專利名稱：一種作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及斜帶石斑魚蛋白的制備領(lǐng)域，具體涉及一種作為飼料添加劑的斜帶石 斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
優(yōu)質(zhì)的促生長飼料添加及能否開發(fā)成功有賴于魚類生長調(diào)控及消化和營養(yǎng)吸收 的相關(guān)基因及基因產(chǎn)品應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)的研究。國內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物的非營養(yǎng)性添加劑，除了 藥物添加劑應(yīng)用較多外，其它使用較少。目前非營養(yǎng)性添加劑的研究開發(fā)已引起重視，主要 應(yīng)用的有微生態(tài)制劑、酶制劑、誘食劑、促生長劑等，都是天然產(chǎn)物或人工合成的化學(xué)產(chǎn)品， 還未見以基因工程方法生產(chǎn)以幾丁質(zhì)酶為主要成分的魚類飼料添加劑產(chǎn)品。脊椎動(dòng)物幾丁 質(zhì)酶分為三類巨噬細(xì)胞特異性幾丁質(zhì)酶，酸性幾丁質(zhì)酶和胰腺特異性幾丁質(zhì)酶。目前魚類 幾丁質(zhì)酶功能的研究顯示分布于胃的酸性幾丁質(zhì)酶主要作用于消化，而魚類中是否存在巨 噬細(xì)胞特異性幾丁質(zhì)酶和胰腺特異性幾丁質(zhì)酶并具有免疫相關(guān)的功能則仍需進(jìn)一步研究。 氨基寡糖可以增進(jìn)魚類的消化和營養(yǎng)吸收，提高免疫力，促進(jìn)魚體的健康生長。因此，利用 巴斯德畢赤酵母重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶，一方面可以直接作為飼料添加劑，直接刺激魚體內(nèi)氨 基寡糖的生成，促進(jìn)魚體的生長，提高免疫力。另一方面，開發(fā)的重組幾丁質(zhì)酶可作為酶制 劑產(chǎn)品，用于對(duì)甲殼類和下雜魚中幾丁質(zhì)的降解，獲得更高價(jià)值的氨基寡糖產(chǎn)品。石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬鯧科(Serranidae)，石斑魚屬(Epin印helus)，有30 多種。石斑魚是一種名貴的海水魚類，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。石斑魚的苗種培育是養(yǎng)殖生 產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，但目前在石斑魚人工養(yǎng)殖中還沒有一種能有效促進(jìn)其苗種生長的餌料 添加劑。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的魚類蛋白在飼料添加劑中的應(yīng)用較少，開發(fā)不全面 的問題，提供一種表達(dá)量高、酶活性高的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，是將含有斜帶石斑魚 幾丁質(zhì)酶1的重組表達(dá)載體上發(fā)酵罐，通過在線控制PH、溶氧、轉(zhuǎn)速、補(bǔ)料方式、誘導(dǎo)劑流加 速度等參數(shù)，得到表達(dá)量高、酶活性高的重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1。本發(fā)明發(fā)酵方法具體包括如下步驟(1)種子培養(yǎng)將含有斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的重組表達(dá)載體在酵母膏蛋白胨葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基YPD上培養(yǎng)，挑取單克隆于最小甘油培養(yǎng)基MGY中繼續(xù)培養(yǎng)后接種，作為上 罐種子液；(2)生物量的累積將種子液加入有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，加入甘油擴(kuò)增培養(yǎng) 菌體，甘油消耗完則補(bǔ)加含有微量元素混合液PTMl的甘油，至菌體濕重達(dá)180 220g/L 時(shí)，停止補(bǔ)加甘油，溶解氧值接近100%時(shí)，繼續(xù)維持無甘油狀態(tài)25 35min ；
(3)甲醇誘導(dǎo)甲醇中加入含有微量元素混合液PTM1，混勻，加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo) 表達(dá)，72 96h后結(jié)束發(fā)酵，離心收集菌體，破碎提取胞內(nèi)蛋白，得到斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶
Io 其中，步驟(2)中所述發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液是無機(jī)鹽培養(yǎng)液BSM，在28°C下用 28% (ν/ν)的氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)液ρΗ至5.0，加入含有微量元素混合液PTMl ；所述含有微量元 素混合液PTMl的添加量為4 5mL/L BSM培養(yǎng)液。作為一種優(yōu)選方案，加入甘油擴(kuò)增培養(yǎng)菌體時(shí)，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置為攪拌速度 500 800rpm，罐內(nèi)壓力為9psi，溫度為28°C，溶解氧值在20體積％以上。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)中所述甘油中含有微量元素混合液PTMl的添加量 是11 13mL/L甘油；步驟(3)中所述甲醇中含有微量元素混合液PTMl的添加量是11 13mL/L 甲醇。本發(fā)明作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法所得的斜帶石斑魚 幾丁質(zhì)酶1，可以作為魚類的飼料添加劑，直接加入到含有蝦皮粉的基礎(chǔ)料中制成成品飼 料。該飼料的投喂方法可以是每天早晚兩次定時(shí)足量投喂，為保證酶活性，飼料室溫放置最 好不要超過一周，大批飼料應(yīng)4°C保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)通過本發(fā)明發(fā)酵方法制備得到的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1為胞內(nèi)表達(dá)重組蛋 白，存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，由于酵母細(xì)胞壁較厚，對(duì)蛋白起到了一定的保護(hù)作用，還可降低蛋 白酶的水解作用，因此可以添加到飼料中；(2)本發(fā)明方法適于高效生產(chǎn)高質(zhì)量的飼料添加劑，制得的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶 1表達(dá)量、酶活性高。
