專利名稱：體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，尤其是一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)疾病常伴有不同程度的神經(jīng)功能損傷，是威脅人類生命和嚴(yán)重影響人們 生活質(zhì)量的主要疾病之一。神經(jīng)干細(xì)胞是具有自我更新能力，并能轉(zhuǎn)化為各種神經(jīng)組織細(xì) 胞(包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等)的一類細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在遭受神經(jīng)損 傷或特定細(xì)胞因子存在的條件下，神經(jīng)干細(xì)胞能夠激活并分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， 參與損傷部位的修復(fù)。因此，我們可以通過神經(jīng)干細(xì)胞移植來促進(jìn)損傷的神經(jīng)再生。目 前，神經(jīng)干細(xì)胞主要從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得或直接從成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要 指分布于室管膜下、紋狀體、海馬齒狀回、側(cè)腦室下帶等部位)中分離培養(yǎng)獲得。但是倫理 學(xué)、安全性問題以及細(xì)胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上都限制了神經(jīng)干細(xì)胞的移植應(yīng) 用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經(jīng)干細(xì)胞的途徑來克服這些限制。間充質(zhì)干細(xì)胞 是一群存在于多種組織中的多能干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，在體 外不同的誘導(dǎo)條件下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì) 胞等多種細(xì)胞。目前，國內(nèi)大都采用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮細(xì)胞生長因子(印idermal growth factor, EGF)直接誘導(dǎo)臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。將細(xì)胞接種于低粘附培養(yǎng)瓶中，在含有2%B27，20ng/mL EGF 和20ng/mL bFGF的neurobasal medium中培養(yǎng)10 20天后傳代。誘導(dǎo)后的細(xì)胞大約有 80%左右表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志巢蛋白(Nestin)并具有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化 的能力，其中約5%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志MAP2 ；而約40%的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞特異性表面標(biāo)志GFAP。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于體外 擴(kuò)增、免疫源性低且合乎倫理學(xué)要求的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞 分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，在添加了 bFGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制 因子LIF的DMEM/DF-12培養(yǎng)體系中預(yù)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞；在添加了 bFGF、FGF8和SHH的無 血清neurobasal medium培養(yǎng)體系中將預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類臍帶。所述DMEM/DF-12 培養(yǎng)體系添加的 bFGF 為 20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。
所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。所述的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)預(yù)誘導(dǎo)(1)取4 6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80% -90%融合時(shí)，吸除培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取5 IOmL 0. OlM磷酸緩沖液PBS輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗 液；(2)加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液l.OmL，浸漫覆蓋瓶 底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL 0. OlM PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去 上清液后，加入IOmL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種2 X IO5個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞；(4)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為10%人AB血清，100u/mL青霉素，100μ g/mL鏈霉 素的 DMEM/DF12 完全培養(yǎng)液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH禾口 IOng/ mL LIF，總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 8天，每3天換液一次；2)定向誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化(1)將預(yù)誘導(dǎo)后的細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液 1. OmL,浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1. OmL胎牛血清中止 胰蛋白酶消化；(2)加入IOmL 0. OlM PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去 上清液后，加入IOmL neurobasal medium重懸細(xì)胞，重新接種在T25培養(yǎng)瓶中；(3)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為2%的N2或B27、100u/mL青霉素、100μ g/mL鏈霉 素的無血清 neurobasal medium，添力口了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 禾口 500ng/mL SHH, 總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天添加生長因子一次， 每7天換液一次，培養(yǎng)20天后獲得由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果是誘導(dǎo)分化率高且易于向神經(jīng)元分化，能夠減少膠質(zhì)疤痕的 形成，更利于移植應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本誘導(dǎo)方法可獲得大約90%的Nestin陽性細(xì)胞， 且誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞同樣具有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力，分化后的MAP2和 GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)率分別約為70%和15%。誘導(dǎo)使用的間充質(zhì)干細(xì)胞可以來源于胚胎、 骨髓、脂肪等組織，但最好是取自臍帶來源。與胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)組織來源相比，臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫源性低且合乎倫理學(xué)要求。由于生理學(xué)特點(diǎn)基本一 致，所以無論是何種來源的人類間充質(zhì)干細(xì)胞，都適用本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)方法。
圖1是本發(fā)明的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)干細(xì)胞。圖2是本發(fā)明誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞的Nestin表達(dá)情況(A) Nestin染色；⑶細(xì)胞核 DAPI染色；(C)A和B的合并圖像。
圖3是本發(fā)明誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能情況(A)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志GFAP染色和細(xì)胞核DAPI染色；(B)神經(jīng)元特異性標(biāo)志MAP2染色和細(xì)胞核DAPI染色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施 例。本發(fā)明體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，在添加了 breF、成纖維 細(xì)胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養(yǎng)體系中預(yù)誘導(dǎo)間充質(zhì) 干細(xì)胞；在添加了 bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系中將預(yù)誘導(dǎo)的 細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類臍帶。所述DMEM/DF-12 培養(yǎng)體系添加的 bFGF 為 20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。所述的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。下面通過具體實(shí)施例，以間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類臍帶為例進(jìn)行敘述1.