使用隨溫度而變的雜交對核酸序列進(jìn)行鑒定與區(qū)分的制作方法

專利名稱：使用隨溫度而變的雜交對核酸序列進(jìn)行鑒定與區(qū)分的制作方法
使用隨溫度而變的雜交對核酸序列進(jìn)行鑒定與區(qū)分相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明要求2008年12月10日遞交的申請?zhí)枮?1/193，609的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)，它的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增技術(shù)用于產(chǎn)生單鏈的核酸產(chǎn)物。對這些擴(kuò)增產(chǎn)物的典型檢測需要一個(gè)探針，其用擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物(“靶序列”)來識別特異的核酸序列。這種檢測經(jīng)常通過使用寡核苷酸探針來進(jìn)行，其在嚴(yán)格的條件下與特異性靶核酸序列雜交，允許檢測該特異性靶序列。在現(xiàn)有技術(shù)中，通常大約5°C的條件是眾所周知的嚴(yán)格的雜交條件，其低于特異性序列在確定的離子強(qiáng)度和PH值下的熱熔點(diǎn)(Tm)。所述熱熔點(diǎn)是使50%的堿基對分離的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH值下)。盡管條件隨序列變化，典型的嚴(yán)格的條件為鹽濃度至少約為1. 5至6. OmM，其pH值為7. O至8. 3，溫度范圍為40°C至72。C。當(dāng)使用序列特異性探針時(shí)，每個(gè)靶核酸序列一般需要一個(gè)具有用來區(qū)別每個(gè)靶序列的不同報(bào)告標(biāo)記的不同探針。使用具有不同靶序列和報(bào)告標(biāo)記的多個(gè)探針可能增加費(fèi)用，并導(dǎo)致復(fù)雜的探針內(nèi)相互作用。發(fā)明概述因此，在本領(lǐng)域中需要一種能夠以隨溫度而變的方式鑒定大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸探針。為了解決這些問題和滿足其他需要，本發(fā)明提供了能夠以隨溫度而變的方式與不同核酸靶序列雜交的寡核苷酸探針，其允許用相同的探針檢測一個(gè)以上的核酸序列。一個(gè)實(shí)施例提供了用于檢測靶核酸序列的寡核苷酸探針，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并在第二溫度下與第二核酸序列雜交。另一個(gè)實(shí)施例提供了一種檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述方法包括(a) 使寡核苷酸探針在第一溫度下與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸(b)改變溫度以獲得第二溫度，然后(c)檢測該探針是否在第一溫度、第二溫度或兩種溫度下與靶核酸序列雜交，其中，第一溫度可能與第一靶核酸序列相關(guān)，并且第二溫度可能與第二組核酸序列相關(guān)。另一個(gè)實(shí)施例提供了至少兩個(gè)用來檢測兩個(gè)靶核酸序列的寡核苷酸探針。其中， 每個(gè)寡核苷酸探針具有一個(gè)具有相同或相似檢測特征的報(bào)告分子，比如，例如相同的報(bào)告分子，但是所述探針被設(shè)計(jì)在不同溫度下雜交。一個(gè)寡核苷酸探針可在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，第二探針可在第二溫度下與第二靶核酸序列雜交?？稍诿總€(gè)探針分別對應(yīng)的溫度下，通過增加報(bào)告分子信號來測定兩種雜交情況的分化。另一個(gè)實(shí)施例提供了一種使用兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針來檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探針標(biāo)有相似或相同檢測特征的報(bào)告分子，比如，例如相同的報(bào)告分子，但是所述探針被設(shè)計(jì)成在不同溫度下與它們各自的靶核酸序列雜交。所述方法包括(a)在第一溫度下使具有報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸； (b)改變溫度以獲得第二溫度；然后(C)在第二溫度下測定具有相同的報(bào)告標(biāo)記的第二探針是否與其靶核酸序列雜交，其中，在第一溫度下的信號可能與第一靶核酸序列相關(guān)，而且第二溫度下的信號可能與第二核酸序列相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施例中，可以使用額外的具有報(bào)告標(biāo)記的探針，并且每個(gè)探針能夠在確定的溫度下與一個(gè)靶核酸序列雜交。一個(gè)實(shí)施例提供了一種試劑盒，其包括擴(kuò)增試劑混合物和至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物包含至少一對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物，其中，寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，在第二溫度下與第二核酸序列雜交。另一個(gè)實(shí)施例提供了一種試劑盒，其包括擴(kuò)增試劑混合物和至少兩個(gè)寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物包含至少一對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物。