專利名稱：：致病菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種病原微生物檢測方法，尤其是涉及一種雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌進(jìn)行快速鑒別診斷的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：快速、靈敏、特異的致病菌檢測分析對食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷治療和生物恐怖襲擊的防范等具有重要意義。傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法需要對細(xì)菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)及一系列生化反應(yīng)，操作復(fù)雜、檢測周期長，且無法適用于難以培養(yǎng)的病原菌，遠(yuǎn)不會g滿足實(shí)際需求([l]Iqbal，S.S.，etal.，Areviewofmolecularrecognitiontechnologiesfordetectionofbiologicalthreatagents.BiosensBioelectron，2000.15(11-12):549-578;[2]Deisingh，A.K.andM.Thompson,StrategiesforthedetectionofEscherichiacoli0157:H7infoods.JApplMicrobiol,2004.96(3):419-429)。近年來，運(yùn)用分子生物學(xué)及生物技術(shù)的最新研究成果，科研人員發(fā)展了一系列新的細(xì)菌快速檢測技術(shù)，如PCR相關(guān)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、ELISAs技術(shù)、噬菌體鑒定技術(shù)、流式細(xì)胞檢測技術(shù)和生物傳感技術(shù)等等([3]Hahn，M.A.，J.S.Tabb，andT.D.Krauss，Detectionofsinglebacterialpathogenswithsemiconductorquantumdots.Anal.Chem.，2005.77(15):4861-4869;[4]Czechowska，K.，D.R.Johnson,andJ.R.vanderMeer，Useofflowcytometricmethodsforsingle—cellanalysisinenvironmentalmicrobiology.CurrOpinMicrobiol，2008.11(3):205-212;[5]Karo，0.，etal.，Bacteriadetectionbyflowcytometry.ClinChemLabMed，2008.46(7):947-953.)。其中，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)因其具有檢測速度快、精度高和多參數(shù)分析等特點(diǎn)，在細(xì)菌檢測和鑒定方面獨(dú)具優(yōu)勢，已成為產(chǎn)品質(zhì)量控制、細(xì)菌致病機(jī)理以及微生物群落結(jié)構(gòu)研究的重要手段([4]Czechowska,K.，D.R.Johnson,andJ.R.vanderMeer，Useofflowcytometricmethodsforsingle—cellanalysisinenvironmentalmicrobiology.CurrOpinMicrobiol,2008.11(3):205-212)。例如，通過對細(xì)菌的核酸或蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，F(xiàn)CM可以快速、準(zhǔn)確地檢測樣本中的細(xì)菌總數(shù)、活菌數(shù)目和死菌數(shù)目。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，流式技術(shù)在細(xì)菌檢測方面的成功應(yīng)用層出不窮，Hammes等([6]Hammes，F(xiàn).，etal.，F(xiàn)low-cytometrictotalbacterialcellcountsasadescriptivemicrobiologicalparameterfordrinkingwatertreatmentprocesses.WaterRes，2008.42(1-2):269-277)用FCM快速檢測飲用水中污染的細(xì)菌數(shù)量，靈敏度比傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法高出兩個(gè)數(shù)量級；Burney等([7]Berney，M.，etal.，AssessmentandinterpretationofbacterialviabilitybyusingtheLIVE/DEADBacLightKitincombinationwithflowcytometry.ApplEnvironMicrobiol,2007.73(10):3283-3290)用FCM通過LIVE/DEAD熒光試劑盒鑒定了多種細(xì)菌的生理性能；流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合熒光原位雜交可以識別特定的核苷酸靶標(biāo)，已被應(yīng)用于基于16SrRNAs的細(xì)菌特異性識別及篩選表達(dá)特異mRNA的細(xì)菌([8]Jen，C.J.