專利名稱：基于生物小rna的分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)與基因工程領(lǐng)域，涉及一種基于生物小RNA序列的分子標(biāo)記新 技術(shù)。該技術(shù)適用于動植物、微生物等生物標(biāo)記開發(fā)，且是一種基于PCR和基因表達(dá)序列的 高通量功能標(biāo)記。
背景技術(shù)：
自從Botsein等人在1980年為構(gòu)建人類遺傳圖譜首次使用分子標(biāo)記技術(shù)，即限制 性片段長度多態(tài)性(RFLP)以來，人們已經(jīng)開發(fā)出了各種不同的分子標(biāo)記來進(jìn)行DNA多態(tài)性 的檢測。分子標(biāo)記技術(shù)主要可分為兩大類基于PCR技術(shù)和非基于PCR技術(shù)(如RFLP)?；?PCR技術(shù)的分子標(biāo)記又可進(jìn)一步分為兩類，即基于隨機(jī)引物技術(shù)(如擴(kuò)增性片段長度多態(tài) 性，AFLP和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，RAPD)和基于目標(biāo)序列的PCR技術(shù)(Agarwal et al. Plant CellRep 2008，27 :617_631)。在目標(biāo)序列這一類型中，除了基于微衛(wèi)星技術(shù)(如簡單序列 重復(fù)，SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)技術(shù)，基于轉(zhuǎn)座元件的分子標(biāo)記也得到了很好的開發(fā)。 這種標(biāo)記是根據(jù)那些大量且廣泛分布于基因組中的一小段保守序列(如LTR)來進(jìn)行引物 設(shè)計的。例如，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間長度多態(tài)性(IRAP) (Waugh et al. Mol Gen Genet 1997， 253 687-694 ；Kalendar et al. Theo Appl Genet 1999,98:704-711)和 MITE 間長度多態(tài) 性(IMP) (Chang et al. Theo Appl Genet 2001,102:773-781)。利用 MITE(微反向重復(fù)轉(zhuǎn) 座因子)中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的長末端重復(fù)(LTR)和末端反向重復(fù)(TIR)來進(jìn)行引物設(shè)計，在 幾種作物(如大麥)中都得到了很好的應(yīng)用。內(nèi)源性非編碼小RNA (通常21-24個核苷酸)在植物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面發(fā)揮重 要作用。總體上，基于小RNA合成機(jī)理和功能(Bartel Cell 2004，116 (2) :281_297)來說， 小RNA主要可分為兩種，即微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA)。最近研究(Taft etal. Nature Genetics 2009,41 :572_578)發(fā)現(xiàn)一種新類型的 RNA，即轉(zhuǎn)錄起始 RNA(tiRNA)，是 位于轉(zhuǎn)錄起始點上游60個核苷酸和下游120個核苷酸片段上的長度大多為18個核苷酸的 一種RNA，具有調(diào)控功能。通過高通量測序途徑可以獲得18-35個核苷酸長度的小RNA序 列。小RNA序列通常是保守的，例如miRNA，但小RNA兩翼序列多態(tài)性是很高的，很多結(jié)構(gòu)性 差異(如插入或缺失)(如在水稻上，Wang et al. BMC Evol Biol,2010, in press)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法。為解 決該技術(shù)問題，本發(fā)明中的基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟(1)小RNA序列數(shù)據(jù)的獲得提取生物總RNA，然后根據(jù)序列長度進(jìn)行分離，對其中序列長度小于35nt的RNA樣 品進(jìn)行測序，以得到長度在15 35nt之間小RNA序列；(2)小RNA序列基因組定位將前述小RNA定位到相應(yīng)基因組上，獲得每個特異小RNA在基因組定位位點的數(shù)量和與其兩端相連序列的數(shù)據(jù)；(3) PCR引物設(shè)計根據(jù)在基因組中特異定位位點數(shù)量超過1000個的一批小RNA及其兩端相連序列設(shè)計PCR引物，并通過組合獲得引物對，然后通過ePCR進(jìn)行引物對的篩選； (4) PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性檢測根據(jù)上步獲得的引物對，進(jìn)行遺傳作圖群體或遺傳多態(tài)性群體PCR擴(kuò)增和多態(tài)性 條帶的確定，PCR產(chǎn)物的檢測通過普通變性膠或非變性膠檢測，或者通過同位素標(biāo)記技術(shù)標(biāo) 記方式進(jìn)行檢測，以提供檢測精度和該標(biāo)記開發(fā)的效率。本發(fā)明中，步驟(1)中所述的測序是高通量測序。本發(fā)明中，針對擴(kuò)增條帶過多的情況，在引物設(shè)計中增加1 2個隨機(jī)堿基接頭。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是一種新的生物分子標(biāo)記技術(shù)，可應(yīng)用于動植物和微生物；該標(biāo)記基于實 際表達(dá)的小RNA序列直接設(shè)計引物，為功能標(biāo)記；該標(biāo)記為PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，同 時該技術(shù)會產(chǎn)生幾十條PCR產(chǎn)物帶，因此也是一種高通量的分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明標(biāo)記可 以利用領(lǐng)域主要包括(1)分子標(biāo)記輔助選擇育種。也就是用于作物品種的選育；(2)遺傳 圖譜的構(gòu)建；(3)重要功能基因的定位和發(fā)現(xiàn)；(4)特定性狀或疾病的早期診斷、早期篩選； (5)親緣關(guān)系判斷(如農(nóng)作物品種混雜、親子鑒定等)。
圖1為本發(fā)明的一個煙草iSNAP標(biāo)記(11F/6R)在不同煙草品種中擴(kuò)增情況。其中箭頭所指的位置為該標(biāo)記在不同品種間表現(xiàn)為多態(tài)；最左列為標(biāo)樣 (Marker)擴(kuò)增情況。