預(yù)誘導(dǎo)(1)取4 6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80% -90%融合時(shí)，吸除培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，取IOmL 0. OlM磷酸緩沖液(phosphate bufferedsaline，PBS)輕輕加 入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；(2)加入(質(zhì)量/體積比)0· 25 %胰蛋白酶-0. 01 %乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1. OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察 見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入l.OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入IOmL 0. OlM PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去 上清液后，加入IOmL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種2 X IO5個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞；(4)培養(yǎng)體系為含10 %人AB血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/ DF12 完全培養(yǎng)液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH 和 lOng/mL LIF，總 體積為5mL/瓶。置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 8天。每3天換液一次。2.定向誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化(1)將預(yù)誘導(dǎo)后的細(xì)胞加入0. 25 %胰蛋白酶-0. 01 %乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1. OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察 見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(2)加入IOmL 0. OlM PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去 上清液后，加入IOmL neurobasal medium重懸細(xì)胞，重新接種在T25培養(yǎng)瓶中；
(3)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為2%的N2或B27，100u/mL青霉素，ΙΟΟμ g/mL鏈霉 素的無血清 neurobasal medium，添力口了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 禾口 500ng/mL SHH, 總體積為5mL/瓶。置37°C，5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天左右。每3天添加生 長因子一次，每7天換液一次。3.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定倒置顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中形態(tài)的變 化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞呈神經(jīng)球樣生長(見圖1)。定向誘導(dǎo)3 4天后，可觀察到懸浮的小細(xì) 胞團(tuán)。誘導(dǎo)約20天時(shí)，大約可形成300 400個(gè)大小不等的細(xì)胞團(tuán)。(2)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志檢測(cè)將載玻片固定于甩片機(jī)的轉(zhuǎn)頭上，滴加誘導(dǎo)后 的神經(jīng)干細(xì)胞懸液IOOul后，1200g迅速離心5分鐘。常規(guī)免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞 特異性標(biāo)志巢蛋白(Nestin)。細(xì)胞破膜、封閉后，滴加一抗Nestin單克隆抗體，4°C孵育過 夜。然后滴加異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠 IgG抗，37°C孵育lh。細(xì)胞核用4 ‘6-二脒基-2-苯基吲哚(dihydrochloride，DAPI)染 色。最后封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。免疫熒光染色結(jié)果顯示陽性表達(dá)率為90%左右 (見圖2)。(3)神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能的檢測(cè)將無菌蓋玻片放置在24孔板孔內(nèi)，加入誘導(dǎo) 后的神經(jīng)干細(xì)胞懸液IOOul，含10 %人AB血清，100u/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的 neurobasal media中培養(yǎng)7天。取出蓋玻片進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)MAP2和GFAP的表達(dá) 情況。細(xì)胞破膜、封閉后，分別滴加一抗MAP2和GFAP單克隆抗體，4°C孵育過夜。然后滴加 FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG 二抗，37°C孵育lh。細(xì)胞核用DAPI染色。最后封片，熒光顯微 鏡下觀察，拍照。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞能分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(見圖3)。 其中，約70%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志MAP2，約15%細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志 GFAP0綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在于，在添加了bFGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養(yǎng)體系中預(yù)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系中將預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源自人類臍帶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法， 其特征在于,所述DMEM/DF-12培養(yǎng)體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在 于，包括以下步驟1)預(yù)誘導(dǎo)(1)取4 6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶 內(nèi)原有培養(yǎng)液，取5 10mL 0. 01M磷酸緩沖液PBS輕輕加入T75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；(2)加入0.25%胰蛋白酶-0. 01%乙二胺四乙酸EDTA消化液1. OmL,浸漫覆蓋瓶底，倒 置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL0. 01M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去上清 液后，加入10mL DMEM/F-12重懸細(xì)胞，在T25培養(yǎng)瓶中接種2X 105個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(4)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為10%人AB血清，100u/mL青霉素，100y g/mL鏈霉素的 DMEM/DF12 完全培養(yǎng)液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH 和 lOng/mL LIF,總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 8天，每3天換液一次；2)定向誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化(1)將預(yù)誘導(dǎo)后的細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液 l.OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形漂起時(shí)，加入1. OmL胎牛血清中止 胰蛋白酶消化；(2)加入10mL0. 01M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄去上清 液后，加入10mL neurobasal medium重懸細(xì)胞，重新接種在T25培養(yǎng)瓶中；(3)培養(yǎng)體系為含體積比濃度為2%的N2或B27、100u/mL青霉素、100iig/mL鏈霉素的無血清 neurobasal medium，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 和 500ng/mL SHH，總體 積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天添加生長因子一次，每7 天換液一次，培養(yǎng)20天后獲得由人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，在添加了bFGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養(yǎng)體系中預(yù)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養(yǎng)體系中將預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明誘導(dǎo)分化率高且易于向神經(jīng)元分化，能夠減少膠質(zhì)疤痕的形成，更利于移植應(yīng)用。與胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)組織來源相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、易于體外擴(kuò)增、免疫源性低且合乎倫理學(xué)要求。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK101831401SQ201010153969
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者謝姜, 韓忠朝 申請(qǐng)人:天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司