專利名稱：一種采用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，是生物 體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，特別對(duì)維持生物體內(nèi)氧化還原環(huán)境起到十分重要的作用。 谷胱甘肽是屬于含有巰基的、小分子肽類物質(zhì)，具有兩種重要的抗氧化作用和整合解毒作 用。谷胱甘肽分子結(jié)構(gòu)中半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)(故谷胱甘肽常簡寫為G-SH)，易 與碘乙酸、芥子氣(一種毒氣)、鉛、汞、砷等重金屬鹽絡(luò)合，而具有了整合解毒作用。谷胱 甘肽(尤其是肝細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽)具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能與某 些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、重金屬)等結(jié)合，參與生物轉(zhuǎn)化作用，從而把機(jī)體 內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，排泄出體外。它在臨床醫(yī)藥、食品工業(yè)、運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)上的應(yīng) 用不斷增加，需求量不斷增加。在臨床上谷胱甘肽用于治療和預(yù)防腫瘤、肝炎及肝損傷、解 毒、輻射病及輻射防護(hù)、抗過敏、改善某些疾病的病程和癥狀、養(yǎng)顏美容護(hù)膚、增加視力及眼 科疾病和抗衰老等作用。在內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的治療中效果明顯，并具有改善性功能、消除疲勞及 抑制艾滋病病毒的作用。作為一抗氧化劑在現(xiàn)代食品加工業(yè)中廣范使用，并能增強(qiáng)食品營 養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味。谷胱甘肽的另一主要生理作用是作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能夠清除掉人 體內(nèi)的自由基，清潔和凈化人體內(nèi)環(huán)境污染，從而增進(jìn)了人的身心健康。由于還原型谷胱甘 肽本身易受某些物質(zhì)氧化，所以它在體內(nèi)能夠保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被如 自由基等有害物質(zhì)氧化，從而讓蛋白質(zhì)和酶等分子發(fā)揮其生理功能。人體紅細(xì)胞中谷胱甘 肽的含量很多，這對(duì)保護(hù)紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，防止溶血保護(hù)紅細(xì)胞免 遭氧化性破壞具有重要意義，而且還可以保護(hù)血紅蛋白不受過氧化氫氧化、自由基等氧化 從而使它持續(xù)正常在發(fā)揮運(yùn)輸氧的能力。紅細(xì)胞中部分血紅蛋白在過氧化氫等氧化劑的作 用下，其中二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，使血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去了帶氧能力。 還原型谷胱甘肽既能直接與過氧化氫等氧化劑結(jié)合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能夠?qū)?高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白，提高體內(nèi)血紅蛋白的含量。另外，維生素C也是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑。由于維生素C能可逆地加氫或脫 氫，故維生素C在體內(nèi)許多氧化還原反應(yīng)中有重要作用。例如，許多酶的活性基團(tuán)是巰基 (-SH)，維生素C能夠維持-SH處于還原狀態(tài)而保持酶的活性；維生素C可以使氧化型谷胱 甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽(GSH)，使機(jī)體代謝產(chǎn)生的過氧化氫(H202)還原；維生素C還 可保護(hù)維生素A、E及某些B族維生素免受氧化。因此，運(yùn)用谷胱甘肽時(shí)，與維生素C并用， 能夠提高其功效。GSH對(duì)于放射線、放射性藥物或由于抗腫瘤藥物引起的白細(xì)胞減少等癥狀能起到 保護(hù)作用。GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合，并促其排出 體外，起到中和解毒作用。SH還可保護(hù)細(xì)胞膜，使之免遭氧化性破壞，防止紅細(xì)胞溶血及促進(jìn)高鐵血紅蛋白的還原，對(duì)缺氧血癥、惡心及肝臟疾病引起的不適具有緩解作用。最新研究 還表明，GSH能夠糾正乙酰膽堿、膽堿酯酶的不平衡，起到抗過敏作用，還可防止皮膚老化及 色素沉著，減少黑色素的形成，改善皮膚抗氧化能力并使皮膚產(chǎn)生光澤，另外，GSH在治療眼 角膜病及改善性功能方面也有很好作用。谷胱甘肽具有的廣譜解毒作用，不僅可用于藥物， 更可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用，隨 著肽類物質(zhì)研究的不斷深入，肽類物質(zhì)具有的神奇功能不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)人體的健康事業(yè)發(fā)揮 越來越大的作用.第一個(gè)谷胱甘肽制備專利發(fā)表在1938年，隋后各國科學(xué)家對(duì)它的生產(chǎn)開發(fā)進(jìn)行 了大量研究?？偟恼f來生產(chǎn)谷胱甘肽的方法有萃取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵 法。萃取法是從含GSH的動(dòng)植物中提取。由于含量太低此方法沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?