專利名稱：：檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其一種檢測(cè)試劑盒，具體來說是一種基于PCR技術(shù)檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒，及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)是1933年由我國(guó)學(xué)者陳心陶在廣東省廣州市黑家鼠(Rattusrattus)和褐家鼠(R.norvegicus)肺部發(fā)現(xiàn)并命名的，屬圓線蟲目(Strongylata)、后圓線蟲科(Metastronylidae)、管圓線蟲屬(Angiostrongylus)。主要分布在太平洋、印度洋某些島嶼和東南亞國(guó)家。廣州管圓線蟲的發(fā)育過程分為幼蟲和成蟲階段，幼蟲分為I期、II期、III期、IV期和V期幼蟲。廣州管圓線蟲成蟲寄生在鼠肺動(dòng)脈內(nèi)，雌蟲產(chǎn)卵于血流中，蟲卵隨血流到肺毛細(xì)血管，在末梢動(dòng)脈血管內(nèi)形成栓塞并發(fā)育，成熟后孵出第一期幼蟲，幼蟲穿過毛細(xì)血管進(jìn)入肺泡，在呼吸道沿氣管上行到達(dá)咽喉部，再吞入消化道，最后隨糞便排出體外。當(dāng)?shù)谝黄谟紫x被軟體動(dòng)物吞食或主動(dòng)鉆入其體內(nèi)而感染發(fā)育成第三期幼蟲(感染期幼蟲)。當(dāng)鼠吞食含感染期幼蟲的軟體動(dòng)物或飲用了受污染的水后，幼蟲在鼠胃內(nèi)蛻鞘，并進(jìn)入腸壁小血管，經(jīng)肝或淋巴管、胸導(dǎo)管被帶至右心，再經(jīng)肺部血管至左心，由此到達(dá)身體各部器官發(fā)育為成蟲并產(chǎn)卵，完成廣州管圓線蟲的一個(gè)生活周期。人類多因食用含有第III期活幼蟲的淡水螺肉而感染，也可通過食用轉(zhuǎn)續(xù)宿主如魚、蝦、蛙等或污染的水及蔬菜等而感染，皮膚接觸也有可能導(dǎo)致感染。當(dāng)有活力的III期幼蟲被人誤食，廣州管圓線蟲在人體內(nèi)移行，穿過人體消化道壁進(jìn)入血管，順血流進(jìn)入腦部，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害和炎癥反應(yīng)。廣州管圓線蟲病患者臨床癥狀多數(shù)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的腦膜腦炎和腦膜炎癥狀，主要表現(xiàn)為急性頭痛、頸項(xiàng)強(qiáng)直、腦膜刺激癥等，嚴(yán)重者亦可引起死亡。目前，全球報(bào)道病例已超過2800多例。在我國(guó)大陸第一例廣州管圓線蟲病例報(bào)道于1984年，直到1996年只有3例病例。然而，隨著人類飲食習(xí)慣的變化，病例數(shù)顯著增加，在過去的十年里，中國(guó)大陸發(fā)生了9次暴發(fā)，臺(tái)灣3次，尤其是在我國(guó)近期的幾次暴發(fā)中，病例數(shù)超過300多例。隨著該蟲中間宿主的擴(kuò)散蔓延及食用螺肉者增多，發(fā)病人數(shù)呈繼續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，且有從南方沿海向北方蔓延的趨勢(shì)，其蔓延的速度之快引起人們的重視。廣州管圓線蟲病已經(jīng)引起了我國(guó)衛(wèi)生部門和世界衛(wèi)生組織的重視。衛(wèi)生部在2003年將廣州管圓線蟲病列為我國(guó)“新發(fā)傳染病”，2005年再一次警告人們警惕包括廣州管圓線蟲在內(nèi)的嚴(yán)重威脅人類健康的食源性寄生蟲病。從生活史可看出，完成生活史周期必須要以鼠作為終宿主及某些螺類作為中間宿主。目前在我國(guó)有報(bào)道的廣州管圓線蟲中間宿主有小管福壽螺(Pomaceacanaliculate)、褐云瑪瑙螺、皺疤堅(jiān)螺、短梨巴蝸牛、同型巴蝸牛、中華圓田螺、環(huán)棱螺及蛞蝓等。在眾多中間宿主中，小管福壽螺是廣州管圓線蟲的重要中間宿主，其廣州管圓線蟲自然感染率最高(65%)，在溫州地區(qū)其自然感染率高至69%。近年來溫州與福州地區(qū)以及近期北京市廣州管圓線蟲病的暴發(fā)均因食用福壽螺引起。小管福壽螺已成為傳播廣州管圓線蟲的優(yōu)勢(shì)種群之一。小管福壽螺為軟體動(dòng)物門(Mollusca)，腹足綱(Gastropoda)，前腮亞綱(Prosobranchia)，ifIIliilMg(Caenogastropoda)，中月復(fù)g(Mesogastropoda)，Mil超科(Ampullarioidae)，瓶螺科(Ampullariidae)。原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，由巴西華僑以高蛋白質(zhì)食物引進(jìn)臺(tái)灣，1981年引入廣東，在該省作為特種經(jīng)濟(jì)作物廣為養(yǎng)殖，后又被引入到其他省份養(yǎng)殖。近十幾年來，張瑩珍等報(bào)道福州市區(qū)福壽螺的感染率為20.85%(49/235)，林金祥等報(bào)導(dǎo)福建長(zhǎng)樂福壽螺的感染率為40.0%，羅斌等報(bào)告福州市福壽螺感染率為18.82%，李莉莎等報(bào)告福建省連江南安兩地福壽螺感染率為16.64%，柳堅(jiān)等調(diào)查了海南定安縣的小管福壽螺顯示感染率為7.1%(10/140)，孫慧冰等報(bào)道廣東肇慶市小管福壽螺感染率為10.79%，張志強(qiáng)等報(bào)告茂名市福壽螺的感染率為20.14%，鄧卓暉等報(bào)道廣東省小管福壽螺平均感染率為5.9%(172/2929)。目前，小管福壽螺的檢測(cè)方法，主要是基于顯微鏡的病原學(xué)檢測(cè)，包括直接沉淀鏡檢法、胃蛋白酶消化法和肺檢法。直接沉淀鏡檢法亦稱勻漿法，是將研磨的小管福壽螺的組織用脫氯水沉淀數(shù)次后鏡檢沉淀中幼蟲情況；胃蛋白酶消化法則是將研碎的組織用蛋白酶消化后鏡檢沉淀中的幼蟲情況；肺檢法是在光鏡下觀察肺囊中幼蟲結(jié)節(jié)的方法。然而，由于福壽螺體積較大而廣州管圓線蟲III期幼蟲(L3)相對(duì)較小，這些檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)者知識(shí)和技術(shù)要求較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)于感染度較低的福壽螺漏檢率高，同時(shí)對(duì)于早期感染檢測(cè)困難。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR技術(shù)在敏感性和特異性上的優(yōu)勢(shì)，已逐漸被用于寄生蟲病檢測(cè)上。但目前，仍沒有針對(duì)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的PCR檢測(cè)方法。然而在檢測(cè)軟體動(dòng)物時(shí)，常常因軟體動(dòng)物中存在大量PCR抑制物而導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗，而出現(xiàn)假陰性情況的發(fā)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒及方法，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)小管福壽螺提供一種新的、更為快速有效的病原體檢測(cè)手段。