專利名稱：：鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花llcotton25轉(zhuǎn)化體的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域，特別是涉及鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體的PCR方法
背景技術(shù)：
：我國是轉(zhuǎn)基因作物的主要種植國家之一，2009年種植面積位于全球第六位。我國商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花何抗木瓜環(huán)斑病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜等。其中，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉是我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，2009年種植面積達(dá)370萬公頃，占我國棉花種植總面積的近70%(James，Clive.2009.GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops:2009.ISAAABrie預(yù)o.41.ISAAA:Ithaca，NY.)。我國種植的轉(zhuǎn)基因棉花主要為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花。此外我國還允許國外抗除草劑棉花LLC0TT0N25、抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花531等5個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)口用作加工原料(http:〃www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。抗除草劑棉花LLC0TT0N25是由拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)的通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)bar基因的抗除草劑棉花品種，2003年在美國被批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用，隨后陸續(xù)在澳大利亞、巴西、力口拿大等國被批準(zhǔn)應(yīng)用(http:〃www.agbios.com/dbase.phpaction=Submit&evidcode=LLCotton25)。我國于2006年批準(zhǔn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25進(jìn)口用于加工原料(農(nóng)基安證字(2006)第360號(hào))。因此建立抗除草劑棉花LLC0TT0N25的快速、特異性的檢測方法對其監(jiān)管和安全性評(píng)價(jià)顯得十分必要。目前，PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。在應(yīng)用這種技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物定性檢測時(shí)，根據(jù)其擴(kuò)增的靶標(biāo)區(qū)域和特異性將其分為四類一、篩選檢測，以轉(zhuǎn)基因通用的外源啟動(dòng)子和終止子為靶標(biāo)區(qū)域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域；三、構(gòu)建特異性檢測，以轉(zhuǎn)基因元件之間的特異構(gòu)建為靶標(biāo)區(qū)域；四、轉(zhuǎn)化體特異性檢測，以轉(zhuǎn)化體特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區(qū)域)為靶標(biāo)區(qū)域。這四類檢測方法對轉(zhuǎn)基因作物的檢測特異性是逐漸增加的，轉(zhuǎn)化體特異性檢測是目前對轉(zhuǎn)基因品系檢測特異性最高的檢測方法，也是目前轉(zhuǎn)基因檢測中最常用的身份檢測方法，這種檢測方法能夠區(qū)分同一轉(zhuǎn)化載體產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)化植株品系。經(jīng)檢索公開文獻(xiàn)和專利發(fā)現(xiàn)，目前尚沒有抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性片段序列的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領(lǐng)域中的空白，本發(fā)明提供了抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列以及鑒別抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法，該P(yáng)CR方法能利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出抗除草劑棉花LLC0TT0N25，以及以抗除草劑棉花LLC0TT0N25為親本的棉花品系。鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據(jù)SeqIDNo.l所示核苷酸序列l(wèi)-1723bp位置設(shè)計(jì)，反向引物是根據(jù)SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置設(shè)計(jì)。所述正向引物為LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物為LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，擴(kuò)增的片段為長度為411bp。鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據(jù)SeqIDNo.2所示核苷酸序列l(wèi)-476bp位置設(shè)計(jì)，反向引物是根據(jù)SeqlDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置設(shè)計(jì)。所述正向引物為LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物為LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，擴(kuò)增片段長度為430bp。本發(fā)明通過Genomewalking方法獲得轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性序列，一條為外源重組載體5'端插入?yún)^(qū)域的特異性旁側(cè)序列，另一條外源重組載體的3'端插入?yún)^(qū)域的特異性旁側(cè)序列，根據(jù)這兩條旁側(cè)序列任意一條設(shè)計(jì)引物對，能夠?qū)ｉT用檢測LLC0TT0N25及以其為親本的棉花品種。本發(fā)明還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，可以用于LLC0TT0N25及以其為親本的棉花品種鑒別的最優(yōu)化方案。