專利名稱：：一種根據(jù)煙葉加工實際溫度來測定煙葉酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種根據(jù)煙葉加工實際溫度來測定煙葉酶活力的方法，屬于煙草應用
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：煙葉的加工過程使煙葉品質(zhì)發(fā)生了很大的變化，如自然陳化、打葉復烤、潤葉和制絲過程。普遍認為，煙葉酶對煙葉品質(zhì)的形成起了重要作用。例如α-淀粉酶是煙葉中的淀粉降解的重要酶。蛋白酶煙草蛋白質(zhì)降解的重要酶。多酚氧化酶是煙葉中酶促棕化反應的重要酶，可使多酚氧化生成與香氣有關(guān)的物質(zhì)，并使煙葉顏色加深。脂氧合酶是類胡蘿卜素降解的關(guān)鍵酶，類胡蘿卜素在脂氧合酶作用下氧化分解的中間產(chǎn)物香葉醇、紫羅蘭酮、紫黃質(zhì)、黃質(zhì)醛等是煙葉重要的致香物質(zhì)，對煙葉香氣品質(zhì)的改善具有重要意義。苯丙氨酸裂解酶是煙葉苯丙氨酸代謝中的重要酶，煙葉中許多重要揮發(fā)性香氣成分如苯甲醇、苯乙醇等的形成與其代謝有密切關(guān)系。根據(jù)大量文獻報道，這五種酶對煙葉品質(zhì)的形成有重要影響。因此，為了深入了解煙葉加工過程中各種工序?qū)熑~品質(zhì)形成的作用，通常需要測定煙葉酶活力的變化。文獻報道煙葉酶活力的測定方法主要來自于植物生理學，測定溫度都是各種酶的最適宜反應溫度(即標準溫度)，范圍從37°C--40°C。例如α-淀粉酶為37-40°C，蛋白酶為37°C，多酚氧化酶為35-37°C，脂氧合酶為35°C和苯丙氨酸裂解酶為30-35°C。重要文獻如下1.朱廣廉，鐘誨文，張愛琴；植物生理學實驗；北京大學出版社1990年2.李合生；植物生理生化實驗原理和技術(shù)；高等教育出版社2000年3.中國科學院上海植物生理研究所，上海市植物生理學會編；現(xiàn)代植物生理學實驗指南；科學出版社1999年4.BerkelyHD.MeasurementofLipoxygenaseactivityincrudeandpartiallyrurifiedpotatoextracts.J.Food.Sci.,1976,15:14751479.5.張志良.植物生物化學技術(shù)與方法.北京農(nóng)業(yè)出版社，1986.6.趙銘欽，邱立友，張維群，等；陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究；華中農(nóng)業(yè)大學學報,2000，19(6)537-5427.宮長榮，林學梧，李艷梅；煙葉在烘烤過程中脂氧合酶活性及其作用的研究；西北農(nóng)業(yè)大學，1999，8(4)63-668.朱大恒，陳再根，陳銳，等；烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關(guān)系的研究；中國煙草科學，2001，226-30文獻報道的測定溫度是酶活力達到最大值時的最適宜溫度，并沒有考慮煙葉加工過程中的實際溫度。在實際溫度下，各種酶反應無法達到最適宜溫度，因此，如果按照標準溫度測定，就無法真實了解實際煙葉加工過程中的酶活力變化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不能反應煙葉加工過程中酶活力的真實情況的不足，而提供一種根據(jù)煙葉加工實際溫度來測定煙葉酶活力的方法。本發(fā)明根據(jù)煙葉加工實際溫度，調(diào)整現(xiàn)有煙葉酶活力測定的溫度，使之與煙葉加工過程中的實際溫度相符合，更能客觀反映煙葉加工過程中煙葉酶活力的影響，為探索通過酶作用提高煙葉品質(zhì)提供更為客觀的研究方法。本發(fā)明的方法是在現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上的改進，其改進點在于1、在煙葉加工過程中酶活力的測定溫度為加工實際溫度。本發(fā)明針對煙葉加工過程中不同工序有不同的加工溫度，將酶活力測定的溫度定為煙葉實際加工溫度。2根據(jù)不同陳化地點的環(huán)境溫度來測定陳化煙葉的五種酶活力。本發(fā)明選擇了兩陳化地點的環(huán)境平均溫度來測定陳化煙葉的五種酶活力，環(huán)境平均溫度為15°C或25°C，五種酶活力的標準檢測溫度為α-淀粉酶為37_40°C，蛋白酶為37°C，多酚氧化酶為35-37°C，脂氧合酶為35°C和苯丙氨酸裂解酶為30_35°C。調(diào)整溫度后測定的五種酶活力與標準測定溫度下的酶活力明顯差異，更能反映煙葉陳化的真實狀況。本發(fā)明的優(yōu)點在于更能客觀反映煙葉加工過程中煙葉酶活力的影響，為探索通過酶作用提高煙葉品質(zhì)提供更為客觀的研究方法。圖1玉溪陳化煙葉兩種測定溫度下多酚氧化酶活力比較。