所述探針每個(gè)都具有一個(gè)具有相似或相同檢測特征的報(bào)告標(biāo)記，包括，例如，相同的報(bào)告標(biāo)記，其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，第二探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交。所述至少兩個(gè)寡核苷酸探針可增加到兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、十個(gè)、或十一個(gè)以上、十二個(gè)、十五個(gè)或二十個(gè)探針。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種探針，其包括用于檢測靶核酸序列的寡核苷酸探針，其中，寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，在第二溫度下與第二核酸序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述方法包括a.在第一溫度下使一個(gè)寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；b.改變溫度以獲得第二溫度；以及c.在第一溫度、第二溫度或兩種溫度條件下確定該探針是否與靶核酸序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種如上和/或如下所述的方法。其中，第一溫度與第一靶核酸序列相關(guān)，而且第二溫度與第二靶核酸序列相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種如上和/或如下所述的方法。其中，第一溫度與第一靶核酸序列是可相關(guān)的，第二溫度與第二靶核酸序列是可相關(guān)的。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種試劑盒，其包括一種擴(kuò)增試劑混合物和至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有一對或多對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，在第二溫度下與第二核酸序列雜交。 在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種包括至少兩個(gè)寡核苷酸探針的組合物。其中，所述寡核苷酸探針具有相同和/或相似檢測特征的報(bào)告標(biāo)記，其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，第二探針在第二溫度下與第二靶核酸序列雜交。其中，在第一溫度下檢測第一靶核酸序列，在第二溫度下檢測第二靶核酸序列，其中，在第一溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在第一靶核酸序列，在第二溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在第二靶核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種使用兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針來檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探針用一個(gè)報(bào)告分子標(biāo)記，其具有至少一項(xiàng)下列相同和相似的檢測特征(i)在第一溫度下使一個(gè)具有報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；
(ii)改變溫度以獲得第二溫度；(iii)在第二溫度下，確定具有報(bào)告標(biāo)記的第二探針是否與靶核酸序列雜交。在如上和/或如下公開的另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種方法。其中，在第一溫度下的信號與第一靶核酸序列是可相關(guān)的，在第二溫度下的信號與第二組靶核酸序列是可相關(guān)的。在如上和/或如下公開的另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種方法，其中，在第一溫度下的信號與第一靶核酸序列相關(guān)，在第二溫度下的信號與第二靶核酸序列相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種試劑盒，其包括一種擴(kuò)增試劑混合物和至少兩個(gè)都具有相同或相似檢測特征的報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有至少一對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物。其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，第二探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交。通過下文的詳細(xì)描述對如上所述和其他特征進(jìn)行說明。發(fā)明詳述一種能夠以隨溫度而變的方式與不同的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針(“耐錯(cuò)配探針”或“隨溫度而變的探針”)是十分有用的。通過在不同溫度下使用耐錯(cuò)配探針并測定探針的雜交來確定由靶擴(kuò)增序列的先驗(yàn)認(rèn)識得知的特異性靶序列的存在。隨溫度而變的探針可具有對靶核酸序列的多重檢測、鑒定及識別等優(yōu)點(diǎn)。然而，除非另有說明，所有使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都遵循常規(guī)技術(shù)使用方法。