專利名稱：用于指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療的基因組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組用于指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療 的基因組合。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶介導(dǎo)的細(xì)胞生長信號通路在癌癥的形成和 發(fā)展中起重要作用。EGFR在許多不同的實(shí)體瘤患者中過表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、 乳腺癌。卵巢癌、頭頸癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，常與預(yù)后不良。 放化療抗性、腫瘤血管形成和腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，已成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。近年來，許多 以此為靶點(diǎn)的新抗腫瘤藥物陸續(xù)被開發(fā)，在多種腫瘤治療中取得了令人鼓舞的療效。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特羅凱(Tarceva/厄羅替 尼/Erlotinib，羅氏制藥)作為表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，是美 國FDA批準(zhǔn)用于NSCLC靶向治療的主要藥物。但是，臨床試驗(yàn)表明易瑞沙和特羅凱僅對 10-30 %的NSCLC病人有顯著療效。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)EGFR酪氨酸激酶區(qū)基因突變是NSCLC 靶向治療藥物奏效的一個(gè)必要前提條件，而且絕大多數(shù)攜帶EGFR基因突變的病人療效顯 著。因此，檢測EGFR基因突變成為NSCLC病人是否接受靶向治療的重要依據(jù)。EGFR =EGFR與配體結(jié)合后激活酪氨酸激酶區(qū)，結(jié)合1個(gè)ATP分子，自身發(fā)生磷酸化 和轉(zhuǎn)磷酸化作用，使受體酪氨酸殘基磷酸化，然后將信號傳入細(xì)胞內(nèi)。EGFR不但能調(diào)節(jié)正常 細(xì)胞的增殖分化，而且在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、修復(fù)和轉(zhuǎn)移中也具有重要的作用。EGFR的突 變主要發(fā)生在外顯子18-21，其中19和21兩外顯子突變率可達(dá)到90%。19外顯子堿基缺 失主要發(fā)生在746-750位的氨基酸，這個(gè)位子是ATP結(jié)合的關(guān)鍵部位，突變改變了受體ATP 結(jié)合位點(diǎn)(ATP-binding pocket)的角度，明顯的增加了癌細(xì)胞對EGFR抑制劑如特羅凱和 易瑞沙的敏感性。21外顯子點(diǎn)突變表現(xiàn)為858位密碼子的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?L858R)， 此突變位點(diǎn)緊鄰激酶活化環(huán)中高度保守的Dre序列附近，使活化環(huán)的穩(wěn)定性提高，也明顯 增強(qiáng)癌細(xì)胞對EGFR抑制劑的敏感性。美國FDA批準(zhǔn)對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI 治療的病人，進(jìn)行EGFR基因突變檢測。Kras :ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種H-ras、K_ras和N_ras，分別定 位在11、12和1號染色體上。其中，K-ras對人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)，當(dāng)正常 時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞自我毀滅。Kras突變基因檢測能確定是否適合進(jìn)行表皮生長因子受體抑制劑這類藥物的個(gè) 體化治療，通常情況下，60%左右的結(jié)直腸癌病人的K-ras基因都是野生型的，這樣在化療 基礎(chǔ)上加上表皮生長因子受體抑制劑，如愛必妥，有效率可以達(dá)到60%左右，延長病人生 命。而突變型的病人則不適合進(jìn)行單抗藥物的治療。K-ras基因突變的最常見的方式是點(diǎn) 突變，多發(fā)生在N端第12、13和61密碼子，其中又以第12密碼子突變最常見，而且多為GGT 突變成GTT。Kras基因突變檢測已被美國癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項(xiàng)目。藥物代謝和效應(yīng)的個(gè)體化差異臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效，對病人乙 可能不起作用，對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應(yīng)差異很 大。因此，在對腫瘤病人進(jìn)行化療時(shí)，如果先對其相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，再根據(jù)其基因突 變情況進(jìn)行治療，就可以對病人實(shí)施個(gè)體優(yōu)化治療。因此，通過檢測病人腫瘤組織中的EGFR-Exon 19，EGFR_Exon21，Kras_codon 12/13， Kras-codon61基因位點(diǎn)的突變情況，對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的病人進(jìn)行 藥物敏感指導(dǎo)，可以使療效達(dá)到最大，副作用降到最低?，F(xiàn)有臨床用藥方法的缺陷在很多疾病的治療過程中，常發(fā)生用藥不當(dāng)而導(dǎo)致副 作用或因劑量不足無法達(dá)到治療目的。因此針對這些病患的基因型進(jìn)行個(gè)體化用藥具有特 別重要的意義。以前，醫(yī)生如果需要調(diào)整病人的用藥，需要長時(shí)間觀察，病人也需要做大量 的檢測。這種調(diào)整用藥的過程程序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，延誤治病時(shí)機(jī)。