專利名稱：用真核表達系統(tǒng)制備泛素結(jié)合酶UbcH10的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，特別涉及一種用真核表達系統(tǒng)制備泛素蛋白質(zhì)降解系 統(tǒng)中的泛素結(jié)合酶UbcHio的方法。
背景技術(shù)：
泛素結(jié)合酶UbcHlO (Ubiquitin-conjugating enzymes UbcHlO)又稱周期蛋白選 擇性泛素載體蛋白E2-C，屬于泛素結(jié)合酶E2家族的成員。在細胞周期調(diào)控過程中，UbcHlO 通過與具有E3連接酶活性的細胞后期促進復(fù)合物APC相互作用，影響有絲分裂紡錘體裝配 檢測點驅(qū)動細胞周期的進展。在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑中，E2蛋白的作用是通過其活 性位點的半胱氨酸與來自El活化酶的泛素以硫酯鍵相連，形成Ub-E2中間體，然后直接轉(zhuǎn) 移或通過E3連接酶轉(zhuǎn)移泛素至靶蛋白，泛素化的靶蛋白被26s蛋白酶體識別而降解。泛素 蛋白酶體系統(tǒng)(UP-S) 具有多種生理調(diào)控功能，該系統(tǒng)功能失常能引起包括腫瘤在內(nèi)的多 種病例損害。Yoshiaki Okamoto等在研究泛素結(jié)合酶E2家庭成員對腫瘤發(fā)生的潛在作用 時，指出UbcHlO是腫瘤相關(guān)性泛素結(jié)合酶。隨著一些與泛素蛋白酶體途徑相關(guān)致病蛋白的發(fā)現(xiàn)以及蛋白酶抑制劑 Bortezomib(Velcade)對多發(fā)性骨髓瘤治療調(diào)控的認可，特異性干涉UP-S的某一環(huán)節(jié)已被 認為是一種很有前途的創(chuàng)新性抗腫瘤治療方法。構(gòu)建泛素結(jié)合酶UbcHlO的真核表達載體， 可為進一步了解其結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種制備容易、特異性高的用真核表達 系統(tǒng)制備泛素結(jié)合酶UbcHlO的方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用真核表達系統(tǒng)制備泛素結(jié)合酶UbcHlO的方法，主要包括如下步驟(1)從大腸癌組織中提取基因組總RNA，以此為模板通過RT_PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)擴 增泛素結(jié)合酶UbcHIO，并將其構(gòu)建至克隆載體pMDIS-T中；(2)通過EcoR I和Hindi II雙酶切構(gòu)建成重組表達載體pcDNA3. I-UbcHlO ；(3)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和序列測定后，轉(zhuǎn)染大腸癌細胞株LoVo，進行 Western-blot (蛋白質(zhì)印跡)分析檢測；(4)經(jīng)Western-blot分析表明構(gòu)建的重組表達載體PCDNA3. I-UbcHlO能在真核表 達細胞中高表達UbcHlO蛋白。本發(fā)明所用的引物序列是根據(jù)Gen Bank中人UbcHlO基因序列通過Primer5. O設(shè) 計軟件設(shè)計的特異性引物，上游引物(Pl)序列為5’-GGAATTCAATGCTTCCCAAAACCGCG-3’，含 EcoR I位點和起始密碼子ATG ；下游引物(P2)序列為5，_CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGGCTGGT -3，，含Hindi II位點和雙終止密碼子TAA、TGA。本發(fā)明實現(xiàn)了泛素結(jié)合酶UbcHlO在真核表達系統(tǒng)的高特異性表達，為進一步進行泛素結(jié)合酶UbcHlO與疾病的關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。圖1為本發(fā)明pMD-UbcHIO載體的構(gòu)建示意圖；圖2為本發(fā)明真核表達載體pcDNA3. I-UbcHlO的構(gòu)建示意圖；圖3為真核表達載體pcDNA3. I-UbcHlO中UbcHlO的測序結(jié)果；圖4為UbcHlO蛋白在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。
具體實施例方式實施例從大腸癌腫瘤組織中提取基因組總RNA，通過PR-PCR擴增目的的基因泛素結(jié)合酶 UbcHIO，根據(jù)Gen Bank中人UbcHlO基因序列通過Primer 5. 0設(shè)計軟件設(shè)計的特異性引 物，上游引物(Pl)序列5，-GGAATTCAATGCTTCCCAAAACCGCG-3，，含EcoR I位點和起始密碼 子 ATG ；下游引物(P2)序列5，-CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGGCTGGT-3，，含 Hindi II 位點和 雙終止密碼子TAA、TGA。擴增的目的基因片段大小為559bp，編碼約179個氨基酸。PCR擴 增的UbcHlO片段與克隆載體pMDIS-T連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，以含有 氨芐抗性基因的LB瓊脂平板篩選陽性克隆。分別提取pMD18-UbcH10重組質(zhì)粒和pcDNA3. 1質(zhì)粒，并進行HindIII和EcoRI雙 酶切；然后瓊脂糖凝膠，100V電泳lh，分離酶切片斷；最后應(yīng)用Qiagen gel extraction kit回收酶切后的UbcHlO片段和pcDNA3. 1大片段，并用T4連接酶進行連接過夜，轉(zhuǎn)化 DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含25 μ g/mL卡那霉素的LB平板，用PCR和酶切初步鑒定陽性克隆 子后測序鑒定。真核表達載體pcDNA3. I-UbcHlO經(jīng)測序證實后，通過轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染大腸癌細胞LoVo，并通過western-blot進行驗證。
權(quán)利要求
一種用真核表達系統(tǒng)制備泛素結(jié)合酶UbcH10的方法，其特征在于主要包括如下步驟(1)從大腸癌組織中提取基因組總RNA，以此為模板通過RT-PCR擴增泛素結(jié)合酶UbcH10，并將其構(gòu)建至克隆載體pMD18-T中；(2)通過EcoR I和HindI II雙酶切構(gòu)建成重組表達載體pcDNA3.1-UbcH10；(3)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和序列測定后，轉(zhuǎn)染大腸癌細胞株LoVo，進行Western-blot分析檢測；(4)經(jīng)Western-blot分析表明構(gòu)建的重組表達載體pcDNA3.1-UbcH10能在真核表達細胞中高表達UbcH10蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用真核表達系統(tǒng)制備泛素結(jié)合酶UbcHlO的方法，其特征在 于所述UbcHlO基因序列的特異性引物中，上游引物序列為5，-GGAATTCAATGCTTCCCAAAACC GCG-3，，含EcoR I位點和起始密碼子ATG ；下游引物序列為5，-CCCAAGCTTATCAGGGCTCCTGG CTGGT-3，，含Hindi II位點和雙終止密碼子TAA、TGA。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，特別涉及一種用真核表達系統(tǒng)制備泛素蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)中的泛素結(jié)合酶UbcH10的方法。本研究中制備的UbcH10蛋白，為今后進一步研究泛素結(jié)合酶UbcH10在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機理奠定了研究基礎(chǔ)，采用雜交瘤技術(shù)獲得UbcH10特異性單克隆抗體或免疫動物獲得多價特異性抗血清，可為腫瘤的基因診斷提供方便。
文檔編號C12N15/85GK101864426SQ20101018484
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者劉賢錫, 陳世敏 申請人:陳世敏