圖1是投喂斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1經(jīng)過8周后，斜帶石斑魚體重的變化；圖2是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)下丘腦NPY mRNA表達(dá)量的影響；圖3是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)下丘腦Orexin mRNA表達(dá)量的影響；圖4是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)垂體GH mRNA表達(dá)量的影響；圖5是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)下丘腦GHRH mRNA表達(dá)量的影響；圖6是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)溶菌酶活力的影響；圖7是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響；圖8是不同濃度的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的影響。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1利用5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1重組菌株pPICZ α A-chl/ GS115(1)種子培養(yǎng)①將_80°C凍存的工程菌 pPICZ α A_chl/GS115 在 YPD 平板上(含 G4180. 5mg/ml)劃線，28°C培養(yǎng)；②培養(yǎng)72h左右，挑取單克隆于5ml MGY培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)中，28°C，250r/ min，振蕩培養(yǎng)16 24h ；③取100 μ 1上述種子液接種于100ml MGY培養(yǎng)基(500ml的錐形瓶)中，共3瓶， 280C，250r/min, 12 14h,至0D600 = 2 6，作為上罐種子液。
(2)生物量的累積①調(diào)校設(shè)備校準(zhǔn)發(fā)酵罐的PH電極、溶氧電極(在28°C時(shí)進(jìn)行)，并進(jìn)行蠕動(dòng)泵的 流量校準(zhǔn)；②配制3L BSM培養(yǎng)液，加入5L發(fā)酵罐，12rC，30min高壓滅菌培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及管 道；③待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液冷卻到28°C時(shí)，用28%氨水調(diào)節(jié)BSM培養(yǎng)基的pH值至5. 0， 而后按照4. 35mlPTMl/L BSM的比例加入PTMl微量元素；④將上述MGY培養(yǎng)菌種加入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵罐培養(yǎng)，此為第一階段即甘油培 養(yǎng)擴(kuò)增菌體，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度500 800r/min，罐內(nèi)壓力9psi，溫度28°C， 設(shè)定DO值(溶解氧)在20%以上，以P-I-D方式控制；⑤此階段每間隔12h取樣1次，測0D600值和菌體濕重，此時(shí)菌體濕重約為90 150g/L ；⑥當(dāng)DO值上升至接近100% (約30h)，說明培養(yǎng)液中甘油已消耗殆盡，轉(zhuǎn)入補(bǔ)充 甘油階段以進(jìn)一步增加菌體密度；⑦按照每升12ml PTMl微量元素的比例在高壓滅菌后的50%甘油中加入PTMl微 量元素，混勻后，以18. 2ml/h/L的速率加入到發(fā)酵罐中，至菌體濕重達(dá)180 220g/L ；⑧停止補(bǔ)加甘油后，觀測DO值上升至接近100 %后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài) 30min，轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段。(3)甲醇誘導(dǎo)斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的表達(dá)①按照12ml/L比例在甲醇中加入PTMl微量元素，混勻后，以3. 6ml/h/L的速率加 入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，維持此低速率2 3h，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境。在 此期間，DO值變得不穩(wěn)定，波動(dòng)較大，在酵母適應(yīng)環(huán)境后，DO值即保持穩(wěn)定，繼續(xù)維持此低 速率補(bǔ)加甲醇2h;②補(bǔ)加甲醇的速率升為7. 3ml/h/L,以此速率維持2h ；③升高補(bǔ)加甲醇的速率為8. 0ml/h/L,同時(shí)監(jiān)測DO值和發(fā)酵液溫度并判斷甲醇是 否過量(停補(bǔ)甲醇觀測DO值變化，若停補(bǔ)甲醇后，DO值在Imin內(nèi)上升幅度大于10%，說明 碳源受限，反之說明甲醇過量)，若碳源不足，則加快補(bǔ)甲醇的速率，若甲醇過量，則應(yīng)調(diào)慢 補(bǔ)甲醇的速率，直到合適的速度；④開始誘導(dǎo)表達(dá)后，每隔12h取樣1次，測0D600值和菌體濕重，分析酵母菌生長 狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，確認(rèn)無雜菌污染，并留菌體用于蛋白分析；⑤誘導(dǎo)發(fā)酵72h后，結(jié)束發(fā)酵。