圖2元江陳化煙葉兩種測定溫度下多酚氧化酶活力比較。圖3玉溪陳化煙葉兩種測定溫度下α-淀粉酶活力比較。圖4元江陳化煙葉兩種測定溫度下α-淀粉酶活力比較。圖5玉溪陳化煙葉兩種測定溫度下脂氧合酶活力比較。圖6元江陳化煙葉兩種測定溫度下脂氧合酶活力比較。圖7玉溪陳化煙葉兩種測定溫度下苯丙氨酸裂解酶活力比較。圖8元江陳化煙葉兩種測定溫度下苯丙氨酸裂解酶活力比較。具體實施例方式1、試驗方法a.煙葉粗酶液制備稱取2g煙葉樣品，加入0.1MPH7.0的磷酸緩沖液15ml，混勻，超聲震蕩30分鐘，3000g/分離心lOmin，過濾即得酶液，4度保存?zhèn)溆?。b.酶活力測定α-淀粉酶、蛋白酶、多酚氧化酶采用現(xiàn)有方法文獻[1]朱廣廉的方法測定；脂氧合酶采用現(xiàn)有方法文獻[^Berkeley等的方法測定；苯丙氨酸裂解酶采用現(xiàn)有方法文獻[5]張志良等的方法測定。2.不同測定溫度對酶活力的影響每一種酶都有最適的反應溫度，而酶活力的測定都是選取最適的溫度條件進行。我們在35°C、45°C、55°C條件下測定標準耐高溫α-淀粉酶、耐中溫α-淀粉酶和中性蛋白酶的酶活力，結(jié)果見表1。從表中可看出在不同溫度下，耐高溫α-淀粉酶和中性蛋白酶隨溫度的升高，酶活性升高，55°C最高。而耐中溫α-淀粉酶45°C較高，55°C酶失活。表1不同測定溫度下的標準酶活力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>改變煙葉酶活力測定的溫度，在35°C、45°C、55°C條件下測定，獲得的數(shù)據(jù)見表2，從表中可看出α-淀粉酶在55°C時的酶活力顯著高于35°C和45°C，35°C和45°C時的酶活力基本無差異。蛋白酶在45°C時的酶活力高于35°C和55°C，但三個溫度下測定的酶活力無明顯差異。多酚氧化酶在45°C和55°C時的酶活力顯著高于35°C，但45°C和55°C之間無差另O。脂氧合酶在35°C和55°C時的酶活力顯著高于45°C，但35°C和55°C之間無差別。苯丙氨酸裂解酶在35°C和45°C時的酶活力顯著高于55°C，但35°C和45°C之間無顯著差別。表2不同測定溫度下的煙葉酶活力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3、不同陳化地點煙葉的酶活力測定在環(huán)境溫度和標準溫度下的比較玉溪陳化倉庫平均溫度15°C，元江陳化倉庫平均溫度25V，為了考察這兩個陳化地點煙葉的五種酶活力的差異，采用了環(huán)境實際溫度來測酶活力，玉溪陳化的煙葉五種酶活力的測定統(tǒng)一采用15°C，元江陳化的煙葉五種酶活力的測定統(tǒng)一采用25°C。而五種酶活力的標準檢測溫度如下α-淀粉酶為37-40°C，蛋白酶為37°C，多酚氧化酶為35_37°C，月旨氧合酶為35°C和苯丙氨酸裂解酶為30-35°C。多酚氧化酶活力測定比較見以下圖1和圖2。從圖中可看出在環(huán)境溫度和標準溫度測定條件下，酶活力明顯不同，環(huán)境溫度測定的酶活力明顯低于標準測定溫度。其余酶α-淀粉酶、蛋白酶37°C、脂氧合酶35°C和苯丙氨酸裂解酶的情況和多酚氧化酶相類似。這說明在實際環(huán)境陳化條件下，酶反應的溫度無法達到標準溫度，而標準溫度是酶活力達到最大值時的最適宜溫度，因此，如果按照標準溫度測定，就無法真實了解實際煙葉陳化過程中的酶活力變化。權(quán)利要求一種根據(jù)煙葉加工實際溫度來測定煙葉酶活力的方法，在現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上改進而成，其特征在于a.在煙葉加工過程中實際酶活力的測定溫度為煙葉實際加工溫度；b.根據(jù)不同陳化地點的環(huán)境平均溫度來測定陳化煙葉的五種酶的實際酶活力。全文摘要本發(fā)明涉及一種根據(jù)煙葉加工實際溫度來測定煙葉酶活力的方法，屬于煙草應用
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明在現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上改進而成，其改進點在于a.在煙葉加工過程中實際酶活力的測定溫度為煙葉實際加工溫度；b.根據(jù)不同陳化地點的環(huán)境平均溫度來測定陳化煙葉的五種酶的實際酶活力。本發(fā)明的優(yōu)點在于更能客觀反映煙葉加工過程中煙葉酶活力的影響，為探索通過酶作用提高煙葉品質(zhì)提供更為客觀的研究方法。文檔編號C12Q1/40GK101831487SQ20101015528公開日2010年9月15日申請日期2010年4月26日優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日發(fā)明者任一鵬,唐興宏,夭建華,王毅,簡彬,馬永凱申請人:紅塔煙草(集團)有限責任公司