，etal.，F(xiàn)low—FISHanalysisandisolationof3clostridialstrainsinananaerobicsemi_solidbio_hydrogenproducingsystembyhydrogenasegenetarget.ApplMicrobiolBiotechnol，2007.74(5):1126-1134;[9]Kalyuzhnaya，M.G.，etal.，F(xiàn)luorescenceinsituhybridization_flowcytometry—cellsorting—basedmethodforseparationandenrichmentoftypeIandtypeIImethanotrophpopulations.ApplEnvironMicrobiol,2006.72(6):4293-4301)。致病菌的快速、靈敏檢測將為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病的診斷與治療等提供重要科學(xué)依據(jù)。建立在抗體特異性識別基礎(chǔ)上的免疫分析方法是致病菌特異檢測的傳統(tǒng)方法，然而特異性的單克隆抗體不僅價(jià)格昂貴，重復(fù)性不高，而且難以獲取。自然界中存在著數(shù)量眾多、種類各異的噬菌體為致病菌的特異性檢測提供了一個(gè)天然的寶庫。噬菌體能在活的具有感受性的菌體內(nèi)繁殖，并且每種細(xì)菌基本上都有特異的噬菌體。基于噬菌體的寄生專一性以及生長速度快等特點(diǎn)，近年來發(fā)展了一些噬菌體檢測特定致病菌的方法如噬菌斑法檢測結(jié)核分支桿菌技術(shù)([10]McNerney，R.，etal.，Developmentofabacteriophagephagereplicationassayfordiagnosisofpulmonarytuberculosis.JClinMicrobiol,2004.42(5):2115-2210);熒光標(biāo)記噬菌體結(jié)合免疫磁性分離法檢測大腸桿菌0157:H7([ll]Goodridge，L.，J.Chen，andM.Griffiths,TheuseofafluorescentbacteriophageassayfordetectionofEscherichiacoli0157:H7ininoculatedgroundbeefandrawmilk.IntJFoodMicrobiol,1999.47Q-2):43-50;[12]Goodridge丄，J.Chen，andM.Griffiths，Developmentandcharacterizationofafluorescent—bacteriophageassayfordetectionofEscherichiacoli0157:H7.ApplEnvironMicrobiol,1999.65(4):1397-1404);基于噬菌體的電化學(xué)方法([13]Neufeld，T.，etal.，Combinedphagetypingandamperometricdetectionofreleasedenzymaticactivityforthespecificidentificationandqimntificationofbacteria.AnalChem，2003.75(3):580-585);熒光素酶報(bào)告的分枝桿菌噬菌體和李斯特噬菌體檢測法([14]Banaiee，N.，etal.，Luciferasereportermycobacteriophagesfordetection，identification,andantibioticsusceptibilitytestingofMycobacteriumtuberculosisinMexico.JClinMicrobiol,2001.39(11):3883-3888;[15]Loessner，M.J.，etal.，ConstructionofluciferasereporterbacteriophageA511::luxABforrapidandsensitivedetectionofviableListeriacells.ApplEnvironMicrobiol,1996.62(4):1133-1140);檢測由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌裂解后釋放的酶(如腺苷酸激酶)([16]Blasco，R.，etal.，Specificassaysforbacteriausingphagemediatedreleaseofadenylatekinase.JApplMicrobiol,1998.84(4):661-666);利用噬菌體對沙門氏菌和大腸桿菌0157:H7等進(jìn)行檢測，從標(biāo)本收集到結(jié)果讀取僅需35h([17]Ulitzur，N.andS.Ulitzur，Newrapidandsimplemethodsfordetectionofbacteriaanddeterminationoftheirantibioticsusceptibilitybyusingphagemutants.ApplEnvironMicrobiol,2006.72(12):7455-7459)。0da等人將綠色熒光蛋白GFP嵌入對大腸桿菌0157:H7特異的噬菌體PP01的衣殼蛋白中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而通過熒光顯微鏡可以快速敏感的檢測至U細(xì)菌([18]Kottegoda，S.