4500rpm，15min離心，收集菌體，-20°C保存；留取 少量上清，-80°C保存，以備后續(xù)檢測使用。發(fā)酵結(jié)束菌體濕重可達(dá)450g/LBSM。實(shí)施例2重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1活性鑒定取2g研磨好的蝦皮粉，加入IOml丙酮，靜置lh，加入40ml 4°C預(yù)冷的HCl終止水解，然后加入50ml 100%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?0min后，將其離心，沉淀用25ml PBS(pH 2. 5)洗 三次，最后將沉淀溶于IOml PBS (pH 2. 5)，_20°C備用。取發(fā)酵所得工程菌加入適量PBS重 懸菌體，利用玻璃珠破碎法提取胞內(nèi)蛋白。取上述蝦皮幾丁質(zhì)提取液0. 2ml、0. Iml蛋白提 取液，再加入 0.2ml PBS (pH 2. 5)混勻，28°C，震蕩反應(yīng) lh，加入 0. 5ml DNS, 100°C, IOmin, 5000rpm離心lmin，540nm進(jìn)行分光光度測活。以不同濃度的N-乙酰葡萄糖氨為標(biāo)準(zhǔn)品做 標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后測的上述發(fā)酵所得重組幾丁質(zhì)酶的活性為75. 9U。實(shí)施例3重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)斜帶石斑魚生長的影響用酵母胞內(nèi)表達(dá)的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)石斑魚幼魚進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)，檢測不同濃度的重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)攝食、生長等宏觀指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)飼料共設(shè)幾丁質(zhì) 酶添加水平4個(gè)，分別為0、5 μ g/g、10 μ g/g、20 μ g/g (幾丁質(zhì)酶/飼料)，其中添加劑量為O 的對(duì)照組添加空載酵母，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)魚桶共15，每桶放20尾魚作為一個(gè)樣本，以 隨機(jī)化區(qū)組配置法編號(hào)分組。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前停食24h，然后分別測量魚的體重(結(jié)果見表 1)，方差分析表明，各組之間初始魚體重沒有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)停食24h分別測量魚的 體重，得到增重量(結(jié)果見表1-1、圖1-2)。每日二次定時(shí)(08:30; 17:00)定量投餌，保證 飽足，投喂期為56天。投喂Ih后，收集殘餌于100目篩絹袋中。實(shí)驗(yàn)前測定飼料含水量和 飼料溶失率，以計(jì)算投餌干重和凈攝食干重。攝食生長試驗(yàn)時(shí)間為2009年6月1日-2009 年7月26日，歷時(shí)56天。表1斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)斜帶石斑魚各生長指標(biāo)的影響(平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤 差) 實(shí)施例4重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)斜帶石斑魚生長代謝及攝食相關(guān)基因表達(dá) 的調(diào)控用酵母胞內(nèi)表達(dá)的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)石斑魚幼魚進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)，檢測不同 濃度的重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)其生長代謝及攝食相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。上述投喂實(shí) 驗(yàn)結(jié)束后，將所有實(shí)驗(yàn)魚抽取血液樣品，然后斷頭處死，取下丘腦、垂體等組織樣品放入液 氮中保存。提取總RNA，用Real-time PCR方法檢測目的基因mRNA表達(dá)水平。cDNA第一鏈的合成1)按照Nra公司的DNase I Kit說明書，用DNase I處理樣品，去除樣品中基因組 污染。反應(yīng)體系如下
反應(yīng)條件37°C，IOmin。2)加入 1 μ 1 的 EDTA 滅活 DNase I，75°C，lOmin。3)根據(jù)TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系如下 反應(yīng)條件42°C，30min；99°C，5min ；4°C，5min。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以RT產(chǎn)物為模板，用目的基因檢測的引物(1.5)擴(kuò)增得到的片段連接入T載體 中，制備感受態(tài)，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，膠回收。用核酸測定儀測定各質(zhì)粒的濃度，并以10倍濃度 梯度稀釋，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，保證樣品的Cp值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上。Real-time PCR 的檢測根據(jù) Τ0Υ0Β0 公司的 SYBR Green Real-time PCRMaster Mix試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系如下