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒，所述的試劑盒中含有=(A)CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)裂解液(含有2%CTAB，20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，0·lmol/LTris-Cl(三羥甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl(氯化鈉))；(B)巰基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，苯酚氯仿異戊醇(25241)；(E)Tris-EDTA緩沖液，該緩沖液含IOmmol/LTris-Cl和Immol/LEDTA，pH為8.0;(F)2XMasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)，所述引物含有引物1和引物2；引物1(此對(duì)序列是已報(bào)道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己設(shè)計(jì)的)上游:5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。該試劑盒可抽提DNA100次，含有㈧CTAB裂解液50_70ml，(B)巰基乙醇800-1000μ1,(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700μ1,(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120-200ml,(E)Tris-EDTA緩沖液6_15ml，(F)2XMasterPCRMixF750μ1,(G)IOymol/L的引物60μ1。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種采用上述的試劑盒檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的方法，包括如下步驟1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取彡lOOmg，加入(A)CTAB裂解液500-700μ1,(B)巰基乙醇8-10μ1以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5_7μ1，60°C水浴5_10小時(shí)至完全消化；2)加入⑶苯酚、氯仿和異戊醇的混合液500-700μ1，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心IOmin；4)重復(fù)第3)步；5)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下11，000-13，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ170%或75%乙醇洗滌，常溫下10，000-13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入(E)Tris-EDTA緩沖液60-150μ1溶解，_20°C保持備用；9)將步驟8)的產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)將雙蒸滅菌水5.9μ1，(F)2XMasterPCRMix7.5μ1,(6)1(^11101/1的引物0.6(^1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后500-5000rpm簡(jiǎn)短離心5_10s，進(jìn)行PCR反應(yīng)；10)PCR產(chǎn)物取6μ1進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。步驟9)中PCR反應(yīng)的條件為95°C預(yù)變性5min后進(jìn)行94°C變性lmin、56°C退火45s、72°C延伸Imin的35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸7min后保存。本發(fā)明的有益效果在于目前的各種PCR衍生技術(shù)中，多重PCR技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)與假陰性控制。本發(fā)明在PCR反應(yīng)體系中除特異性擴(kuò)增廣州管圓線蟲的引物外，還加入一對(duì)特異性擴(kuò)增小管福壽螺的引物，作為內(nèi)參，采用該兩對(duì)引物(上述引物1和引物2)進(jìn)行PCR反應(yīng)可以避免假陰性情況的發(fā)生。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)旨在建立一種多重PCR方法快速檢測(cè)方法應(yīng)對(duì)這種以暴發(fā)形式出現(xiàn)的食源性寄生蟲病。為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)小管福壽螺提供一種新的、更為有效的病原體檢測(cè)手段。本發(fā)明方法可檢測(cè)廣州管圓線蟲的最低濃度為120pg/μ1。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)153個(gè)小管福壽螺樣本，與肺檢法比較，敏感度達(dá)到93.8%，特異度為95.2%。本發(fā)明的試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，為基層展開小管福壽螺分子學(xué)檢測(cè)提供便利，同時(shí)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單實(shí)用。本發(fā)明的檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒及檢測(cè)方法在小管福壽螺流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以及廣州管圓線蟲病暴發(fā)時(shí)食用螺檢測(cè)中有著重要的作用，擁有廣闊的應(yīng)用前景。圖1是實(shí)施例4中多重PCR的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中采用的試劑如下A液CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)；B液巰基乙醇；C液蛋白酶K(20mg/mL)；D液苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中，苯酚氯仿異戊醇為25241；E液Tris-EDTA緩沖液(10mmol/LTris-Cl,Immol/LEDTA,ρΗ8·0)；F液2XMasterPCRMix；G液引物(10μmol/L)，含有引物1和引物2引物1(此對(duì)序列是已報(bào)道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己設(shè)計(jì)的)上游5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。