，etal.，Biarsenical-tetracysteinemotifasafluorescenttagfordetectionincapillaryelectrophoresis.AnalChem，2008.80(14):5358-5366)。但是由于GFP體積較大(由238個(gè)氨基酸組成)，它在活體標(biāo)記中可能會影響被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或細(xì)胞的正常生理功能，而且它的中等光穩(wěn)定性也限制了它在單分子研究中的應(yīng)用。另外，由于GFP是一個(gè)自發(fā)熒光蛋白，表達(dá)GFP的噬菌體不管對活菌，死菌還是不可培養(yǎng)菌均能識別而發(fā)光，從而無法區(qū)分細(xì)菌的生理狀態(tài)。2006年Edgar等人在《美國國家科學(xué)院院刊》上發(fā)表論文，他們利用活的細(xì)菌體內(nèi)會產(chǎn)生biotin的特點(diǎn)，將噬菌體進(jìn)行基因改造，使其表達(dá)與biotin相結(jié)合的肽段，再將親和素與量子點(diǎn)相連，利用生物素與親和素的結(jié)合使噬菌體標(biāo)記上熒光，從而可以在熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀上快速檢測到被相應(yīng)噬菌體侵染的細(xì)菌([19]Edgar，R.，etal.，High—sensitivitybacterialdetectio皿singbiotin-teggedphageandquantum—dotnanocomplexes.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(13):4841-4845)。然而這個(gè)方法，操作比較煩瑣，且用于檢測的噬菌體必須一直處于biotinfree狀態(tài)。雙砷染料是諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主錢永健實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的一種很有前途的活細(xì)胞蛋白標(biāo)記方法([20]Griffin，B.A.，S.R.Adams，andR.Y.Tsien，Specificcovalentlabelingofrecombinantproteinmoleculesinsidelivecells.Science,1998.281(5374):269-272)，該方法所用的熒光標(biāo)記探針為一類能夠穿透細(xì)胞膜和含有雙砷基團(tuán)的有機(jī)小分子(如FlAsH-EDT2)。雙砷熒光標(biāo)記分子進(jìn)入細(xì)胞后，與連在重組蛋白上的六肽標(biāo)簽CCXXCC序列(簡稱TC，其中X是除了半胱氨酸以外的其他氨基酸)發(fā)生特異性作用，形成強(qiáng)熒光的共價(jià)結(jié)合的雙砷染料_四半胱氨酸體系(熒光強(qiáng)度約為FlAsH-EDT2的50000倍)。目前，已經(jīng)開發(fā)出可產(chǎn)生藍(lán)色(ChoXAsH)、綠色(FlAsH)及紅色(ReAsH)熒光的雙砷染料。雙砷染料-四半胱氨酸體系具有背景噪音低、母體蛋白功能影響小、熒光團(tuán)共價(jià)連接牢固等優(yōu)點(diǎn)，并且整個(gè)體系可以通過電子顯微鏡監(jiān)測。雙砷染料體系較之廣泛應(yīng)用的熒光蛋白，最明顯的特點(diǎn)在于四半胱氨酸六肽標(biāo)簽序列體積小，不會影響被標(biāo)記蛋白質(zhì)或細(xì)胞的正常生理功能，另外染料量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、標(biāo)記速度快并且能夠提供除了熒光之外的其它讀出方式，成為更理想的蛋白質(zhì)熒光探針([21]K印pler，A.，etal.，Labelingoffusionproteinswithsyntheticfluorophoresinlivecells.ProcNatlAcadSciUSA，2004.101(27):9955—9959;[22]Miller，L.W.，etal.，Invivoproteinlabelingwithtrimethoprimconjugates:aflexiblechemicaltag.NatMethods,2005.2(4):255-257)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的細(xì)菌檢測操作較復(fù)雜、檢測周期較長和細(xì)菌特異性檢測中特異性單克隆抗體難以獲取、價(jià)格較昂貴等缺陷，提供一種致病菌的檢測方法，該檢測方法利用基因改造的噬菌體簡單、快速、靈敏、特異地鑒別致病菌。本發(fā)明所述雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體是對噬菌體進(jìn)行基因改造，在其外殼PIII蛋白上插入可以和新型雙砷染料特異結(jié)合的四半胱氨酸序列。改造后的噬菌體侵染特異的宿主菌并在其體內(nèi)大量繁殖，其衣殼蛋白上所表達(dá)的四半胱氨酸與后續(xù)加入的跨膜雙砷染料結(jié)合，熒光大大增強(qiáng)，可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行方便快速的檢測。