本發(fā)明提供的的轉(zhuǎn)化體特異性序列以及依賴其建立的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法可作為一種鑒定轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25，以及以這個(gè)品種為親本的轉(zhuǎn)基因棉品系的有效手段，由于轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25是我國允許進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因棉花品系之一，因此本發(fā)明為特異性鑒定轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25提供了便利，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價(jià)值。圖1轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體特異性序列的GenomeWalking擴(kuò)增M:DNAMarkerDL2000;1-4:5'端DL1-DL4的Walking產(chǎn)物；5-8:3'端DL1-DL4的Walking產(chǎn)物圖2轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測結(jié)果M:DNAMarkerDL2000;1:轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25，2-9:8個(gè)市場棉花樣品；10:空白對照圖3轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的3'端轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測結(jié)果M:DNAMarkerDL2000;1:轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25，2-9:8個(gè)市場棉花樣品；10:空白對照具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體特異性序列的克隆1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科學(xué)公司)，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等購自大連寶生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(A卯liedBiosystem377型全自動(dòng)熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2.1棉花基因組DNA提取與檢測2.1.1棉花基因組DNA提取取子葉期的幼嫩棉花葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進(jìn)行棉花材料總DNA的提取。2.1.2DNA檢測取5iU提取的DNA溶液，以O(shè).8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測定所提取的DNA的濃度和純度。2.2Genomewalking分離轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性序列Genomewalking也是一種擴(kuò)增已知序列旁側(cè)未知區(qū)域序列的方法，主要步驟為基因組DNA酶切、與接頭連接、兩次巢式PCR擴(kuò)增等。本實(shí)施例采用Genomewalking的方法獲得了轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性序列。具體步驟參照GenomeWalkerTMUniversalKit(Takara大連公司)試劑盒說明，本實(shí)施例進(jìn)行了部分改進(jìn)，主要操作步驟如下。2.2.1基因組DNA酶切分別用DraI、StuI、Pvu11、EcoRV酶切轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25基因組DNA，標(biāo)記為DL1DL4。酶切體系為:基因組DNA(O.1yg/yL)，25yL;10X酶切Buffer,lOyL;內(nèi)切酶(10U/iiL)，8iiL;ddH20，57iiL;總體積100yL。37"溫浴2h，取出離心管，低速離心510s，繼續(xù)溫浴1618h。各取5L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否完全。2.2.2純化酶切產(chǎn)物按回收試劑盒說明書純化酶切產(chǎn)物。2.2.3連接反應(yīng)5連接反應(yīng)體系純化的酶切產(chǎn)物，4iiL;接頭(25iiM)，1.9iiL;10X連接Buffer,1.6iiL;T4DNA連接酶(6U/iiL)，0.5iiL;ddH20，8iiL;總體積16iiL?；旌戏磻?yīng)液，16t:溫浴過夜，然后7(TC變性5min。每管加入72yLddH20，混勻，-2(TC保存?zhèn)溆谩?.2.4PCR反應(yīng)GenomeWalking共需要兩輪PCR反應(yīng)，其PCR的反應(yīng)體系見表1。表1反應(yīng)體系(iiL)第一輪第二輪ddH2017.37536.2510XBuffer(Mg2+Plus)2.55dNTP(2.5mMeach)24APl(10uM)12GSPPrimer1(10uM)12ExT叫(5U/uL)0.1250.25Template(20ng/uU10.5(第一輪反應(yīng)產(chǎn)物)Totalvolume25502.2.5和分析PCR在0.8%膠上進(jìn)行用Gel兩輪PCR擴(kuò)增的程序見表2。表2GenomeWalking擴(kuò)增程序反應(yīng)步驟設(shè)置循環(huán)數(shù)第一輪194。C,25s;72°C，3min7294。C,25s;67°C,3min32367。C,7min1第二輪194。C,25s;72°C，3min5294。C,25s;67°C，3min20367°C,7min1序列測定擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳，采QIAquickExtractionkit回收擴(kuò)增片段，連接到pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進(jìn)行序列測定。采用軟件vectorNTI10.0(Invitrogen)6對測定的序列進(jìn)行拼接和分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(http:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN檢索相似的基因組序列。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體特異性序列測定分別經(jīng)過1次GenomeWalking獲得轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列。5'端GenomeWalking以引物5W1-P1和5W1-P2(表3)分別進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得2006bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1，泳道4)。