專利名稱：鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的PCR方法。 自從1996年轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積迅猛增加。2009年全球種植轉(zhuǎn)基因作物種植的國(guó)家達(dá)到25個(gè)，種植面積總計(jì)達(dá)1. 34億公頃，是1996年種植面積的79倍。其中轉(zhuǎn)基因玉米全球種植面積達(dá)4100萬公頃，占玉米種植面禾只的26% (James， Clive. 2009. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2009.ISAAA BriefNo. 41. ISAAA :Ithaca， NY.)。 我國(guó)于2009年8月批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的生物安全證書(http:〃www. stee.agri. gov. cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689. pdf)，同時(shí)我國(guó)還批準(zhǔn)國(guó)外9個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品禾中進(jìn)口用作力口工原料(http://www. stee. agri. gov. cn/biosafety/spxx/t20091022_819214. htm)。獲得生物安全證書的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米是由我國(guó)自主研發(fā)的，將黑曲霉中的植酸酶基因通過基因槍的方法轉(zhuǎn)入到玉米中，經(jīng)過多代篩選培育而成的(Rumei
Chen， Guangxing Xue， et al. Transgenic maize plantsexpressing a fungal phytase
gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643.)。轉(zhuǎn)入植酸酶可以降解玉米中大量含有的植酸磷，釋放可被動(dòng)物利用的無機(jī)磷，減少飼料中磷酸氫鈣的添加量，降低飼養(yǎng)成本，減少動(dòng)物糞、尿中磷的排泄，減輕環(huán)境污染，具有很廣闊的應(yīng)用前景。 目前我國(guó)已經(jīng)研究和制定了多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)方法，并頒布為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(如農(nóng)業(yè)部869號(hào)公告-3-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抗蟲和耐除草劑玉米Btll及其衍生品種定性PCR方法)，但轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的特異性檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。盡管Chen
等(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al. Transgenic maize plants expressing a fungal
phytase gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643.)報(bào)道了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米采用的啟動(dòng)子、終止子和目的基因的名稱，但并沒有提供確切的可以直接查詢到的序列信息，也未提供啟動(dòng)子、目的基因基因和終止子之間的具體連接方式。對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)來說，這些詳細(xì)的信息對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的身份確認(rèn)是必不可少的。 PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。在應(yīng)用這種技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物定性檢測(cè)時(shí)，根據(jù)其擴(kuò)增的靶標(biāo)區(qū)域和特異性將其分為四類一、篩選檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因通用的外源啟動(dòng)子和終止子為靶標(biāo)區(qū)域；二、基因特異性檢測(cè)，以特異的外源目的基因?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域；三、構(gòu)建特異性檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因元件之間的特異構(gòu)建為靶標(biāo)區(qū)域；四、轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)，以轉(zhuǎn)化事件特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區(qū)域)為靶標(biāo)區(qū)域。這四類檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的品系檢測(cè)特異性是逐漸增加的。構(gòu)建特異性檢測(cè)的特異性比篩選檢測(cè)和基因特異性檢測(cè)高，可以區(qū)分相同基因與不同啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建方式，可以作為同一載體轉(zhuǎn)化的不同轉(zhuǎn)基因品系的通用檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白，通過從轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米中分離獲得的植酸酶基因表達(dá)
框序列，提出了鑒定植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的PCR方法，該P(yáng)CR方法能利用普通的PCR儀
器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)特定植酸酶基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)基因玉米品系。 鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的PCR方法，其步驟如下 (1)采用引物對(duì)A/B和C/D分別對(duì)待測(cè)品種的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2)凝膠電泳檢測(cè)兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，都出現(xiàn)目標(biāo)長(zhǎng)度的檢測(cè)帶的品種為