；瘜W(xué)合 成法曾用于早期GSH生產(chǎn)，但工藝復(fù)雜，得到的產(chǎn)品為混旋體，分離困難，產(chǎn)品純度不高。酶 轉(zhuǎn)化法目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。在目前的4種方法中微生物發(fā)酵法最具有潛力。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH在我國研究主要是從上世紀(jì)90年代開始的，取得了一些成 績，但國內(nèi)發(fā)酵水平一直停留在2 3g/L，如中國專利CN200710036925. 1公開的發(fā)酵法 合成谷胱甘肽的方法。雖然中國專利CN200810019761. 6 一種谷胱甘肽的發(fā)酵工藝，也公 開了利用經(jīng)過基因工程改造甲醇利用型酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，谷胱甘肽產(chǎn)量可以達(dá)到 6. 6g/L，但與國際水平7 10g/L(日本協(xié)和發(fā)酵)還有較大的距離。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽GSH的方法，其在含有蛋白水解 物為10 20g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以產(chǎn)朊假絲酵母Candidautilis(Henneberg)Lodder & Kreger-van Rij作為菌種發(fā)酵65 75小時(shí)，即可得到還原型大于98%，產(chǎn)量為7 10g/ L的谷胱甘肽。并當(dāng)發(fā)酵生長10 20小時(shí)后，滴加復(fù)合維生素B和含硫氨基酸，加入量分別為 0. 5 lg/L，及1 2g/L，至發(fā)酵終止前8小時(shí)停止滴加。本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖70g，酵母提取物20g，蛋白水解物 20g，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，三氯化鐵0. Olg，水1000ml, pH 6. 0 7. 0。 所述蛋白水解物包括但不限于植物水解蛋白、動(dòng)物水解蛋白。所述的復(fù)合維生素B包含但不限于Bl、B2、B6、葉酸，其濃度為0.05-0. lg/ L。優(yōu)選的復(fù)合維生素B由B1、B2、B6、葉酸組成，其比例為Bl B2 B6 葉酸= 2 0. 2 0. 1 1。所述的含硫氨基酸包括但不限于L-蛋氨酸、L-半胱氨酸，其濃度為0. 01-0. 02g/ L0發(fā)酵培養(yǎng)溫度28 32°C，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溶解氧不低于20%。決定發(fā)酵成敗的因素有三菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，這三者相互依存。發(fā)明人在 對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行選育和培養(yǎng)條件研究的同時(shí)，重點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，在發(fā)酵培養(yǎng)基中 加入蛋白水解物，并在發(fā)酵過程中滴加復(fù)合維生素B及含硫氨基酸。本發(fā)明采用藥典推薦菌種產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis (Henneberg) Lodder & Kreger-van Rij)作為發(fā)酵菌種。
本發(fā)明使用斜面、種子、發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法如下斜面培養(yǎng)基12Brix 麥芽汁1000ml蛋白胨4g瓊脂16 20gpH 自然種子培養(yǎng)基葡萄糖30g蛋白胨20g酵母浸提物20g水 1000ml pH 6. 5 7. 2發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖70g酵母提取物20g蛋白水解物20g磷酸二氫鉀0. 5g硫酸鎂0. 5g三氯化鐵0. Olg水 1000ml pH 6. 0 7. 0搖瓶種子培養(yǎng)斜面種子挖塊接種于種子培養(yǎng)基中，28_32°C培養(yǎng)16_24小時(shí)，搖 床轉(zhuǎn)速200-220rpm。菌濃度大于15% (3000rpm 10分鐘)、PH約5. 5-6. 2，無雜菌污染。此 種子可接種于發(fā)酵搖瓶或接種于二級(jí)種子瓶或種子罐。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)500ml搖瓶內(nèi)裝發(fā)酵培養(yǎng)基60-70ml，接種量3-5% (V/V)，28-32°C 培養(yǎng)65-75小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200-220rpm。在培養(yǎng)時(shí)間10-20小時(shí)滴加復(fù)合維生素B，其濃度 0. 05-0. lg/L，最終加量0. 5-lg/L ；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其濃度0. 01-0. 02g/L,最 終加量l_2g/L。放瓶前8小時(shí)不再滴加。發(fā)酵罐培養(yǎng)50L發(fā)酵罐內(nèi)裝30L發(fā)酵培養(yǎng)基，用二級(jí)種子，接種量3_5% (V/V)， 28-32°C培養(yǎng)65-75小時(shí)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速350-500rpm。在培養(yǎng)時(shí)間10-20小時(shí)滴加復(fù)合維 生素B，其濃度0. 05-0. lg/L,最終加量0. 5-lg/L ；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸其濃度 0. 01-0. 02g/L，最終加量l_2g/L。