3'端GenomeWalking以引物3W1-P1和3W1_P2(表3)，分別進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得1010bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖l，泳道6)。表3Ge謹(jǐn)eWalking弓l物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.2轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體特異性序列分析將獲得的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的l-1723bp為棉花基因組序列，1724-2006bp為轉(zhuǎn)化載體序列，序列見SEQIDNOl。3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列的l-476bp為轉(zhuǎn)化載體序列，477-1010bp為棉花基因組序列，序列見SEQIDN02。實(shí)施例2本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N251實(shí)驗(yàn)材料1.l植物材料轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科學(xué)公司)，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。8個(gè)棉花材料，購自市場。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過程2.1棉花基因組DNA提取與檢測見實(shí)施例1中2.1棉花基因組DNA提取與檢測。2.2鑒別轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法依據(jù)5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，設(shè)計(jì)引物L(fēng)L25-5F/LL25-5R組合(序列見表4)，預(yù)期擴(kuò)增片段為411bp;依據(jù)3'端轉(zhuǎn)化體特異性序列，設(shè)計(jì)引物L(fēng)L25-3F/LL25-3R組合(序列見表4)，預(yù)期擴(kuò)增片段為430bp。檢測購自市場的8個(gè)棉花樣品，見圖2和圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25這兩對引物均能獲得預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，而檢測的8個(gè)市場樣品均未獲得預(yù)期大小的擴(kuò)增片段。分別克隆這兩個(gè)擴(kuò)增片段，按實(shí)施例1中"2.2.5序列測定和分析"進(jìn)行序列分析。序列分析結(jié)果表明，5'端擴(kuò)增片段序列與SEQIDN01的1596-2006位完全一致，3'端擴(kuò)增片段序列與SEQIDN02的120-549位完全一致。檢測結(jié)果表明本發(fā)明提供的PCR方法能很好地鑒別出棉花樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25。PCR反應(yīng)體系為0.25iiLrTaq(5U/iiL)，5iiL10XPCRBuffer(Mg2+Plus)，4iiLdNTP(各2.5mM)，引物各2yL(10yM)，模板各2yL(20ng/yL)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至50iiL。擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)變性4min;94。C變性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸30sec，35個(gè)循環(huán)；72。C10min。表4鑒別轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLC0TT0N25的轉(zhuǎn)化體特異性PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLCOTTON25轉(zhuǎn)化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據(jù)SeqIDNo.1所示核苷酸序列1-1723bp位置設(shè)計(jì)，反向引物是根據(jù)SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置設(shè)計(jì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR方法，所述正向引物為LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物為LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，擴(kuò)增的片段為長度為411bp。3.鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLC0TT0N25轉(zhuǎn)化體的PCR方法，其特征在于PCR體系中的正向引物是根據(jù)SeqIDNo.2所示核苷酸序列l(wèi)-476bp位置設(shè)計(jì)，反向引物是根據(jù)SeqIDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置設(shè)計(jì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR方法，所述正向引物為LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物為LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，擴(kuò)增片段長度為430bp。全文摘要本發(fā)明“鑒別轉(zhuǎn)抗除草劑棉花LLCOTTON25轉(zhuǎn)化體的PCR方法”，屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明通過Genomewalking方法獲得轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花LLCOTTON25的轉(zhuǎn)化體特異性序列，一條為外源重組載體5’端插入?yún)^(qū)域的特異性旁側(cè)序列，另一條外源重組載體的3’端插入?yún)^(qū)域的特異性旁側(cè)序列，根據(jù)這兩條旁側(cè)序列任意一條設(shè)計(jì)引物對，能夠?qū)ｉT用PCR檢測轉(zhuǎn)基因棉花品種LLCOTTON25及以其為親本的棉花品種。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792813SQ20101014391公開日2010年8月4日申請日期2010年4月7日優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日發(fā)明者孫爻,張永軍,彭于發(fā),謝家建申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所