一般的，這種描述的術(shù)語和所述的實(shí)驗(yàn)程序，分別在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及雜交領(lǐng)域眾所周知，并且在本領(lǐng)域普遍應(yīng)用。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)應(yīng)用于重組核酸方法、寡核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析及藥劑配方及遞送。一般的，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行酶反應(yīng)和純化和/或隔離步驟。在沒有相反指示的情況下，根據(jù)傳統(tǒng)方法，比如，Sambrook 等人發(fā)表的 MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2ded. (Cold Spring Harbor Laboratory Press，198 和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, 1989)，進(jìn)行所述技術(shù)操作和程序。“序列同源性”具有一個(gè)業(yè)內(nèi)認(rèn)可的含義，并且可使用公開的技術(shù)來計(jì)算。參見 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press，1988)、 BI0C0MPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press，1993)、 COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I， GrifTin&Griffin， eds. ， (Humana Press，1994)、SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed.，Academic Press(1987),SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,Gribskov&Devereux,eds. (Macmillan Stockton Press, 1991)和 Carillo&Lipton，SIAM J. Applied Math. 48 :1073(1988)。普遍用于測定兩個(gè)序列之間的同源性或相似性的方法包括但并不限于⑶IDE TO HUGE COMPUTERS,Bishop, ed.，(Academic Press, 1994)和如上所述的Carillo&Lipton中公開的那些方法。測定同源性或相似性的方法被編入計(jì)算機(jī)程序中。測定兩個(gè)序列的同源性或相似性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括但并不限于GCG程序組(Devereuxden等人，Nucleic Acids Research 12 :387(1984)), BLASTP，BLASTN, FASTA (Atschul 等人，J. MoI. Biol. 215 :403(1990))和 FASTDB (Brutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6 :237 (1990))。一個(gè)實(shí)施例提供了一種寡核苷酸探針，其用于核酸擴(kuò)增并能夠檢測和識別具有核苷酸序列變化的靶核酸的檢測試驗(yàn)。這些寡核苷酸探針可以是耐錯(cuò)配探針，并且可與一個(gè)以上的靶核酸序列以隨溫度而變的方式雜交。第二個(gè)實(shí)施例涉及設(shè)計(jì)成不同的探針，其在不同溫度下與特異的靶序列雜交。該實(shí)施例可被認(rèn)為是通過雜交溫度的復(fù)用。如本文所使用的，寡核苷酸是普通的，并且可包括多脫氧核糖核苷酸、多核糖核苷酸和任何一種多聚核苷酸。所述多聚核苷酸是嘌呤或嘧啶堿基，或者修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷，包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。寡核苷酸的引物和探針能夠與靶核酸序列雜交?！半s交”是指通過互補(bǔ)堿基對使兩條單鏈核酸構(gòu)成一個(gè)雙鏈體結(jié)構(gòu)。雜交可發(fā)生在互補(bǔ)核酸鏈之間或發(fā)生在包含錯(cuò)配的小區(qū)域的核酸鏈之間。完全互補(bǔ)的核酸鏈雜交的條件被稱為“嚴(yán)格的雜交條件”。除錯(cuò)配的小區(qū)域之外互補(bǔ)的兩條單鏈核酸被稱為“大體互補(bǔ)”。大體互補(bǔ)序列的穩(wěn)定的雙鏈體可在不太嚴(yán)格的雜交條件下獲得。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過測算變量數(shù)，包括，比如寡核苷酸長度和組成、離子強(qiáng)度和發(fā)生率以及錯(cuò)配的堿基對類型，來經(jīng)驗(yàn)性地確定雙鏈體的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)隨溫度而變的探針與兩個(gè)或多個(gè)靶核酸雜交。所述靶核酸的一個(gè)與另一個(gè)具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同源性?？赏ㄟ^使擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物與耐錯(cuò)配和/或隨溫度而變的探針接觸和檢測雜交雙鏈的結(jié)構(gòu)來檢測和鑒定擴(kuò)增的靶核酸序列。雜交可在不同溫度條件下發(fā)生。比如，雜交可在10°C至90°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，擴(kuò)增一個(gè)樣品內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，在第一溫度下觀察雜交情況，然后在不同于第一溫度的一個(gè)以上的溫度下觀察雜交情況。