專利名稱：昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和 dsRNA致死害蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)害蟲為害是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的重要制約因素，長期施用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致一系列 問題1)昆蟲出現(xiàn)抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重； 3)對(duì)非靶標(biāo)生物有較大影響?，F(xiàn)有生物殺蟲劑在害蟲防治中應(yīng)用較廣，但殺蟲時(shí)間較長且 效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，2006 年獲諾貝爾獎(jiǎng)。RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為人類疾 病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature Biotechnology”雜志先后兩篇 論文報(bào)道了施用表達(dá)靶向害蟲重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GSTl的dsRNA轉(zhuǎn) 基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum et al,2007 ；Mao et al，2007)。2008年， Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術(shù)的害蟲防治具有 如下優(yōu)勢1)選擇對(duì)害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對(duì)高等動(dòng)物和人類是安全的；2)抗蟲具有 專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無殺傷作用；3)對(duì)環(huán)境無毒無害。研究表明，RNA干擾技術(shù)能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領(lǐng)域具有重要 的發(fā)展前景。而實(shí)現(xiàn)基于RNAi進(jìn)行害蟲有效控制的關(guān)鍵是篩選對(duì)昆蟲高效致死的dsRNA。幾丁質(zhì)合成和代謝是昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其它高等動(dòng) 物沒有幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)合成系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)合 成酶在昆蟲幾丁質(zhì)合成的最后一步起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)合成酶 dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段，由基因片段合成的 dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO 1。是通過設(shè)計(jì)昆蟲幾丁質(zhì)合成酶的簡并引物后，PCR擴(kuò)增獲得，命名為OcCHSl，其長度為 312bp，編碼104個(gè)氨基酸。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID N0 2，是根據(jù)SEQ ID NO 1設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID NO 3和下游引物SEQ ID NO :4，通過PCR擴(kuò) 增獲得。進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒合成dsRNA。dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用注射dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明dsRNA可以特異 性地沉默幾丁質(zhì)合成酶1基因的mRNA表達(dá)，昆蟲因蛻皮困難死亡。
圖1 :3齡中華稻蝗若蟲注射dsRNA后對(duì)昆蟲生長發(fā)育的影響。注射dsRNA的實(shí)驗(yàn) 組出現(xiàn)蛻皮困難死亡的表型(1為注射dsGFP的對(duì)照組，2注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段1的獲得1)PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)已知昆蟲幾丁質(zhì)合成酶的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)了如下簡并性引物上游引 物CHSlF 5' -GAYGGNGAYATHGAYTT-3，下游引物CHSlR 5' -TCYTCNCCYTGRTCRTA-3 ‘；所 有引物均由上海英濰捷基生物有限 公司合成。2)中華稻蝗總RNA的獲得選取大小一致雌雄各半中華稻蝗5齡若蟲的體表，四頭一組，冷凍于液氮中，待提 取RNA，提取RNA的具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。3)中華稻蝗第一鏈cDNA合成第一鏈cDNA 合成步驟參照 SMART RACE cDNA Amplification 試劑盒。4) PCR 擴(kuò)增以上述第一鏈cDNA為模板，根據(jù)Taq多聚酶(TIANGEN)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將 所擴(kuò)增的片段進(jìn)一步克隆、測序。5)序列分析利用Expasy網(wǎng)站中相關(guān)在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列， 在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定所獲得的基因片段為中華稻蝗幾 丁質(zhì)合成酶1基因片段1。實(shí)施例2 中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2的獲得根據(jù)實(shí)施例1獲得的中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段1的核苷酸序列，采用 primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO :3，下游引物序列為 SEQ IDNO :4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取大小一致雌雄各半中華 稻蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試 劑盒。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì) 合成酶基因片段，Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒進(jìn)行純化。實(shí)施例3 中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2的dsRNA的獲得用實(shí)施例2獲得的幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2，按照T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1. 5%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測其單一性，用酶標(biāo)儀(Molecular Devices SpectraMax 190，Menlo Park,CA,USA) 將其定量至終濃度為1 μ g/μ L。保存至_70°C備用。實(shí)施例4 幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2的dsRNA致死中華稻蝗實(shí)驗(yàn)1)中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2的dsRNA注射選取3齡第四天大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的dsRNA。 25μ 1規(guī)格微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過大，順著血液流動(dòng)的方向，側(cè)腹部第2 至3腹節(jié)的連接處作為注射點(diǎn)，要避開氣門。注射dsRNA的量為3 μ g，并設(shè)置dsGFP (3 μ g)的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各25頭。注射完畢后，將蟲子用IL的燒杯至于人工氣候箱中進(jìn)行飼養(yǎng)(光照黑暗時(shí)間=14h 10h，溫度30士2°C，濕度60%)，給以新鮮小麥幼苗和適 當(dāng)?shù)墓庹?，噴水保持濕度?)注入dsRNA后中華稻蝗表型的觀察若蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時(shí)地觀察。注射dsRNA中華稻蝗實(shí)驗(yàn)組有部分若蟲因蛻皮困難而死亡。3)注入dsRNA后中華稻蝗死亡情況的觀察注射dsRNA的中華稻蝗實(shí)驗(yàn)組死亡率為80%。這與注射dsGFP的對(duì)照組(死亡率為0%)相比，致死效果明顯。
權(quán)利要求
一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID N0:2。
3.如權(quán)利要求2所述的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2合成的dsRNA。
4.如權(quán)利要求3所述的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段2合成的dsRNA在致死害蟲 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶1的基因片段及其dsRNA的應(yīng)用，通過對(duì)中華稻蝗幾丁質(zhì)合成酶1的克隆和測序，得到核苷酸序列為SEQ ID NO1的幾丁質(zhì)合成酶基因1，從中選出序列為SEQ ID NO2的幾丁質(zhì)合成酶基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入昆蟲的體腔后，昆蟲因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101831444SQ20101016360
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者劉曉健, 張建珍, 楊美玲, 郭亞平, 馬恩波 申請人:山西大學(xué)