專利名稱：轉基因玉米檢測芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術領域，具體是一種轉基因玉米檢測芯片。
背景技術：
現有技術中，有關轉基因產品的檢測芯片報道有中國實用新型專利 ZL01214517. 3公開了一種用于轉基因產品鑒定的基因檢測芯片，即在平面型支撐載體的平 面上被覆有帶正電荷材料的膜層，在該膜層的表面以微點陣方式排布有供轉基因產品判斷 用的異源基因探針。但在其說明書中未提供任何有關檢測探針序列及待檢靶基因擴增引物 的信息，僅有芯片說明無配套試劑盒故根本無法應用于實際工作中。中國發(fā)明專利03150523. 6公開了一種用于轉基因產品檢測的寡核苷酸芯片的制 造方法及其應用，是根據已知轉基因產品基因組中所含的異源插入基因、物種內標基因、特 異性邊界序列等設計特異性的寡核苷酸探針及相應引物，然后將探針固定在載玻片上構成 轉基因產品檢測芯片。該專利利用15-35聚探針，TM值在60度左右。這種長度的探針因 為較短，特異性太強，對某個位點發(fā)生突變無法檢測。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服現有用于轉基因產品鑒定的基因檢測芯片所 存在的過的短探針特異性太強，對某個位點發(fā)生突變無法檢測的弊端及過長的探針長度特 異性不強，容易造成假陽性的技術缺陷，為人們提供一種兼容性和特異性都較好的轉基因
玉米檢測芯片。
本發(fā)明的目的是通過下述技術方案來實現的。
本發(fā)明的轉基因玉米檢測芯片，其特征在于，針對CaMV-P、Nos-T等13個待檢靶基因檢測玉米產品 R5I是否擁有相關基因，設計55-59聚探針，探針的Tm值即解鏈溫度基本相IhJ
異源長Tm
探針
插入基因度值
CaMV-PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA5974.5
Nos-TTTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG5570.7
BarTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG5982.1
NeoATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC5978.7
HptAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT5978.7
PatAATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA5974.5
EPSPSAATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG5981.4
CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG5982.1
CryIACAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT5974.5
Cry9CAGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG5981.4
GoxTTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC5977.3
玉米長Tm
探針
內源基因度值
IVRTAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG5979.4
18STGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT5578.2
4
上述方案中，根據所述待檢靶基因設計有相應的帶有熒光標記的 PCR擴增引物，分別為 靶基因名稱引物序列(5’ -3’ )
Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
CaMV-P Nos-T
Bar
Neo
Hpt Pat EPSPS CryIAb CryIAc Cry9C Gox IVR
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT
GATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG
AGGCCAATAACAGCAACCAC Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG
CCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT
AACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT
TTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT
GTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA
GCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
Tm值 66
60
64
60 62
62 60 60 62
60
64
60 60
62 62
62 60
58 62
60
58
62 64
60
64