使用在不同溫度下不同的靶序列會雜交的先驗(yàn)知識，可確定存在哪個(gè)靶核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，在檢測和鑒定步驟過程中升溫或降溫。寡核苷酸探針可用于檢測來自任何生物學(xué)樣品的靶核酸。 生物學(xué)樣品可包括，例如，真核的、原核的或病毒源的生物材料。細(xì)菌可以是革蘭氏陰性、革蘭氏陽性細(xì)菌或古生菌。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，例如但不限于弧菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬、賽氏桿菌屬、摩拉克氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、包特菌屬、加德納氏菌屬、嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、布魯氏菌屬、耶爾森氏菌屬、巴氏菌屬、類菌體和螺桿菌屬。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，比如但不限于芽胞桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、節(jié)桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、李斯特菌屬、棒狀桿菌、動性球菌屬、分枝桿菌屬、諾卡菌屬、紅球菌屬和抗酸桿菌如分枝桿菌屬。古生菌包括，比如但不限于產(chǎn)甲烷菌、嗜鹽菌、嗜熱菌、嗜冷菌、嗜泉古菌界、 廣域古菌界和初生古菌界。在一個(gè)實(shí)施例中，納米乳組合物可用于使芽孢桿菌失去活性。所述芽孢桿菌包括但不限于炭疽桿菌、蠟狀芽孢桿菌、二環(huán)狀、枯草桿菌和巨大芽孢桿菌。納米乳的成分也可用于使梭狀芽胞桿菌屬失去活性。所述梭狀芽胞桿菌屬比如肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和破傷風(fēng)梭菌。其他可用納米乳失活的細(xì)菌包括但不限于流感嗜血桿菌、淋球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌和霍亂弧菌(典型的和愛爾托型)，和耶爾森氏菌屬，包括鼠疫菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森氏菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌是炭疽桿菌。在另一實(shí)施例中，細(xì)菌是類結(jié)核分支桿菌結(jié)核病?？捎媚湾e(cuò)配探針檢測的病毒包括但不限于，桿狀病毒科、皰疹病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、“非洲豬瘟病毒”、腺病毒科、花椰菜花葉病毒科、肌病毒科、藻類去氧核糖核
6酸病毒科、蓋病毒科、乳多空病毒科、環(huán)病毒科、微小病毒科、肝脫氧核糖核酸病毒科、囊病毒科、雙股雙節(jié)RNA病毒科、呼腸孤病毒科、日冠狀病毒科、黃病毒科、披膜病毒科、“動脈炎病毒屬”、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核糖核酸病毒科、馬鈴薯Y病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、纖絲病毒科、副粘病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科和本揚(yáng)病毒科家族中的任何一種。在一個(gè)實(shí)施例中，病毒是皰疹病毒、水痘病毒、乳頭瘤病毒、冠病毒、流行性感冒病毒、 肝炎病毒、仙臺病毒、新必斯病毒和牛痘病毒、西尼羅熱病毒、漢他病毒、以及引發(fā)普通感冒的病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，探針檢測到柯薩基病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，真菌是一種酵母菌，就像例如很多種類的念珠菌屬(比如白色念珠菌)或絲狀酵母菌。所述絲狀酵母菌包括但不限于曲霉屬真菌種或皮膚真菌，比如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、絮狀表皮蘚菌及以上和其他類型。另一些實(shí)施例包括真核生物體。所述真核生物體包括但不限于原生動物、藻類、植物和動物核酸。寡核苷酸可以成為任何適當(dāng)尺寸，這取決于包括寡核苷酸的功能或用途等很多因素。寡核苷酸可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行制備。所述適當(dāng)?shù)姆椒ò?，比如，克隆、較大核苷酸的限制酶切、以及通過以下方法直接化學(xué)合成例如Narang等人在Meth. Enzymol. 68 90-9(1979)中發(fā)表的磷酸三酯方法、Brown等人在Meth. Enzymol. 68 :109-51(1979)中發(fā)表的磷酸二酯方法、Beaucage等人在^Tetrahedron Lett. 22 :1859-62(1981)中發(fā)表的二乙基亞磷酰胺的方法以及美國專利號4，458，066中公開的載體方法。對合成方法的復(fù)驗(yàn)在 Goodchild, Bioconjugate Chemistryl :165-87 (1990)中發(fā)表?？稍谝环N試劑盒中提供耐錯(cuò)配探針和/或隨溫度而變的探針。該試劑盒可包括一些或所有必要的試劑。該試劑盒可包括一對單獨(dú)的引物或一組或多組引物，和一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針。