在放罐前8小時(shí)不再滴加。GSH是一種重要的化合物在臨床上及食品工業(yè)中有著廣泛的用途，并隨著對(duì)它的 深入研究用途會(huì)更加廣泛。但我國GSH發(fā)酵水平一直沒有根本的突破，目前仍從日本進(jìn)口。 本專利通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蛋白水解物并在發(fā)酵過程中滴加特定比例的復(fù)合維生素 B、含硫氨基酸，極大地提高了 GSH產(chǎn)量，這將改變長期依賴進(jìn)口的狀況。對(duì)我國醫(yī)藥和食品 工業(yè)的發(fā)展均具有重大的意義。我們的創(chuàng)新點(diǎn)在于通過對(duì)培養(yǎng)基的大量研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲母在培養(yǎng)條件不變 情況下(如培養(yǎng)溫度、溶解氧、發(fā)酵時(shí)間)在培養(yǎng)基中加入蛋白水解物、復(fù)合維生素及含硫 氨基酸，發(fā)酵水平可達(dá)7 10g/L。目前我國藥用GSH全部依賴進(jìn)口，而每年需求量30 50噸。我們的發(fā)明可以改變依賴進(jìn)口的局面。以下的具體實(shí)施方式
是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并非對(duì)本發(fā)明的限制，任 何基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容作出的變形都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
具體實(shí)施例方式1.胃禾中(Candida uti 1 is (Henneberg) Lodder&Kreger-van Rij)2.培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基12Brix 麥芽汁1000ml蛋白胨4g瓊脂16 20gpH 自然種子培養(yǎng)基葡萄糖30g蛋白胨20g酵母浸提物20g
水 1000ml pH 6. 5 7. 2發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖70g酵母提取物20g蛋白水解物20g磷酸二氫鉀0. 5g硫酸鎂0. 5g三氯化鐵0. Olg水1000mlpH 6.0 7.03.種子培養(yǎng)斜面種子挖塊接種于種子培養(yǎng)基中，28_32°C培養(yǎng)16_24小時(shí)，搖床 轉(zhuǎn)速200-220rpm。收集菌體(3000rpm 10分鐘)，菌濃大于15% (V/V)、pH約5. 5-6. 2，無 雜菌污染。此種子可接種于發(fā)酵搖瓶或接種于二級(jí)種子瓶或種子罐。4.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)500ml搖瓶內(nèi)裝發(fā)酵培養(yǎng)基60-70ml，接種量3-5% (V/V)，28 32°C培養(yǎng)65-75小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200-220rpm。在培養(yǎng)時(shí)間10-20小時(shí)滴加復(fù)合維生素B，其 濃度0. 05-0. lg/L，最終加量0. 5-lg/L ；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其濃度0. 01-0. 02g/ L，最終加量l_2g/L。在放瓶前8小時(shí)不再滴加。5.發(fā)酵罐培養(yǎng)50L發(fā)酵罐內(nèi)裝30L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量3_5% (V/V)，28 32°C 培養(yǎng)65 75小時(shí)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速350-500rpm。在培養(yǎng)時(shí)間10-20小時(shí)滴加復(fù)合維生素B，其 濃度0. 05-0. lg/L，最終加量0. 5-lg/L ；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其濃度0. 01-0. 02g/ L，最終加量l_2g/L.在放罐前8小時(shí)不再滴加.6.發(fā)酵液GSH的測定取一定量發(fā)酵液加5倍量甲醇，超聲波處理40分鐘，離心，上清液注入高效液相色 譜儀測定GSH含量。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白水解物，可以自己制備，也可以使用市售的動(dòng)物或 植物蛋白胨，本發(fā)明優(yōu)選的蛋白水解物為魚膠原多肽(成都?？瞪锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)) 或植物水解蛋白(HVP)(鄭州天通食品配料有限公司生產(chǎn))。實(shí)施例1按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不加蛋白水解物， 不滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 26. Omg/L/h ；GSH 含量 2.0g/L還原型GSH85%。實(shí)施例2按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入蛋白水解物 20g/L(其中動(dòng)物蛋白水解物10g/L，植物蛋白水解物10g/L)，滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨 酸或L-半胱氨酸2g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 129. Omg/L/h ；GSH 含量 9. 7g/L還原型GSH 為 98. 6%。實(shí)施例3按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不加蛋白水解物， 滴加復(fù)合維生素Blg/L及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸加量2g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 45. 0mg/L/h ；GSH 含量 3.5g/L