本發(fā)明包括以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；2)將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連于噬菌體衣殼蛋白的表5達(dá)調(diào)控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；3)用步驟2)中的重組噬菌體侵染宿主細(xì)胞，并在其中繁殖，生成帶有表達(dá)四半胱氨酸重組噬菌體的重組細(xì)胞；4)在重組細(xì)胞中加入雙砷染料，經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合后，被重組噬菌體特異識別侵染的細(xì)菌，在激發(fā)光照射下可發(fā)出特異熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行特異性檢測。在步驟1)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP，所述編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指"TTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCT"。在步驟2)中，所述"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中所述噬菌體可選用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體，如市售的噬菌體，包括T7，M13等。在生產(chǎn)本發(fā)明的四半胱氨酸重組噬菌體時(shí)，可以將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連于噬菌體衣殼蛋白的表達(dá)調(diào)控序列中，從而形成在衣殼蛋白上表達(dá)四半胱氨酸的重組噬菌體。在步驟3)中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，是步驟2)中所用噬菌體特異識別的待檢測細(xì)菌，可以為E.coliBLT5403;E.coliTG1;E.coli0157和salmonella等。重組噬菌體侵染宿主細(xì)胞時(shí)，應(yīng)控制噬菌體和宿主細(xì)胞的比例小于1000:l，侵染繁殖時(shí)間可以為3090min。在步驟4)中，所述雙砷染料可以為FLAsH和ReAsH等熒光物質(zhì)中的至少一種，其終濃度為110iiM，反應(yīng)時(shí)間為3090min，反應(yīng)溫度為室溫，所述洗滌可分別用BAL(3-羥基-l，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗至少1次；在經(jīng)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行特異性檢測前可加入HBSS重懸。本發(fā)明制備的雙砷染料-四半胱氨酸-重組噬菌體，可根據(jù)待檢測致病菌的種類，選擇特定的專一識別的噬菌體進(jìn)行基因改造，在其衣殼蛋白上插入四半胱氨酸序列后，該重組噬菌體可以識別特定的致病菌，在其體內(nèi)生長繁殖，并表達(dá)可被雙砷染料識別的四半胱氨酸序列。被重組噬菌體侵染的致病菌，經(jīng)雙砷染料染色后，在合適的激發(fā)光照射下，該致病菌能夠發(fā)射熒光，并可以在流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡下明顯觀察和區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)對特定致病菌的快速鑒別。圖1為多價(jià)噬菌體侵染細(xì)菌用流式分析儀檢測的熒光信號圖。在圖1中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(A.U)，縱坐標(biāo)為側(cè)向散射強(qiáng)度(A.U)。圖2為圖1中陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的直方圖及熒光統(tǒng)計(jì)值。在圖2中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(A.U)，縱坐標(biāo)為統(tǒng)計(jì)數(shù)占最大統(tǒng)計(jì)數(shù)比例；曲線a為M13侵染后的細(xì)菌，曲線b為M13-TC侵染后的細(xì)菌。圖3為單價(jià)噬菌體侵染細(xì)菌用流式分析儀檢測的熒光信號圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(A.U)，縱坐標(biāo)為側(cè)向散射強(qiáng)度(A.U)。圖4為圖3中陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的直方圖及熒光統(tǒng)計(jì)值。在圖4中，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(A.U)，縱坐標(biāo)為統(tǒng)計(jì)數(shù)占最大統(tǒng)計(jì)數(shù)比例；曲線a為M13K07侵染后的細(xì)菌，曲線b為M13K07-TC侵染后的細(xì)菌。圖5為8種不同細(xì)菌用M13-TC侵染后的熒光信號值。