具體實施例方式本發(fā)明的基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟第一步小RNA序列數(shù)據(jù)的獲得提取生物總RNA，然后根據(jù)序列長度進(jìn)行分離，獲得的長度小于35nt的RNA樣品進(jìn) 行高通量測序或其他途徑測序。具體方法見Zhu et al. Genome Res，2008，18 1456-1465。第二步小RNA序列基因組定位將獲得的長度在15 35nt之間小RNA序列，通過相應(yīng)基因組序列和生物信息學(xué) 方法將這些小RNA定位到基因組上，獲得每個特異小RNA在基因組定位的數(shù)量和其相連序 列數(shù)據(jù)；第三步PCR引物設(shè)計根據(jù)在基因組中特異定位位點數(shù)量多的小RNA及其兩端相連序列設(shè)計PCR引物， 并通過組合獲得引物對；通過ePCR進(jìn)行引物對的篩選；第四步PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性檢測根據(jù)上步獲得的引物對進(jìn)行遺傳作圖群體或遺傳多態(tài)性群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增和多 態(tài)性條帶的確定。PCR產(chǎn)物的檢測可以通過普通變性膠或非變性膠檢測，也可以通過同位素 標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記方式進(jìn)行檢測以提供檢測精度和該標(biāo)記開發(fā)的效率。
具體應(yīng)用的實例煙草小RNA分子標(biāo)記開發(fā)第一步小RNA序列數(shù)據(jù)的獲得提取煙草根部總RNA，然后根據(jù)序列長度進(jìn)行分離，獲得的長度短的RNA樣品進(jìn)行 高通量 Solexia 測序。具體方法見 Zhu et al. Genome Res，2008，18 1456-1465。由此獲 得超過500萬條煙草小RNA讀序，長度分 布18 35nt。第二步小RNA序列基因組定位將獲得的長度在15 35nt之間小RNA序列，通過相應(yīng)基因組序列(來自NCBI的 GENBANK數(shù)據(jù)庫的煙草基因組調(diào)查序列GSS)和生物信息學(xué)方法將這些小RNA定位到GSS 上，獲得每個特異小RNA在GSS定位的數(shù)量和其相連序列數(shù)據(jù)；第三步PCR引物設(shè)計根據(jù)在GSS中特異定位位點數(shù)量多的小RNA及其兩端相連序列設(shè)計PCR引物并通 過組合獲得引物對。通過ePCR進(jìn)行引物對的篩選；第四步PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性檢測根據(jù)上步獲得的引物對進(jìn)行7個煙草栽培品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增和多態(tài)性條帶的確 定。PCR產(chǎn)物的檢測通過普通變性膠或非變性膠檢測。圖1中候選多態(tài)性條帶用箭頭標(biāo)出。本實例中，在煙草上基于包含以下小RNA序列設(shè)計的引物
序號I小RNA序列 ~ AGGTCGCCCACCAGTATAATGCGG ~~2 AGTTTAAATAGGCGCCCACCTGTA ““3 CTAGAACTTAAATGTATTCCCGCA ~ GTGGGCGCCTATTTAAACTAAGAC ~~5 TATACTGGTGGGCGACCTAGAA ~~6 TCCTATTCGAGGGCGGATGAA ~~7 TTTAAGTTCTAGGTCGCCCACC最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不 限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟(1)小RNA序列數(shù)據(jù)的獲得提取生物總RNA，然后根據(jù)序列長度進(jìn)行分離，對其中序列長度小于35nt的RNA樣品進(jìn)行測序，得到長度在15～35nt之間小RNA序列；(2)小RNA序列基因組定位將前述小RNA定位到相應(yīng)基因組上，獲得每個特異小RNA在基因組定位位點的數(shù)量和與其兩端相連序列的數(shù)據(jù)；(3)PCR引物設(shè)計根據(jù)在基因組中特異定位位點數(shù)量超過1000個的一批小RNA及其兩端相連序列設(shè)計PCR引物，并通過組合獲得引物對，然后通過ePCR進(jìn)行引物對的篩選；(4)PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性檢測根據(jù)上步獲得的引物對，進(jìn)行遺傳作圖群體或遺傳多態(tài)性群體PCR擴(kuò)增和多態(tài)性條帶的確定，PCR產(chǎn)物的檢測通過普通變性膠或非變性膠檢測，或者通過同位素標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記方式進(jìn)行檢測，以提供檢測精度和該標(biāo)記開發(fā)的效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法，其特征在于，步驟(1)中 所述的測序是高通量測序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法，其特征在于，針對擴(kuò)增條 帶過多的情況，在引物設(shè)計中增加1 2個隨機(jī)堿基接頭。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，旨在提供一種基于生物小RNA的分子標(biāo)記的方法。該方法包括步驟(1)小RNA序列數(shù)據(jù)的獲得；(2)小RNA序列基因組定位；(3)PCR引物設(shè)計；(4)PCR擴(kuò)增及其遺傳多態(tài)性檢測。本發(fā)明是一種新的生物分子標(biāo)記技術(shù)，可應(yīng)用于動植物和微生物；該標(biāo)記基于實際表達(dá)的小RNA序列直接設(shè)計引物，為功能標(biāo)記；該標(biāo)記為PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，同時該技術(shù)會產(chǎn)生幾十條PCR產(chǎn)物帶，因此也是一種高通量的分子標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要功能基因的定位和發(fā)現(xiàn)、特定性狀或疾病的早期診斷早期篩選、親緣關(guān)系判斷(如農(nóng)作物品種混雜、親子鑒定等)。
文檔編號C12Q1/68GK101812520SQ20101013682
公開日2010年8月25日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者桂毅杰, 樊龍江, 肖炳光 申請人:浙江大學(xué);云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院