還原型GSH 為 96%。實(shí)施例4按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中只加入動(dòng)物蛋白水 解物20g/L，滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 122. Omg/L/h ；GSH 含量 9.1g/L還原型GSH 為 98. 3%。實(shí)施例5按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中只加入植物蛋白水 解物20g/L，滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 120. Omg/L/h ；GSH 含量 9.0g/L還原型大于98. 2%。實(shí)施例6按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入蛋白水解物 20g/L,但不滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 59. Omg/L/h ；GSH 含量 5.1g/L還原型GSH 為 96%。實(shí)施例7按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不加蛋白水 解物，不滴加復(fù)合維生素B及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 39. Omg/L/h ；GSH 含量 3.0g/L還原型為86.5%。實(shí)施例8按照說明書所述的GSH發(fā)酵條件，在50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入蛋白水 解物20g/L(其中動(dòng)物蛋白水解物10g/L，植物蛋白水解物10g/L)，滴加復(fù)合維生素Blg/L 及L-蛋氨酸或L-半胱氨酸2g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GSH 產(chǎn)率 130. Omg/L/h ；GSH 含量 9. 8g/L還原型GSH 為 99%。綜上所述，本發(fā)明的發(fā)酵方法可以大幅提高終產(chǎn)物中谷胱甘肽的產(chǎn)量，可大大降 低谷胱甘肽的成本，為我國醫(yī)藥和食品工業(yè)生產(chǎn)提供成本低廉的原料。
權(quán)利要求
一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于包含如下步驟1)種子培養(yǎng)將斜面生長的產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis(Henneberg)Lodder&Kreger-van Rij接種于種子培養(yǎng)基中，28-32℃培養(yǎng)16-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200-220rpm，3000rpm 10分鐘離心收集菌體，制備成菌濃度大于15％(V/V)，PH約5.5-6.2的菌液備用；2)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟1)的菌液接種至含有蛋白水解物10～20g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量3-5％(V/V)，28-32℃培養(yǎng)65-75小時(shí)，在培養(yǎng)時(shí)間10-20小時(shí)時(shí)滴加復(fù)合維生素B，其最終加量0.5-1g/L；滴加L-蛋氨酸或L-半胱氨酸，其最終加量1-2g/L；終止發(fā)酵前8小時(shí)停止滴加；得到還原型大于98％，產(chǎn)量為7～10g/L的谷胱甘肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖70g，酵母 提取物20g，蛋白水解物20g，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，三氯化鐵0. 018，水1000ml， pH6. 0 7. 0 ；所述蛋白水解物包括植物水解蛋白或動(dòng)物水解蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的復(fù)合維生素B包含Bi、B2、B6、葉酸 的一種或幾種，濃度為0. 05-0. lg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述復(fù)合維生素B由B1、B2、B6、葉酸組成， 其比例為 Bl B2 B6 葉酸=2 0. 2 0. 1 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述L-蛋氨酸或L-半胱氨酸的濃度為 0.01-0. 02g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧不低于20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蛋白水解物、復(fù)合維生素B，并將無機(jī)硫源改為有機(jī)硫源而大幅提高谷胱甘肽產(chǎn)量的方法。本發(fā)明采用產(chǎn)朊假絲酵母為谷胱甘肽生產(chǎn)菌株，其在含有蛋白水解物、復(fù)合維生素和有機(jī)硫的發(fā)酵培養(yǎng)基中谷胱甘肽的產(chǎn)量可達(dá)7～10g/L，還原型大于98％。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在其它培養(yǎng)條件相同的情況下谷胱甘肽產(chǎn)量大幅提高，生產(chǎn)成本大幅降低，將改變谷胱甘肽依賴進(jìn)口的局面。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101880702SQ20101017685
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者何璧梅, 劉忠榮, 吳四靈, 李玲, 湯華釗, 肖友元 申請(qǐng)人:成都自豪藥業(yè)有限公司