在圖5中，橫坐標(biāo)為菌種，給坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(A.U);l為大腸桿菌E2738-空白對照，2為大腸桿圖E2738-陰性對照，3為大腸桿菌E2738,4為大腸桿菌K12，5為大腸桿菌BL21，6為遲鈍愛德華桿菌，7為溶壁微球菌，8為哈維氏弧菌，9為溶藻酸弧菌，10為副溶血弧菌。圖6為噬菌體侵染細(xì)菌的熒光顯微鏡圖陰性對照為用原噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本；實(shí)驗(yàn)組為用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(2001byColdSpringHarborLaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1多價(jià)噬菌體M13KE-TC的制備四半胱氨酸TC片段的制備設(shè)計(jì)兩條帶有Acc65I，EagI粘性末端的TCDNA互補(bǔ)序列并于生工合成。'(記為SEQIDNO.1);'(記為SEQIDNO.2)。分別取PI，P2以終濃度10M混合于TaqBuffer中，于PCR儀進(jìn)行退火反應(yīng)，設(shè)置程序如下95。C，2min;連續(xù)降至25。C，約60min;4。C保存。對7222bp的多價(jià)噬菌體M13KEDNA進(jìn)行Eag1、Acc65I雙酶切回收，雙酶切片段與退火的帶有EagI、Acc65I粘性末端的TCDNA片段連接后，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌TG1感受態(tài)中，鋪板培養(yǎng)，隨機(jī)調(diào)取單噬菌斑，擴(kuò)增，提取噬菌體ssDNA，寄往生工測序。陽性重組噬菌體測序結(jié)果如下所示，與理論M13KE-TCDNA序列完全匹配，其中s為理論序列的一部分，1為噬菌體ssDNA測序的一部分堿基序列。s1s1s1NO.3)s1上列理論序列的一部分核酸序列；下列陽性重組噬菌體ssDNA測序的一部分。實(shí)施例2單價(jià)噬菌體M13K07-TC的制備1、重組噬菌粒pCANTAB5E-TC構(gòu)建及鑒定設(shè)計(jì)兩條帶有NotI，SfiI粘性末端的TCDNA互補(bǔ)序列并于生工合成。P3:5—-CGGCCATTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTGC-3—(記為SEQIDP4:5-GGCCGCAGGCTCCATGCAGCAGCCGGGACAACAGTTCAGGAATGGCCGGCT-3(記為SEQIDNO.4)。分別取P3，P4以終濃度10M混合于TaqBuffer中，于PCR儀進(jìn)行退火反應(yīng)，設(shè)置程序如下95。C，2min;連續(xù)降至25。C，約60min;4。C保存。對5.3kb的噬菌粒DNApCANTAB5E進(jìn)行NotI，SfiI雙酶切，回收，雙酶切片段與退火的帶有NotI，SfiI粘性末端的TCDNA片段連接，構(gòu)建重組噬菌粒，按常規(guī)方法進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQIDNO.3所示的序列。S2S2S2S2S2上列理論序列的一部分核酸序列；下列陽性重組噬菌粒ssDNA測序的一部分。82、單價(jià)噬菌體M13K07-TC的獲取對以上重組噬菌粒pCANTAB5E-TC通過輔助噬菌體M13K07的補(bǔ)救，便得到了含有一個(gè)TC肽段的單價(jià)噬菌體M13K07-TC，具體步驟如下(1)取100L過夜培養(yǎng)含有重組噬菌粒pCANTAB5E-TC的大腸桿菌TG1菌液接種到10mL2xYT-AG(100g/mLAmp，2%Glucose)中，37°C，150rpm，培養(yǎng)1.5h;(2)加入1.2xl010pfu輔助噬菌體M13麗，37°C，250rpm，培養(yǎng)lh;(3)10000rpm室溫離心10min，去上清；(4)將細(xì)胞沉淀重新接種到10mL2xYT-AK(100mg/LAmp，25mg/LKanamycin)中，37。C，250rpm培養(yǎng)8h;(5)10000rpm室溫離心2min，保留上清液；(6)用PEG8000/NaCI，冰浴沉降30-60min，4°C，10000rpm離心20min，去上清，用2xYT重新溶解沉淀，fC保存，便得到單價(jià)噬菌體M13K07-TC。實(shí)施例3四半胱氨酸重組噬菌體對特異致病菌的侵染及雙砷染料染色挑取待檢菌E.coliTGl單菌落于2mL2XYT，37°C，250rpm過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的E.coliTGl菌液IOOL加入到10mL2XYT-G，37°C，250rpm搖至OD=0.6，各取2mL相應(yīng)菌液于培養(yǎng)管中，分別加入重組噬菌體及原噬菌體，37t:，250rpm，侵染lh。各取侵染液80uL，用100LHBSS洗兩次，最后加入HBSS，加入終濃度5yM的雙砷染料FlAsH-EDT2，孵育30min，離心棄上清，加入洗滌劑BAL，孵育15min，離心棄上清，重復(fù)洗滌一次，加入HBSS80uL重懸。