轉(zhuǎn)有Seq IDNo. 1所示核苷酸序列的構(gòu)建載體的轉(zhuǎn)基因品種， 引物對(duì)A/B的正向引物A根據(jù)Seq ID No. 1所示核苷酸序列l(wèi)_649bp位置設(shè)計(jì)，
反向引物B根據(jù)Seq ID No. 1所示核苷酸序列650-2134bp位置設(shè)計(jì)； 引物對(duì)C/D的正向引物C根據(jù)Seq ID No. 1所示核苷酸序列650_2134bp位置設(shè)
計(jì)，反向引物D根據(jù)Seq ID No. 1所示核苷酸序列2135_2814bp位置設(shè)計(jì)。所述正向引物A為Phy-1F : 5 ' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'，所述反向引物為BPhy-lR :5 '-CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'，擴(kuò)增的片段為長(zhǎng)度為
257bp。所述正向引物C為Phy-2F : 5 ' -CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'，所述反向引物D為Phy-2R : 5 ' -GGCAAATCACTCGGTGTATC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為
296bp。 本發(fā)明提供的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因品種的方法，是在構(gòu)建特異性的水平上檢測(cè)待測(cè)品種是否是具有特定載體的轉(zhuǎn)基因品種。本發(fā)明根據(jù)Chen等(R咖ei Chen， Guangxing Xue，et al. TrMisgenicnmize plants expressing a fungal phytase gene. TransgenicRes. 2008， 17 :633-643)關(guān)于轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建信息得知植酸酶基因構(gòu)建在一個(gè)玉米種子特異性啟動(dòng)子(LEGlpromoter)和玉米種子特異性終止子(LEGlterminator)之間，但該文獻(xiàn)中沒有提供具體的序列信息。；在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)中檢索到植酸酶基因序列(登錄號(hào)AF537344);采用美國(guó)專利文獻(xiàn)(US patentNo. 7，211，712)中使用的啟動(dòng)子和終止子序列與AF537344的序列來設(shè)計(jì)引物獲得轉(zhuǎn)化載體的首尾序列，通過序列電子拼接獲得構(gòu)建載體的全長(zhǎng)序列，根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，一對(duì)引物擴(kuò)增構(gòu)建載體的啟動(dòng)子與植酸酶結(jié)合區(qū)域，另一對(duì)引物擴(kuò)增植酸酶與終止子的結(jié)合區(qū)域，同時(shí)檢測(cè)出目標(biāo)條帶的品種為具有Seq IDNo. l所示核苷酸序列的構(gòu)建載體的轉(zhuǎn)基因品種。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了最優(yōu)選的引物序列，用于PCR擴(kuò)增，可作為鑒別具有Seq IDNo. 1所示的植酸酶基因表達(dá)框的品種的有效手段，具有快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高等優(yōu)點(diǎn)和實(shí)用價(jià)值。
圖1植酸酶基因表達(dá)框啟動(dòng)子端片段擴(kuò)增檢測(cè)電泳圖 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米;3， 4 :空白對(duì)照 圖2植酸酶基因表達(dá)框終止子端片段擴(kuò)增檢測(cè)電泳圖 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米;3 :空白對(duì)照
4
圖3本發(fā)明的PCR方法(引物對(duì)Phy-1F/Phy-1R)鑒定植酸酶基因表達(dá)框 其中M :Marker DL2000 ;1，2 :轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米；3-8 :6個(gè)玉米市場(chǎng)樣品；9， 10 :
空白對(duì)照 圖4本發(fā)明的PCR方法(引物對(duì)Phy-2F/Phy-2R)鑒定植酸酶基因表達(dá)框 其中M :Marker DL2000 ;1， 2 :轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米；3_8 :6個(gè)玉米市場(chǎng)樣品；9 :空白
對(duì)照
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 轉(zhuǎn)基因玉米中的植酸酶基因表達(dá)框序列的克隆
1實(shí)驗(yàn)材料
1. 1植物材料轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號(hào)農(nóng)基安證字(2009)第074號(hào)，中國(guó)農(nóng)
業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研發(fā))，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。
1. 2酶與試劑 分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、 Taq DNA聚合酶、DL2000Marker、 A/HindIII Marker等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。 其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器 PCR擴(kuò)增儀Mastercycle gradient (Eppendorf co.) 核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠) DNA測(cè)序儀(A卯lied Biosystem377型全自動(dòng)熒光序列分析儀) DNA電泳分析系統(tǒng)Kodak EDAS 290 (Kodak co.) 其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。 2實(shí)驗(yàn)方法和過程 2. 1玉米基因組DNA提取與檢測(cè) 2. 1. 1玉米基因組DNA提取 取子葉期的幼嫩玉米葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊(cè)，進(jìn)行玉米材料總DNA的提取。