18SCCCAAAGTTCAACTACGAGC60通過點樣儀將上述探針轉移到經化學基團修飾的玻片上，經SDS(十二烷基硫酸 鈉)、純水處理制成。玻片修飾基團可選自醛基、異硫氰基或巰基之一。抽提待檢玉米基因 組DNA，用有熒光標記的引物對待檢靶基因進行PCR(聚合酶鏈式反應)擴增，所得產物與寡 核苷酸探針陣列雜交，通過掃描儀獲得待檢玉米產品的相關信息。本說明書和權力要求書中使用的下列異源插入基因名稱縮寫除非特別說明具有 如下含義CaMV-P 花椰菜花葉病毒基因組的35S啟動子；Nos-T =Ti胭脂堿合成酶基因終止子；Bar 來源于鏈霉菌Sti^ptomyces viridochromogenes，其編碼產物為草丁磷乙酰 轉移酶；Neo 大腸桿菌E. coli新霉素-磷酸轉移酶基因；Hpt 潮霉素磷酸轉移酶；Pat 來源于鏈霉菌Sti^ptomyces viridochromogenes，其編碼產物為草丁磷乙酰 轉移酶；EPSPS 5-莽草酸_3_磷酸合成酶基因；CryIAb胃 Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki crylA(b)基因；CryIAc胃 Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki crylA(c)基因；Cry9C^ Bacillus thuringiensissubsp. KurstakiS cryI9C 基因；Gox 細菌Ochrobactrum anthropi草甘膦氧化還原酶基因；IVR 玉米的轉化酶1基因；18S 真核生物18S核糖體RNA基因。本發(fā)明之轉基因產品所檢測目的基因PCR擴增片段及探針標記序列如下CaMV-PGaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagagtcttttacgactcaatgac aagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcaga agaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatct gtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccat該核酸序列部分為CaMV 35S啟動子基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。Nos-TAagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgt aataattaacatRtaatRcatRacRttatttatRaRatRRRtttttatRattaRaRtcccRcaattatacatttaat acgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaa該核酸序列部分為Nos終止子基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。
BarGcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcggg agcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcacgc aacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgct ctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacc cgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaac tggcatgacgtgggtttctggcagctggacttc該核酸序列部分為Bar基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。NeoTgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctac ctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcagg atgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggc gaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcat cgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatatt該核酸序列部分為Neo基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。HptTcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaa ccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagc gggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatcc ccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgc tttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaat ggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatc該核酸序列部分為Hpt基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。PatCggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgtta accattacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagag aggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctg RaaRRctaRRaacRcttacRattRRacaRttRaRaRtactRtttacRtRtcacataRRcatcaaaRRttRRRcctaR RatccacattRtacacacatttRCttaaRtctatRRaRRcRcaaRRttttaaRtctRtRRttRCtRttataRRCCt該核酸序列部分為Pat基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。EPSPSAtatccgattctcgctgtcgccgccgccttcgcggaaggggcgaccgtgatgaacggtctggaagaact ccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggccgtcgccaatggcctcaagctcaatggcgtggattgcgatgagggcg agacgtcgctcgtcgtgcgcggccgccctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacccat ctgcatcaccgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccctgtcacggtggacgatgccac gatgatcgccacgatcttcccggagttcatggacctgatggccgggctgggcgcgaagatcgaactctccgatacga agg該核酸序列部分為EPSPS基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。CryIAb