這樣用原噬菌體侵染的細(xì)菌樣本為陰性對照組；用重組噬菌體侵染的細(xì)菌樣本為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)施例4含雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體的致病菌的快速檢測1、傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀檢測取實(shí)施例3中HBSS重懸液300L于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)條件如下488nm激發(fā)電壓400V;SSC:300V;FSC:300V;檢測個(gè)數(shù)10000。1)對于多價(jià)噬菌體，結(jié)果如圖1和2所示，圖1為多價(jià)噬菌體侵染細(xì)菌用流式分析儀檢測的熒光信號圖。在圖1中，圖A為陰性對照(用原噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本，即雙砷標(biāo)記M13侵染后的細(xì)菌)的散點(diǎn)圖；圖B為實(shí)驗(yàn)組(用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本，即雙砷標(biāo)記M13-TC侵染后的細(xì)菌)的散點(diǎn)圖。圖2為圖1中陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的直方圖。在圖2中，曲線a為M13KE侵染的細(xì)菌，曲線b為M13KE-TC侵染的細(xì)菌。陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的熒光統(tǒng)計(jì)值如表l所示。實(shí)驗(yàn)組的熒光峰明顯比陰性組向右偏移，即信號可以與背景相分離。表面該體系可適用于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀的對致病菌的快速檢測。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2)對于單價(jià)噬菌體結(jié)果如圖3和4所示，圖3為單價(jià)噬菌體侵染細(xì)菌用流式分析儀檢測的熒光信號圖。在圖3中，圖A為陰性對照(用原噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本，即雙砷標(biāo)記M13K07侵染后的細(xì)菌)的散點(diǎn)圖；圖B為實(shí)驗(yàn)組(用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細(xì)菌經(jīng)雙砷染料染色后的樣本，即雙砷標(biāo)記M13K07-TC侵染后的細(xì)菌)的散點(diǎn)圖。圖4為圖3中陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的直方圖。在圖4中，曲線a為M13K07侵染的細(xì)菌，曲線b為M13K07-TC侵染的細(xì)菌。陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的熒光統(tǒng)計(jì)值如表2所示。實(shí)驗(yàn)組的熒光峰明顯比陰性組向右偏移，即信號可以與背景相分離。表面該體系可適用于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀的對致病菌的快速檢測。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、熒光顯微鏡檢測取實(shí)施例3中HBSS重懸液20L于熒光顯微鏡下觀察，分別在明場和藍(lán)光激發(fā)下觀察，結(jié)果如圖6所示，在藍(lán)色激光照射下，實(shí)驗(yàn)組可以觀察到帶有熒光的細(xì)菌而陰性組無法看到，表明該體系可適用于熒光顯微鏡下對致病菌的快速檢測。實(shí)施例5雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌檢測的特異性考察分別取8種不同種類細(xì)菌E.coli2378;E.coliK12;E.coliBL21;Edwardiellatarda;M.Lysodeikticus;VibrioharveryiVibrioalginolyticus;Vibrioparahemolyticus(其中僅E.coli2378為重組噬菌體的宿主菌)單菌落于2mL2XYT，37°C，250rpm過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的各菌液IOOL加入到10mL2XYT-G，37°C，250rpm搖至0D=0.6，各取2mL相應(yīng)菌液于培養(yǎng)管中，分別加入重組噬菌體及原噬菌體，37t:，250rpm，侵染lh。各取侵染液80uL，用100LHBSS洗兩次，最后加入HBSS，加入終濃度5yM的雙砷染料FlAsH-EDT2，孵育30min，離心棄上清，加入洗滌劑BAL，孵育15min，離心棄上清，重復(fù)洗滌一次，加入HBSS80uL重懸。另外加入用原噬菌體侵染的細(xì)菌樣本為陰性對照組；用重組噬菌體侵染，不加入雙砷染料但經(jīng)歷同樣洗滌過程的細(xì)菌作為空白對照組。將以上樣本用流式分析儀進(jìn)行分析，取每一組的熒光值進(jìn)行比較，陰性對照和實(shí)驗(yàn)組的直方圖及熒光統(tǒng)計(jì)值如圖5所示；宿主菌E.coli2378的信號明顯高于其他任何其他細(xì)菌，因此雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌檢測具有很強(qiáng)的特異性。