術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，不論天然的或合成的，其能夠作為DNA合成的起點(diǎn)，在誘發(fā)互補(bǔ)于一條核酸鏈的一個(gè)引物延伸產(chǎn)品的合成的條件下發(fā)揮作用。比如，這種條件包括在適當(dāng)?shù)臏囟认?，在適當(dāng)?shù)木彌_液內(nèi)的四種不同核苷三磷酸與用于聚合的試劑的摻雜物(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)。引物可以是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的長度可變， 并且取決于引物的用途。在一個(gè)實(shí)施例中，引物具有6至40個(gè)核苷酸。引物不需要反映模板的準(zhǔn)確序列，但應(yīng)該足以與模板雜交互補(bǔ)。引物可包含額外的特征，允許其進(jìn)行引物的檢測或固定，但不改變引物作為DNA合成的起點(diǎn)發(fā)揮作用的基本能力。寡核苷酸弓I物和探針可在一種擴(kuò)增混合物內(nèi)使用。術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)混合物，，是指用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的適當(dāng)試劑的組合。典型的反應(yīng)混合物由在適當(dāng)?shù)木彌_液內(nèi)的寡核苷酸引物、三磷酸核苷酸(dNTP)和核酸加工處理酶組成。所述核酸加工處理酶比如，例如耐高溫的聚合酶、解旋酶、RNA聚合酶或連接酶。適當(dāng)?shù)木酆厦溉缭诿绹鴮＠?，889，818 中所描述的?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)慕庑负蚏NA聚合酶，而且很多這種酶都在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。適當(dāng)?shù)慕庑负蚏NA聚合酶如在歐洲專利號06四706和美國專利號56M142 中所描述的?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒▽U(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測。比如，在一個(gè)實(shí)施例中，可使用像 YO-PROYo Yo 和STOR 染料這樣的無序列特異性的檢測系統(tǒng)對雙鏈的DNA進(jìn)行檢測。與單鏈的DNA相比，所述染料在與雙鏈的DNA結(jié)合時(shí)會發(fā)出更多的熒光。在另一個(gè)實(shí)施例中，可使用一種特異于核酸區(qū)域的寡核苷酸探針，即“雜交探針”。 存在很多不同的雜交探針，然而，使用雜交探針的方法的主要特點(diǎn)是通過檢測寡核苷酸探針與擴(kuò)增的靶DNA或RNA雜交識別樣品內(nèi)存在的核酸。用于核酸雜交技術(shù)的探針能夠通過一種或多種類型的化學(xué)鍵與互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合，通常是通過氫鍵的形成產(chǎn)生的互補(bǔ)堿基對相結(jié)合。探針可包括天然堿基(即A、G、 U、C或Τ)或修正的堿基(7-脫氮鳥嘌呤核苷、肌苷等)。此外，只要核酸不干擾雜交，可通過一個(gè)非磷酸二酯鍵連接。因此，探針可以是肽核酸，其中組成的堿基可通過非磷酸鍵的肽鍵連接。寡核苷酸探針可通過現(xiàn)有技術(shù)中的任何方法制備。探針優(yōu)選地至少具有6、12、14、 16、18、20、22、24、30 或 40 個(gè)核苷酸。寡核苷酸探針可以隨意地與分子結(jié)合，其允許探針檢測或固定，但不改變探針的雜交特性?，F(xiàn)有技術(shù)中的一種方法認(rèn)為，通常一個(gè)寡核苷酸探針的補(bǔ)體也適于作探針。與確定的靶核酸互補(bǔ)的探針可被化學(xué)合成，使用限制酶從較長的核苷酸中生成； 或可通過使用如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的技術(shù)獲得。例如，使用放射性的、生物素?；幕驘晒獾臉?biāo)簽對探針進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，序列特異性的探針可采用兩種熒光染料之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)作為檢測方法。序列特異性的寡核苷酸探針可使用已知的標(biāo)記化學(xué)知識，用如熒光素、羅丹明和花青染料進(jìn)行標(biāo)記。受體染料，像DABCYL或甲基紅，可作為受體(或淬滅劑) 染料使用。在還一個(gè)實(shí)施例中，分子信標(biāo)、具有發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針和位于第5'端和3'端的供體-受體對可從使探針與擴(kuò)增的核酸區(qū)域結(jié)合的互補(bǔ)序列中生成。參見，比如 Tyagi 和 Kramer 發(fā)表的 Nat. Biotechnol. 14 :303-8(1996)，和 Tyagi 等人發(fā)表的 Nat. Biotechnol. 18 :1191-6(2000)。在另一個(gè)實(shí)施例中，如Lee等人發(fā)表的Anal. ChLn. Acta 457 =61-70(2002)中所述的寡核苷酸探針，可用于檢測擴(kuò)增的核酸區(qū)域?，F(xiàn)有技術(shù)中的一種方法認(rèn)為，使用不同檢測分析的標(biāo)簽或固定方法在條件和/或探針序列中可要求細(xì)節(jié)優(yōu)化。特定應(yīng)用將決定使用哪種探針。擴(kuò)增反應(yīng)還包括對靶核酸的存在進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證的內(nèi)部對照。可使用任何適當(dāng)?shù)膬?nèi)部對照。