其中，CTAB、巰基乙醇購自AMRESC0，EDTA,NaCl購自華美生物工程公司，Tris-Cl購自BIOBASICINC.，蛋白酶K購自Sigma公司，2XMasterPCRMix購自上海萊楓生物科技有限公司，苯酚購自所來報(bào)生物科技有限公司，氯仿、異戊醇購自上?；瘜W(xué)化工公司。實(shí)施例1采用試劑盒進(jìn)行小管福壽螺DNA抽提1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取50mg左右，加入600μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),9μ1B液(巰基乙醇)，6μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入600μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，10，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，10,OOOrpm離心IOmin；4)重復(fù)第3)步；5)取上清，加入2倍體積無水乙醇，11，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，11，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入80μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用。實(shí)施例2采用試劑盒進(jìn)行已有DNA樣本的檢測(cè)1)PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備雙蒸滅菌水5.9μ1，F(xiàn)液(2XMasterPCRMix)7.5μ1，G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，實(shí)施例1步驟8)完成后獲取的已有DNA樣本1μ1，充分混勻后500rpm簡(jiǎn)短離心5s；2)PCR反應(yīng)體系如下950C預(yù)變性5min940C變性1min560C退火45sI35個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min」720C延伸7min3)PCR產(chǎn)物取6μ1進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。實(shí)施例3采用試劑盒進(jìn)行小管福壽螺DNA抽提及檢測(cè)1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取IOOmg左右，加入700μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB,20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),10μ1B液(巰基乙醇)，7μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入700μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，16，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，16，OOOrpm離心IOmin；4)重復(fù)第3)步；5)取上清，加入3倍體積無水乙醇，13，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入150μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用。9)將第8)步的產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)；9.1)PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備雙蒸滅菌水5.9μ1，F(xiàn)液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后5000rpm簡(jiǎn)短離心IOs；9.2)PCR反應(yīng)體系如下95°C預(yù)變性5min94°C變性1min56°C退火45sL35個(gè)循環(huán)；72"C延伸1min」720C延伸7min9.3)PCR產(chǎn)物取6μ1進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。實(shí)施例4采用試劑盒進(jìn)行小管福壽螺DNA抽提及檢測(cè)1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取IOOmg左右，加入500μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl))，8μ1B液(巰基乙醇)，5μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入500μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，13，200rpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，13，200rpm離心IOmin；4)重復(fù)第3)步；5)取上清，加入2.5倍體積無水乙醇，12，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，10，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入60μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用；9)將第8)步的產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)；9.1)PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備雙蒸滅菌水5.9μ1，F(xiàn)液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后2000rpm簡(jiǎn)短離心8s；9.2)PCR反應(yīng)體系如下950C預(yù)變性5min940C變性1min560C退火45s135個(gè)循環(huán)；720C延伸1min^72°C延伸7min9.3)PCR產(chǎn)物取6μ1進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。10)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性、陽性結(jié)果判斷見圖1。如圖1所示，1-6是陰性螺樣本，即僅一條大小約為550bp的條帶。