10權(quán)利要求致病菌的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)設(shè)計(jì)并合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；2)將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連于噬菌體衣殼蛋白的表達(dá)調(diào)控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；3)用步驟2)中的重組噬菌體侵染宿主細(xì)胞，并在其中繁殖，生成帶有表達(dá)四半胱氨酸重組噬菌體的重組細(xì)胞；4)在重組細(xì)胞中加入雙砷染料，經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合后，被重組噬菌體特異識別侵染的細(xì)菌，在激發(fā)光照射下可發(fā)出特異熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行特異性檢測。2.如權(quán)利要求l所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟l)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP。3.如權(quán)利要求l所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟l)中，所述編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指"TTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCT"。4.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所述可操作地連于，是指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性；如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。5.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所述可操作地連于，意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。6.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟3)中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，是步驟2)中所用噬菌體特異識別的待檢測細(xì)菌。7.如權(quán)利要求6所述的致病菌的檢測方法，其特征在于所述待檢測細(xì)菌為E.coliBLT5403;E.coliTGI;E.coli0157或salmonella。8.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟3)中，重組噬菌體侵染宿主細(xì)胞時(shí)，控制噬菌體和宿主細(xì)胞的比例小于1000:l，侵染繁殖時(shí)間為3090min。9.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟4)中，所述雙砷染料為FLAsH和ReAsH熒光物質(zhì)中的至少一種，其終濃度為110iiM，反應(yīng)時(shí)間為3090min，反應(yīng)溫度為室溫。10.如權(quán)利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟4)中，所述洗滌分別用BAL(3-羥基-1，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗至少1次；在經(jīng)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行特異性檢測前加入HBSS重懸。全文摘要致病菌的檢測方法，涉及一種病原微生物檢測方法。提供一種致病菌的檢測方法，該檢測方法利用基因改造的噬菌體簡單、快速、靈敏、特異地鑒別致病菌。設(shè)計(jì)并合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連于噬菌體衣殼蛋白的表達(dá)調(diào)控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；用重組噬菌體侵染宿主細(xì)胞，并在其中繁殖，生成帶有表達(dá)四半胱氨酸重組噬菌體的重組細(xì)胞；在重組細(xì)胞中加入雙砷染料，經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合后，被重組噬菌體特異識別侵染的細(xì)菌，在激發(fā)光照射下可發(fā)出特異熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行特異性檢測。文檔編號C12Q1/04GK101768625SQ20101011595公開日2010年7月7日申請日期2010年2月23日優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日發(fā)明者吳麗娜,潘建波,顏曉梅,黃婷婷申請人:廈門大學(xué)