通過使用內(nèi)部對照進(jìn)行雙鏈擴(kuò)增，并且監(jiān)測靶核酸和內(nèi)部對照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)還包括特異于其他目的核酸的產(chǎn)物和探針。比如，可重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)用來擴(kuò)增和檢測與其他生物學(xué)上的危害相關(guān)的基因?？赏ㄟ^任何適當(dāng)方法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，比如終端測定方法。寡核苷酸可以包含在一個(gè)系統(tǒng)中的試劑形式提供，比如預(yù)包裝的消耗品。比如，消耗品可以一種材料帶狀物形式存在，所述帶狀物具有過濾器，以捕捉如核酸這樣的生物顆粒。這種帶狀物還可包含其他試劑，以對靶核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增和/或檢測。過濾器和試劑可在材料帶狀物上處理掉并縱向延伸。在另一個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸可包含在一個(gè)緩沖容器外殼內(nèi)，與一個(gè)活塞外殼以可移動的方式相連。使用這種裝置，用與活塞一端相連的一個(gè)拭子采集標(biāo)本樣品進(jìn)行分析，以用于生物戰(zhàn)試劑，比如蓖麻毒素。將拭子和活塞一并插入活塞外殼中，將緩沖容器置于緩沖容器外殼中，并將緩沖容器外殼與活塞外殼相連。讓緩沖液流過拭子洗脫樣品，并且使樣品與試劑混合。通過抖動將制備的樣品轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中?？蓪⒁粋€(gè)或多個(gè)耐錯(cuò)配和隨溫度而變的探針作為試劑盒的一部分提供。一個(gè)試劑盒可包括一種含有一對或多對引物的擴(kuò)增試劑混合物，所述引物用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列。在一些例子中，可在適當(dāng)?shù)闹文ど咸峁┕押塑账崽结樅?或引物，比如微孔板， 或?qū)⑵湓谙钠啡萜?、殼管或帶狀物上凍干。一個(gè)試劑盒的其他可選組成部分包括，比如， 一種用于催化引物延伸產(chǎn)物的合成的試劑、底物核苷三磷酸、用于擴(kuò)增和雜交反應(yīng)的適當(dāng)?shù)木彌_液操作檢測方法的說明書。耐錯(cuò)配和/或隨溫度而變的探針可用于檢測來自微生物、植物和動物的遺傳物質(zhì)，所述微生物包括病原微生物。一種病原微生物可以是但不限于一種細(xì)菌、一種病毒、一種真菌、一種原生動物或組合物。在一個(gè)典型實(shí)施例中，示出了一種用于檢測一個(gè)靶核酸序列的寡核苷酸探針，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并在第二溫度下與第二核酸序列雜交。在另一個(gè)典型實(shí)施例中，示出了一種檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述方法包括a.在第一溫度下使一個(gè)寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；b.改變溫度以獲得第二溫度；以及c.在第一溫度、第二溫度或兩種溫度下，確定該探針是否與靶核酸序列雜交，其中，第一溫度與第一靶核酸序列相關(guān)，而且第二溫度與第二核酸序列相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種試劑盒，其包括一種擴(kuò)增試劑混合物和至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有一對或多對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并在第二溫度下與第二核酸序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種包括至少兩個(gè)寡核苷酸探針的混合物。其中，所述寡核苷酸探針具有一個(gè)具有相同或相似檢測特性的報(bào)告標(biāo)記；其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，第二寡核苷酸探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交； 其中，在第一溫度下對第一靶核酸序列進(jìn)行檢測，在第二溫度下對第二靶核酸序列進(jìn)行檢測；其中在第一溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在第一靶核酸序列，在第二溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在第二靶核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種使用兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針以檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探針用具有相同或相似檢測特性的報(bào)告分子標(biāo)記，其檢測特性包括(i)在第一溫度下使具有報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；(ii)改變溫度以獲得第二溫度；(iii)在第二溫度下，確定具有報(bào)告標(biāo)記的第二探針是否與靶核酸序列雜交。