本發(fā)明的有益之處是(1)本發(fā)明的篩選方法是一種對人體無害的檢測方法； (2)本發(fā)明通過檢測病人腫瘤組織中的EGFR-Exonl9，EGFR_Exon21，Kras_codonl2/13， Kras-codon61基因位點(diǎn)的突變情況，對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的病人進(jìn)行 藥物敏感指導(dǎo)，可以使療效達(dá)到最大，副作用降到最低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前腫瘤的治療過程中，易瑞沙、特羅凱類藥 物的療效在不同病人間的明顯差異，提供一種方便、快捷的輔助臨床醫(yī)生制定個(gè)體化用藥 方案的基因組合及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的目的是提供一組用于指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療的基因組 合，包括:EGFR-Exonl9, EGFR_Exon21, Kras_codonl2/13, Kras_codon61 基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該基因組合在指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療 中的應(yīng)用?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案針對上述基因的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，各基因引物序列如表1所示。表權(quán)利要求
1.一組用于指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療的基因組合，其特征在于該基因組 合包含 EGFR-Exon 19, EGFR_Exon21，Kras-codonl2/13, Kras-codon61 基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組合，其特征在于針對EGFR-EXonl9位點(diǎn)設(shè) 計(jì)的正向引物序列為TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTG (SEQ ID No. 1)，反向引物序列為 GTGGAGATGAGCAGGGTCTA (SEQ ID No. 2)；針對 EGFR_Exon21 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的正向引物序列 為 TCTTCTCTGTTTCAGGGCA (SEQ ID No. 3)，反向引物序列為 ACAATACAGCTAGTGGGAAGG (SEQ ID No. 4)；針對 Kras-codonl2/13 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的正向引物序列為 ACTGGTGGAGTATTTGA(SEQ ID No. 5)，反向引物序列為 AAGATTTACCTCTATTGTTG (SEQ ID No. 6)；針對 Kras-codon61 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的正向引物序列為TTCTCCCTTCTCAGGATTC (SEQ ID No. 7)，反向引物序列為 TTACTCCTTAATGTCAGCTTAT(SEQ ID No. 8)。
3.如權(quán)利要求2所述的引物序列在檢測其相應(yīng)的基因突變中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于檢測方法如下(1)提取病人腫瘤組織基因組DNA；(2)以待測腫瘤組織基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析；(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中PCR反應(yīng)體系每20μ 1組成 如下待測病人腫瘤組織基因組DNA 50 100ng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中用于檢測EGFR-EXonl9的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，進(jìn) 行45個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中用于檢測EGFR-EXOn2IWPCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，進(jìn) 行45個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中用于檢測KraS-C0d0nl2/13 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C變性2min,隨后95°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸 Imin，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中用于檢測Kras-codonei 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C變性2min,隨后95°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸 Imin，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(4)中測序PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件 為95°C預(yù)變4min，隨后95°C變性30sec，50°C退火15sec，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后60°C延伸 4min，4°C 保存。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，提供一組用于指導(dǎo)易瑞沙、特羅凱類藥物個(gè)體化治療的基因組合，包括EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61。本發(fā)明通過檢測病人腫瘤組織中的EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因位點(diǎn)的突變情況，對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的病人進(jìn)行藥物敏感指導(dǎo)，以使療效達(dá)到最大，副作用降到最低。
文檔編號C12N15/11GK102146434SQ20101010738
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者徐玲麗, 樓敬偉, 黃慧 申請人:上海寶藤生物醫(yī)藥科技有限公司