Cctggacattgtgtccctcttcccgaactacgactcccgcacctacccgatccgcaccgtgtcccaact gacccgcgaaatctacaccaaccccgtcctggagaacttcgacggtagcttcaggggcagcgcccagggcatcgagg gctccatcaggagcccacacctgatggacatcctcaacagcatcactatctacaccgatgcccaccgcggcgagtac tactggtccggccaccagatcatggcctccccggtcggcttcagcggccccgagtttacctttcctctctacggcac gatgggcaacgccgctccacaacaacgcatcgtcgctcagctgggccagggcgtctaccgcaccctgagctccaccc tgtaccgcaggcccttcaacatcggtatcaacaaccagcagctgtccgtcctggatggcactgagtt該核酸序列部分為CryIAb基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。CryIAcCctgcagtgaagggaaactttctttttaatggttctgtaatttcaggaccaggatttactggtggggac ttagttagattaaatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttcccatcgac atctaccagatatcgagttcgtgtacggtatgcttctgtaaccccgattcacctcaacgttaattggggtaattcat ccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtcattagataatctacaatcaagtgattttggttattttgaa agtgccaatgcttttacatcttcattaggtaatatagtaggtgttagaaattttagtgggactgcggagtgataata gacagatttgaatttattccagttactgcaacactcgaggctgaatataatctggaaagagcgcagaa該核酸序列部分為CryIAc基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。Cry9CGaccgccaagtacaccaactactgcgagacctggtacaacaccggtctggaccgcctgaggggcaccaa caccgagagctggctgcgctaccaccagttccgcagggagatgaccctggtggtgctggacgtggtggccctgttcc cctactacRacRtRCRCCtRtaccccaccRRcaRcaacccccaRctRacacRtRaRRtRtacaccRaccccatCRtR ttcaacccaccaRccaacRtRRRCCtRtRccRcaRRtRRRRcaccaacccctacaacaccttCaRCRaRCtRRaRaa cgccttcatcaggccaccccacctgttcgaccgcctgaacagcctgaccatcagcagcaatcgattccccgtgagca gcaacttcatggac該核酸序列部分為Cry9C基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。GoxTaacttgtctcacgcctttaccaagggaatccttatcgaagagaacggtcacaccatcaacccacaagg tctCRtRactctcttRtttCRtCRtttcatCRCtaaCRRtRRaRaRttcRtRtctRCtCRtRttatCRRattCRaRa ctgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggtgttcttgctgttgatgcagctgttgttgcagctggt gcacactccaagtctcttgctaactcccttggtgatgacatcccattggataccgaacgtggataccacatcgtgat cgccaacccagaagctgctccacgtattccaactaccgatgcttctggaaagttcatcgctactcctatggagatgg gtcttcgtgttgctggaaccgttgagttcgctggtctcactgctgctcctaactggaagcgtgc該核酸序列部分為Gox基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。IVRCacacctgtacacgtccctgtacgcgccgtcgtggtctcccgtgatcctgccccgtcccctccacgcg RccacRCCtRCtRCaRCRCtctRtacaaRcRtRcaccacRtRaRaatttccRtctactcRaRcctaRtaRttaRac gggaaaacgagaggaagcgcacggtccaagcacaacactttgcgcgggcccgtgacttgtctccggttggctgag ggcgcgcgacagagatgtatggcgccgcggcgtgtcttgtgtcttgtcttgcctatacaccgtagtcagagactg tgtcaaagccgtccaacgacaatgagcta該核酸序列部分為IVR基因PCR擴增片段，下劃線部分為探針雜交區(qū)域。18S