2丄4DNA檢測(cè) 取5iU提取的DNA溶液，以O(shè). 8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA的濃度和純度。
2. 2植酸酶基因表達(dá)框啟動(dòng)子端序列和終止子端序列的獲得 木艮據(jù)Chen等(Rumei Chen， Guangxing Xue， et al. Transgenic maize plantsexpressing a f皿galphytase gene. Transgenic Res. 2008， 17 :633-643)關(guān)于轉(zhuǎn)基因植酸 酶玉米轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建信息，植酸酶基因構(gòu)建在一個(gè)玉米種子特異性(LEGlpromoter)和 玉米種子特異性終止子(LEGlterminator)之間，但文獻(xiàn)中沒有提供具體的序列信息。根據(jù) 文獻(xiàn)中的信息，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃WWW.ncbi.nlm.nih. gov/)中檢索到植酸酶基因序 列(登錄號(hào)AF537344);經(jīng)過對(duì)大量用于玉米的啟動(dòng)子及終止子序列進(jìn)行篩選，最終發(fā)現(xiàn) 根據(jù)美國(guó)專利(US patent No. 7， 211， 712)中公開的啟動(dòng)子序列(Seq ID No. 2)和終止子 序列(Seq ID No. 3)設(shè)計(jì)的引物能夠與植酸酶基因序列(登錄號(hào)AF537344)的引物擴(kuò)增 出特異條帶。 在Seq ID No. 2所示的序列中中設(shè)計(jì)正向引物pLEG-pl，在植酸酶基因 (AF537344)中設(shè)計(jì)反向引物Phy-R，見表1，引物組合擴(kuò)增轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101基 因組中的植酸酶基因表達(dá)框啟動(dòng)子端序列。 在植酸酶基因(AF537344)中設(shè)計(jì)正向引物Phy-F，在Seq ID No. 3所示的序列中 設(shè)計(jì)反向引物tLEG-p2，序列見表l，引物組合擴(kuò)增轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101基因組中 的植酸酶基因表達(dá)框終止子端序列。 反應(yīng)體系0. 25ii L rTaq(5U/ii L) ，5ii L 10 XPCR Buffer (Mg2+Plus) ， 4 ii L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 y L (10 y M)，模板各2 y L (20ng/ y L)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至 50ii L。 擴(kuò)增程序94。C預(yù)變性4min ;94。C變性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸2min， 35 個(gè)循環(huán)；72°C 10min。 表1用于植酸酶基因表達(dá)框PCR擴(kuò)增的引物
引物序列
pLEG-pl5 '-GAACCGAGCGATCTCACGAG-3'
Phy-F5 '-GATGACCTGACTCCCTTTGG-3'
Phy-R5 '-GCTCAGACTGGCATTGCATC-3，
tLEG-p25 '-CTTCTGACATTGGCGTCAGG-3' 2. 3序列測(cè)定和分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0. 8 %的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收擴(kuò)增片段，連接到pGEM-T easy (Promega， Madison， Wis.)，采用ABI PRISM 1300Genetic Analyzer進(jìn)行序列測(cè)定。采用軟件vector NTI10. 3 (Invitrogen)對(duì)測(cè)定的 序列進(jìn)行拼接和分析。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3. 1轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框的序列 采用兩對(duì)引物組合分別擴(kuò)增轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植 酸酶基因表達(dá)框啟動(dòng)子端和終止子端序列長(zhǎng)度分別為1982bp和1709bp，見圖1和圖2。經(jīng)拼接獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植酸酶基因表達(dá)框的序列，其長(zhǎng)度為2814bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。 3. 2轉(zhuǎn)基因玉米植酸酶基因表達(dá)框序列的分析通過序列分析得出，該序列的l-649bp位置為L(zhǎng)EG promoter區(qū)域；650-784bp位置 為信號(hào)肽序列，785-2134bp為植酸酶基因序列，2135_2814bp為L(zhǎng)EG terminator區(qū)域。序 列在NCBI檢索，未檢索到相似的閱讀框構(gòu)建。
實(shí)施例2 本發(fā)明的PCR方法應(yīng)用于鑒定玉米樣品中的植酸酶基因表達(dá)框
1實(shí)驗(yàn)材料
1. 1植物材料 轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101，(審批編號(hào)農(nóng)基安證字(2009)第074號(hào)，中國(guó)農(nóng)
業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研發(fā))，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。 6個(gè)玉米種子樣品(市場(chǎng)購(gòu)買) 1. 2酶與試劑 見實(shí)施例1中1. 2酶與試劑。 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器 見實(shí)施例1中1. 3實(shí)驗(yàn)儀器。 2實(shí)驗(yàn)方法和過程 2. 1玉米基因組DNA提取與檢測(cè) 見實(shí)施例1中2. 1玉米基因組DNA提取與檢測(cè)。 2.2玉米樣品中的植酸酶基因表達(dá)框鑒定 根據(jù)測(cè)定的植酸酶基因表達(dá)框序列，在啟動(dòng)子上和植酸酶基因上分別設(shè)計(jì)引物
Phy-1F和Phy-1R，擴(kuò)增啟動(dòng)子_植酸酶基因連接區(qū)域，建立植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建特異性