其中，在第一溫度下的信號與第一靶核酸序列相關(guān)，而且在第二溫度下的信號與第二靶核酸序列相關(guān)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，示出了一種試劑盒，其包括一種擴(kuò)增試劑混合物和至少兩個(gè)都具有相同或相似檢測特征的報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有至少一對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物，其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一靶核酸序列雜交，第二探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交如本發(fā)明所公開的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在本發(fā)明的范圍和主旨內(nèi)還有其他實(shí)施例和改進(jìn)形式?；诖耍绢I(lǐng)域技術(shù)人員從在本發(fā)明范圍和主旨內(nèi)的公開中可獲得的所有改進(jìn)形式都將作為本發(fā)明的其他實(shí)施例包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種探針，其包括用于檢測靶核酸序列的寡核苷酸探針，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并且在第二溫度下與第二核酸序列雜交。
2.一種檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法，所述方法包括a.在第一溫度下使寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；b.改變所述溫度以獲得第二溫度；以及c.在所述第一溫度、所述第二溫度或兩種溫度下，確定該探針是否與靶核酸序列雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述第一溫度與第一靶核酸序列相關(guān)，并且所述第二溫度與第二靶核酸序列相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述第一溫度與第一靶核酸序列是可相關(guān)的，并且所述第二溫度與第二靶核酸序列是可相關(guān)的。
5.一種試劑盒，其包括擴(kuò)增試劑混合物和至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有一對或多對用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并且在第二溫度下與第二核酸序列雜交。
6.一種組合物，其包括至少兩個(gè)寡核苷酸探針，其中，所述寡核苷酸探針具有一個(gè)具有相同和/或相似檢測特性的報(bào)告標(biāo)記；其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并且第二寡核苷酸探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交；其中，在所述第一溫度下對所述第一個(gè)靶核酸序列進(jìn)行檢測，并且在所述第二溫度下對所述第二靶核酸序列進(jìn)行檢測；以及其中，在所述第一溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在所述第一靶核酸序列， 并且在所述第二溫度下對報(bào)告標(biāo)記的檢測表明了存在所述第二靶核酸序列。
7.一種使用兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針檢測兩個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的方法，所述寡核苷酸探針用報(bào)告分子標(biāo)記，其具有至少一項(xiàng)下列相同和相似的檢測特征(i)在第一溫度下使具有報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針與一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列接觸；( )改變所述溫度以獲得第二溫度；(iii)在所述第二溫度下，確定具有所述報(bào)告標(biāo)記的第二探針是否與靶核酸序列雜交。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在所述第一溫度下的信號與所述第一靶核酸序列是可相關(guān)的，并且在第二溫度下的信號與第二靶核酸序列是可相關(guān)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括使在所述第一溫度下的信號與所述第一靶核酸序列相關(guān)，并且使在所述第二溫度下的信號與所述第二靶核酸序列相關(guān)。
10.一種試劑盒，其包括擴(kuò)增試劑混合物和至少兩個(gè)都具有相同或相似檢測特征的報(bào)告標(biāo)記的寡核苷酸探針，所述擴(kuò)增試劑混合物含有至少一對引物用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，其中，第一寡核苷酸探針在第一溫度下與第一核酸序列雜交，并且第二寡核苷酸探針在第二溫度下與第二核酸序列雜交。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種寡核苷酸探針，其能夠以隨溫度而變的方式與不同的靶核酸序列雜交，允許用相同的探針或具有相同或相似檢測特性的報(bào)告標(biāo)記的不同探針對一個(gè)以上的靶核酸序列進(jìn)行檢測。本發(fā)明還提供了一種方法，通過使用一種能夠以隨溫度而變的方式與序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸探針，或使用具有相同或相似檢測特性的報(bào)告標(biāo)記的不同探針，對靶核酸序列進(jìn)行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102301007SQ200980156022
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者H·A·格羅里基安, J·W·查卡 申請人:史密斯探測公司