550bp條帶為小管福壽螺擴(kuò)增條帶，表明抽提DNA中僅含小管福壽螺DNA，而無廣州管圓線蟲DNA，說明該螺樣本未感染廣州管圓線蟲，為陰性；7-15、17是陽性螺樣本，即存在一條大小約為550bp和一條大小約為405bp的條帶，其中405bp條帶為廣州管圓線蟲擴(kuò)增條帶，表明抽提DNA同時(shí)含有小管福壽螺和廣州管圓線蟲DNA，說明該螺樣本感染廣州管圓線蟲，為陽性；16是陰性對(duì)照，即無擴(kuò)增條帶，在該情況下表明PCR檢測(cè)失??；M是DNAmarkerII。本發(fā)明方法可檢測(cè)廣州管圓線蟲的最低濃度為120pg/y1。153只從野外采集的福壽螺，經(jīng)肺檢法檢測(cè)并記錄每只小管福壽螺的感染情況后進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與肺檢法比較，本發(fā)明檢測(cè)方法的敏感度達(dá)到93.8%，特異度為95.2%。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求一種檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有(A)CTAB裂解液，該CTAB裂解液含有2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl和1.4mol/LNaCl；(B)巰基乙醇；(C)20mg/mL的蛋白酶K；(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，苯酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1；(E)Tris-EDTA緩沖液，該緩沖液含10mmol/LTris-Cl和1mmol/LEDTA，pH為8.0；(F)2×MasterPCRMix；(G)10μmol/L的引物，所述引物含有引物1和引物2，該引物1的序列為上游5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’(SEQIDNO1所示序列)，下游5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3’(SEQIDNO2所示序列)；該引物2的序列為上游5’-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3’(SEQIDNO3所示序列)，下游5’-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3’(SEQIDNO4所示序列)。2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可抽提DNA100次，含有(A)CTAB裂解液50_70ml，(B)巰基乙醇800-1000u1，(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700u1,(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120_200ml，(E)Tris-EDTA緩沖液6-15ml，(F)2XMasterPCRMixF750u1，(G)10iimol/L的引物60ii1。3.—種檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的方法，包含如下步驟1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取<100mg，加入如權(quán)利要求1所述的(A)CTAB裂解液500-700u1,(B)巰基乙醇8-10iil以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5-7yl，60°C水浴5-10小時(shí)至完全消化；2)加入如權(quán)利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液500-700iU，充分混勻，常溫下10，000-16,OOOrpm離心lOmin；3)取上清，加入等體積的如權(quán)利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心lOmin；4)重復(fù)第3)步；5)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下11，000-13，OOOrpm離心lOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500ill70%或75%乙醇洗滌，常溫下10，000-13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入如權(quán)利要求1所述的(E)Tris-EDTA緩沖液60-150u1溶解，_20°C保持備用；9)將步驟8)的產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)將雙蒸滅菌水5.9iU，如權(quán)利要求1所述的(F)2XMasterPCRMix7.5yl，如權(quán)利要求1所述的(G)10iimol/L的引物0.60yl，步驟8)獲取的DNA樣本1ii1，充分混勻后500-5000rpm簡(jiǎn)短離心5_10s，進(jìn)行PCR反應(yīng)；10)PCR產(chǎn)物取6iU進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的方法，其特征在于，步驟9)中PCR反應(yīng)的條件為95°C預(yù)變性5min后進(jìn)行94°C變性lmin、56°C退火45s、72°C延伸lmin的35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72°C延伸7min后保存。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的試劑盒，該試劑盒中含有(A)CTAB裂解液(2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl，1.4mol/LNaCl)；(B)巰基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)；(E)Tris-EDTA緩沖液(10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，pH8.0)；(F)2×MasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)。此外，本發(fā)明還公開了檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲的方法。本發(fā)明的試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單實(shí)用，為基層展開小管福壽螺分子學(xué)檢測(cè)提供便利，同時(shí)為廣州管圓線蟲病暴發(fā)后食用螺的檢測(cè)提供有效手段。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101824474SQ201010137439公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者劉和香,危芙蓉,呂山,周曉農(nóng),張儀,胡玲申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所