檢測(cè)PCR。引物Phy-1F和Phy-1R序列見表2，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為257bp。 在植酸酶基因和終止子上分別設(shè)計(jì)引物Phy-2F和Phy-2R，擴(kuò)增植酸酶基因-終止
子連接區(qū)域，建立植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建特異性檢測(cè)PCR。引物Phy-2F和Phy-2R序列見表
2，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為296bp。 PCR反應(yīng)體系為0. 25 ii L rTaq (5U/ ii L) ， 5 ii L 10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) ， 4 ii L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 y L (10 y M)，模板各2 y L (20ng/ y L)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至 50ii L。 擴(kuò)增程序?yàn)?4 。C預(yù)變性4min ;94 。C變性30sec， 52 。C退火30sec， 72 。C延伸 30sec，35個(gè)循環(huán)；72°C 10min。擴(kuò)增結(jié)果表明，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米BVLA430101能獲得預(yù)期 的257bp和296bp片段，見圖3和圖4，而從市場(chǎng)購(gòu)買的6個(gè)其它玉米樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增片 段。 進(jìn)一步分別克隆這兩個(gè)擴(kuò)增片段，按實(shí)施例1中"2. 3序列測(cè)定和分析"進(jìn)行測(cè)序
和分析。序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的257bp片段與SEQ ID NO. 1的574-830位完全一
致，擴(kuò)增得到的296bp片段與SEQ ID N01的1997-2292位完全一致。 表明本發(fā)明的PCR方法適用于鑒別玉米樣品中的植酸酶基因表達(dá)框 表2鑒別植酸酶基因表達(dá)框的PCR引物
引物序列
Phy-1F5' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'
Phy-IR5' -CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'
Phy-2F5' CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'
Phy-2R5' -GGCAAATCACTCGGTGTAT-3'
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權(quán)利要求
鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的PCR方法，其步驟如下(1)采用引物對(duì)A/B和C/D分別對(duì)待測(cè)品種的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)凝膠電泳檢測(cè)兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，都出現(xiàn)目標(biāo)長(zhǎng)度的檢測(cè)帶的品種為轉(zhuǎn)有Seq IDNo.1所示核苷酸序列的構(gòu)建載體的轉(zhuǎn)基因品種，引物對(duì)A/B的正向引物A根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列1-649bp位置設(shè)計(jì)，反向引物B根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設(shè)計(jì)；引物對(duì)C/D的正向引物C根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設(shè)計(jì)，反向引物D根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列2135-2814bp位置設(shè)計(jì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR方法，所述正向引物A為Phy-1F : 5 ' -CACCATCAGCAATGCACACC-3'，所述反向引物為BPhy-1R : 5 ' -CCGTATCGCAAGTGGACTGA-3'，擴(kuò)增的片段為長(zhǎng)度為 257bp。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PCR方法， 所述正向引物C為Phy-2F :5 '-CGTGTCTTGGTTAATGATCG-3'，所述反向引物D為Phy-2R :5 '-GGCAAATCACTCGGTGTATC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為296bp。
全文摘要
本發(fā)明“鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶基因表達(dá)框構(gòu)建的PCR方法”，屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)領(lǐng)域。包括如下步驟(1)采用引物對(duì)Phy-1F/Phy-1R和Phy-2F/Phy-2R分別對(duì)待測(cè)品種的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)凝膠電泳檢測(cè)兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，都出現(xiàn)目標(biāo)長(zhǎng)度的檢測(cè)帶的品種為轉(zhuǎn)有Seq ID No.1所示核苷酸序列的構(gòu)建載體的轉(zhuǎn)基因品種；所述正向引物Phy-1F根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列1-649bp位置設(shè)計(jì)，反向引物Phy-1R根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設(shè)計(jì)；所述正向引物Phy-2F根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置設(shè)計(jì)，反向引物Phy-2R根據(jù)Seq ID No.1所示核苷酸序列2135-2814bp位置設(shè)計(jì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792811SQ20101014383
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者孫爻, 彭于發(fā), 謝家建 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所