取8周大、 公的、BALB/C的小鼠8只配合濃度100微克/毫升的MUC20重組蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖4A與4B所示。圖4A所示由傷口愈合情形可見，MUC20黏液蛋白相較于對(duì)照組，圖4B所示并無明顯促進(jìn)傷口愈合的情形，可知縱使同為黏液蛋白類型的蛋白質(zhì)，并非每一種均具有促進(jìn)傷口愈合的功效，足見本發(fā)明的可貴且具有高度的新穎性與進(jìn)步性。本發(fā)明的權(quán)利要求；凡其它未脫離本發(fā)明所揭示的精神下所完成的等效改變或修飾，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)傷口愈合的組合物，其特征是包含SEQ ID NO. 1的肽為活性成分。
2.如權(quán)利要求1的組合物，其特征是更包括醫(yī)藥上可接受的載體。
3.如權(quán)利要求1的組合物，其特征是其中該活性成分的有效濃度為0.1微克/毫升至200毫克/毫升。
4.如權(quán)利要求1的組合物，其特征是其中該活性成分的有效濃度為10微克/毫升至150毫克/毫升。
5.如權(quán)利要求1的組合物，其特征是其中該組合物為液體、膏狀、凝膠狀、或噴霧。
6.如權(quán)利要求1的組合物，其特征是其可用于接觸哺乳動(dòng)物傷口，以促進(jìn)該傷口愈合。
7.一種肽，其特征是其具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
8.—種核酸分子，其特征是其編碼SEQ ID NO. 1的肽。
9.一種載體，其特征是其包含權(quán)利要求8的核酸分子。
10.一種轉(zhuǎn)型微生物，其特征是其包含具有權(quán)利要求9的載體。
11.一種制造如權(quán)利要求7的肽的方法，其特征是培養(yǎng)權(quán)利要求10項(xiàng)轉(zhuǎn)型微生物，并自該轉(zhuǎn)型微生物的培養(yǎng)基中分離該肽。
全文摘要
本發(fā)明為一種促進(jìn)傷口愈合的組合物，其包含以SEQ ID NO.1的肽為活性成分，該組合物可與哺乳動(dòng)物傷口接觸，以促進(jìn)動(dòng)物傷口愈合。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102258767SQ201010192739
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者謝美英, 黃敏銓 申請(qǐng)人:黃敏銓