8
Gagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggta ^tgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgagga acaattagagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctctaatagcgtatattaaatttgttgcagtt aaaaagctcgtagttgaaacttggg本發(fā)明整體構思是1.通過政府及國際組織網站NCBI、GENEBANK等核酸數據庫、專 利數據庫收集多種已商品化的轉基因產品的基因構建圖及相應的異源插入基因，并通過克 隆和測序給予補充和驗證。這些異源插入基因可分為兩類外源基因序列、邊界序列A.啟 動子、終止子和標記基因；B.性狀基因(目標基因，既能改變植物形狀的異源核苷酸片段)， 根據這些異源插入基因設計相應的探針和引物。2.選取一段與ISSrRNA產物相配對的寡核 苷酸片段，作為陽性參照，用于監(jiān)控雜交反應中假陰性的出現。3.選取一段與內標基因IVR 產物相配對的寡核苷酸片段，作為玉米的物種特異性對照。4.將各類探針分別固定在一張 玻片的不同區(qū)域內便可達到并行對轉基因玉米內多種異源插入基因片段進行篩查。本發(fā)明是發(fā)明人通過長期實踐探索開發(fā)出來的科學實用的就是方案，提供了一種 可以測定上述目的基因的用于轉基因玉米及其加工產品檢測的基于寡核苷酸芯片技術的 高靈敏度、高通量的轉基因玉米檢測芯片，其探針經過特別設計，長度適中，并且克服了現 有技術中短探針特異性太強，對某個位點發(fā)生突變無法檢測的弊端及過長的探針長度特異 性不強，容易造成假陽性的缺陷，為人們提供一種兼容性和特異性都較好的轉基因玉米檢 測芯片。下面通過實施例進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明不僅限于所述實施例。
圖1為與表4對應的芯片點陣排布設計示意2為CaMV-P理論雜交圖，圖3為CaMV-P實際雜交圖。圖4為cryIAb理論雜交圖，圖5為cryIAb實際雜交圖。圖6為EPSPS理論雜交圖，圖7為EPSPS實際雜交圖。圖8為neo理論雜交圖，圖9為neo實際雜交圖。圖10為nos-T理論雜交圖，圖11為nos-T實際雜交圖。圖12為pat理論雜交圖，圖13為pat實際雜交圖。圖14為bar理論雜交圖，圖15為bar實際雜交圖。圖16為18S理論雜交圖，圖17為18S實際雜交圖。
具體實施例方式實施例1首先，要在醛基化芯片表面固定的DNA分子必須具有一個伯胺基。5’-氨基，又稱 為連接氨基，具有通過6-12個碳原子間隔臂連接在5’核苷酸的磷酸基團上的一個伯胺基。 而為了使探陣分子在芯片上伸展開來，利于靶標探針的雜交，故合成時在每個探針的5’加 上了一個氨基和15個T。探針(如表1所示)和引物(如表3所示)是人工合成的一串寡核苷酸鏈，均由 核酸合成儀進行合成。
將合成好的探針用超純水溶解，使其終濃度為40 μ Μ。然后將溶解的探針和點樣緩 沖液(晶芯基因芯片點樣液)充分混勻分裝到384孔板中，另外還將Hex及陽性(PC)和陰 性(NC)內參裝入384孔板的對應位置。之后將384孔板和醛基芯片放入芯片點樣儀中進 行點樣，點制好的芯片陣列如表4所示基因芯片點陣排布情況。芯片點制好后進行芯片的固定過程，探針牢固的結合到芯片上。固定的基本流程 為濕盒過夜——清洗液清洗——miIliQ水清洗——封閉液封閉——miIliQ水清
、他_畝J、、田不
優(yōu) 聞;L·、尼丁。濕盒過夜將大芯片盒的下半部分清理干凈，放入一塊無塵布，再在無塵布內加入 15ml的milliQ水，將芯片盒放入大自封袋內，折疊好后放入37度烘箱內烘至少16小時。清洗液洗滌往大燒杯內加入588ml的milliQ水，同時加入10%的SDS 12ml，將 濕盒中取出的芯片放在芯片架上放入清洗液中，75rpm緩慢搖動5min。milliQ水清洗在另外一個大燒杯內加入750-800ml的milliQ水，將清洗液中的 芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，換干凈的milliQ水重復一次。封閉液封閉(封閉液提前配制)向燒杯中加入405ml的milliQ水，IOX的PBS 45ml，硼氫化鈉1. 5克，待完全溶解后加入150ml的無水乙醇，玻璃棒迅速攪拌。將還在上 一步milliQ水的芯片架取出，放入封閉液中75rpm緩慢搖動5min。milliQ水清洗在另外一個大燒杯內加入750_800ml的milliQ水，將清洗液中的 芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，換干凈的milliQ水重復一次。離心甩干，避光靜置備用。
表1針對CaMV-P、Nos-T等13個待檢靶基因檢測玉米產品是否擁有相關基因,計 55-59聚探針，探針的Tm值即解鏈溫度基本相同
表1
異源長Tm
探針
插入基因度值
CaMV-PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA5974.5
Nos-TTTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG5570.7
BarTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG5982.1
NeoATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC5978.7
HptAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT5978.7
PatAATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA5974.5
EPSPSAATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG5981.4
CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG5982.1
CryIAcAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT5974.5
Cry9CAGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG5981.4
GoxTTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC5977.3
玉米長Tm
探針
內源基因度值
IVRTAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG5979.4
18S TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT55 78.2本發(fā)明的應用方法如下1.試劑準備芯片洗液根據需要及實際情況，按如下比例配制洗滌液I和II。1)洗液I :SSC終濃度為2X，SDS終濃度為0. 2%。以配制總量500ml為例，量取 440ml蒸餾水倒入IOOOml試劑瓶中，加入50ml20X SSC，混勻。再加入IOml 10% SDS，混勻，
室溫存貯。或根據需求按比例配制。2)洗液II :SSC終濃度為0. 2X。以配制總量500ml為例，量取495ml蒸餾水倒入 IOOOml試劑瓶中，加入5ml20XSSC，混勻，室溫存貯?；蚋鶕枨蟀幢壤渲?。2. PCR擴增玉米基因組DNA2.1配制PCR反應體系在PCR配液區(qū)內，在冰上融化PCR Mix及基因組DNA，按表2體系配制反應液。本 發(fā)明之PCR擴增試劑(MIX)為混合試劑，有以下主要成分①Taq酶(DNA聚合酶，0. 5 μ 1)， ② PCR 緩沖液(10XPCR Buffer，5 μ 1)，③脫氧核苷酸混合液(dNTP ΜΙΧ(10μΜ each, 1 μ 1)，④擴增引物混合液CaMV-P (R and F 10 μ Μ, Each 0. 5 μ 1) ,Cry9C(R and F :10μΜ, Each 0· 5 μ 1)，neo (R and F :10μΜ，Each 0. 5 μ 1), pat (R and F :10μΜ，Each 0. 5 μ 1), nos-T (R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1), gox(R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1), IVR (R and F 10 μ Μ, Each 0. 5 μ 1),, CryIAb (R and F : 10 μ Μ，Each 0. 5 μ 1), CryIAc (R and F : 10 μ Μ， EachO. 5μ 1), 18S(R and F :10μ Μ, Each 0. 5 μ 1), hpt(R and F :10μ Μ, EachO. 5 μ 1), bar (R and F :10μΜ, Each 0· 5 μ 1)，EPSPS (R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1)⑤去核酸水 (ddH20,28.5 μ 1)。表2 轉基因檢測PCR反應體系 2. 2 PCR 擴增將配制好的反應液置于PCR擴增儀中，按照如下PCR反應循環(huán)程序進行PCR反應。94"C 5min
940C 30secn
56°C 30sec [ 40 cycles 72 °C 30sec^72 °C 5min4 "C ①
本例所采用的帶有熒光標記的PCR擴增引物，如表3所示。3.雜交及結果判讀3. 1雜交及洗片將雜交液在42°C溶化，按下面體系配制雜交液，雜交BufTer95°C變性3分鐘，冰浴 3分鐘，備用。
標記產物7μ1 I
\ Total 15μ1 95°C 3min，冰浴 5min ,吸取 14μ1 與芯片雜交 雜交液 8μ1 J打開芯片雜交盒，將雜交盒平放在桌面上，在雜交盒底部凹槽內加入約80μ 1滅 菌水。將芯片正面朝上(圍欄面朝上，標簽朝向操作者)放入雜交盒內兩個定位銷之間；放 上芯片蓋片，注意有凸臺的一面朝向芯片，上端先接觸芯片，再緩緩蓋下；然后用移液器通 過蓋片加樣孔緩慢注入15 μ 1變性后的雜交液，雜交液會憑借液體表面張力在蓋片下面的 凸臺和芯片表面之間形成一道液膜。注意不要震動蓋片或芯片以避免破壞液膜。蓋緊雜交 盒蓋。放入42°C恒溫水浴中，靜置，雜交2小時或過夜均可。雜交后，取出芯片放在42°C預熱好的洗液I中，42°C震蕩清洗4分鐘，再用42°C預 熱好的洗液II，42°C震蕩清洗4分鐘(冬季洗液II可清洗兩次，每次2分鐘)，最后用42°C 預熱好清水清洗一次，清洗后的芯片1500rpm離心1分鐘以去除芯片表面的液體，此芯片可 避光保存，在4小時內掃描都有效。3.2芯片掃描及結果判讀洗凈的芯片使用微陣列芯片掃描儀進行掃描，通過配套軟件自動對掃描結果進行 判讀分析，給出檢測結果，可對結果進行存儲、打印和查詢。本例上述時間、溫度、配方等工 藝條件可在適當范圍內調整，不僅限于所述實施例。表4為基因芯片點陣排布情況，圖2-圖17為用圖1所示的基因芯片對各種轉基 因玉米進行實際的檢測結果，理論雜交圖與實際雜交圖的對比情況。表5為表4和圖1中 各探針的名稱與含義解釋。本發(fā)明所述轉基因玉米檢測芯片，可與各種結構的芯片圍欄、半封閉式圍欄，折疊 式雜交盒、轉基因生物芯片檢測試劑盒等配套使用。表3帶有熒光標記的PCR擴增引物
靶基因名稱
CaMV-P
Nos-T
Bar
引物序列(5’ -3’ ) Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
Tm值 66
60
64
60 62
62
12Neo
Hpt
Pat
EPSPS
CryIAb
CryIAC
Cry9C
Gox
IVR
18S
Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT
AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT
GATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG
AGGCCAATAACAGCAACCAC Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG
CCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT
AACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT
TTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT
GTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA
GCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC 表4基因芯片點陣排布情況
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60 表5為表4和圖1中各探針的名稱與含義
權利要求
一種轉基因玉米檢測芯片，其特征在于，針對CaMV P、Nos T等13個待檢靶基因檢測玉米產品是否擁有相關基因，設計55 59聚探針，探針的Tm值即解鏈溫度基本相同異源 長 Tm 探針插入基因 度 值CaMV PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA 59 74.5Nos T TTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG 55 70.7Bar TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG 59 82.1Neo ATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC 59 78.7Hpt AAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT 59 78.7Pat AATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA 59 74.5EPSPS AATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG 59 81.4CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG 59 82.1CryIAcAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT 59 74.5Cry9C AGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG 59 81.4Gox TTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC 59 77.3玉米 長 Tm 探針內源基因 度 值IVR TAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG 59 79.418S TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 55 78.2
2.根據權利要求1所述的轉基因玉米檢測芯片，其特征在于根據所述待檢靶基因設計 有相應的帶有熒光標記的PCR擴增引物，分別為靶基因名稱 CaMV-PNos-TBarNeoHpt Pat引物序列(5’ -3’ ) Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTGTAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCACCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTACGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTATGATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAGAGGCCAATAACAGCAACCACEPSPSCryIAbCryIAcCry9CGoxIVR18SCy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCGCCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCTAACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTTTTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACTGTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTAGCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTGTAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCACCCAAAGTTCAACTACGAGC
全文摘要
本發(fā)明屬于生物芯片技術領域，具體涉及一種轉基因玉米檢測芯片，其特點是針對CaMV-P、Nos-T等13個待檢靶基因檢測玉米產品是否擁有相關基因，設計有55-59聚探針，探針的Tm值即解鏈溫度基本相同即在70.7-82.1的范圍內，并根據所述待檢靶基因設計有相應的帶有熒光標記的PCR擴增引物CaMV-P、Cry9C、neo、pat、nos-T、gox、IVR、CryIAb、CryIAc、18S、hpt、bar、EPSPS，其Tm值在58-66的范圍內，該芯片可與各種結構的芯片圍欄、半封閉式圍欄，折疊式雜交盒、轉基因生物芯片檢測試劑盒等配套使用，是基于寡核苷酸芯片技術的高靈敏度、高通量的轉基因玉米檢測芯片，其探針經過特別設計，長度適中，兼容性和特異性優(yōu)異。
文檔編號C12Q1/68GK101921833SQ20101014829
公開日2010年12月22日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權日2010年4月15日
發(fā)明者劉勇濤, 屈剛, 潘立, 郭琪琪, 鐘尚勇, 黃廣平 申請人:四川國興盛生物科技有限公司