反應(yīng)條件如下94 °C 3min 72 °C lmin最后進(jìn)行溶解曲線分析。結(jié)果如圖2 5所示。實(shí)施例5重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)溶菌酶活力的影響 混勻，37°C準(zhǔn)確水浴15min，立即取出置于0°C以下的冰水浴中3min，逐管取出倒 入Icm光徑比色皿中，530nm處以蒸餾水調(diào)透光度100%，比色，測各管透光度T15 (T15即37°C 水浴15min后的透光度值)。結(jié)果如圖6所示。實(shí)施例6重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響 混勻，室溫放置lOmin，于波長550nm處，Icm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。結(jié)果
如圖7所示。實(shí)施例7重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 室溫放置lOmin，505nm, Icm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值，以各管吸光度值
減去零管吸光度值，所得差值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的卡門氏單位為橫坐標(biāo)，作坐標(biāo)圖。
血清的測定 室溫放置lOmin，505nm, Icm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值，以測定管吸光度 值減去對(duì)照管吸光度值之差值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的AST/GOT活力單位(圖8)。
權(quán)利要求
一種作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)種子培養(yǎng)將含有斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的重組表達(dá)載體在酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基YPD上培養(yǎng)，挑取單克隆于最小甘油培養(yǎng)基MGY中繼續(xù)培養(yǎng)后接種，作為上罐種子液；(2)生物量的累積將種子液加入有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，加入甘油擴(kuò)增培養(yǎng)菌體，甘油消耗完則補(bǔ)加含有微量元素混合液PTM1的甘油，至菌體濕重達(dá)180～220g/L時(shí)，停止補(bǔ)加甘油，溶解氧值接近100％時(shí)，繼續(xù)維持無甘油狀態(tài)25～35min；(3)甲醇誘導(dǎo)甲醇中加入含有微量元素混合液PTM1，混勻，加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)，72～96h后結(jié)束發(fā)酵，離心收集菌體，破碎提取胞內(nèi)蛋白，得到斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其 特征在于步驟(2)中所述發(fā)酵罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液是無機(jī)鹽培養(yǎng)液BSM，在28°C下用28% (ν/ν)的氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)液ρΗ至5. 0，加入含有微量元素混合液PTMl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特 征在于所述含有微量元素混合液PTMl的添加量為4 5mL/L BSM培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特 征在于步驟(2)中加入甘油擴(kuò)增培養(yǎng)菌體時(shí)，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置為攪拌速度500 800rpm， 罐內(nèi)壓力為9psi，溫度為28°C，溶解氧值在20體積％以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特 征在于步驟(2)中所述甘油中含有微量元素混合液PTMl的添加量是11 13mL/L甘油；步 驟(3)中所述甲醇中含有微量元素混合液PTMl的添加量是11 13mL/L甲醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特 征在于所述斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1作為魚類的飼料添加劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法，其特 征在于所述斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1直接加入到含有蝦皮粉的基礎(chǔ)料中，制成成品飼料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種作為飼料添加劑的斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法。本發(fā)明斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的發(fā)酵方法是將含有斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1的重組表達(dá)載體的菌種上發(fā)酵罐，通過在線控制pH、溶氧、轉(zhuǎn)速、補(bǔ)料方式、誘導(dǎo)劑流加速度等參數(shù)，得到表達(dá)量高、酶活性高的重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1。本發(fā)明方法制備得到的重組斜帶石斑魚幾丁質(zhì)酶1為胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白，存在于酵母細(xì)胞內(nèi)，酵母細(xì)胞對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，降低了蛋白酶的水解作用，作為飼料添加劑可以直接添加到飼料中，不必純化蛋白，適合商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/42GK101845428SQ201010191398
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者張艷紅, 李文笙 申請(qǐng)人:中山大學(xué)