多組分過(guò)酸生成系統(tǒng)的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：多組分過(guò)酸生成系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶催化法過(guò)氧羧酸合成以及原位酶催化領(lǐng)域。具體地講，提供了一種多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)以用于在混合第一隔室的組分與第二隔室的組分后通過(guò)酶催化法制備過(guò)氧羧酸的水溶液。針對(duì)以下用途，能以足夠有效的濃度制備至少一種過(guò)氧羧酸表面消毒或衛(wèi)生處理、醫(yī)療器械滅菌、食品加工設(shè)備滅菌，以及適用于衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用如漂白、脫色、除臭和滅菌。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，過(guò)氧羧酸組合物是有效的抗微生物劑。針對(duì)不希望有的微生物生長(zhǎng)， 對(duì)硬質(zhì)表面、肉制品、活植物組織、和醫(yī)療設(shè)備進(jìn)行清潔、消毒、和/或衛(wèi)生處理的方法已有所描述(如美國(guó)專(zhuān)利6，545, 047、美國(guó)專(zhuān)利6，183，807、美國(guó)專(zhuān)利6，518，307、美國(guó)專(zhuān)利5，683，724、和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2003/0(^6846)。過(guò)氧羧酸可用于制備衣物洗滌劑所用的漂白組合物也有所報(bào)道(如美國(guó)專(zhuān)利3，974，082、美國(guó)專(zhuān)利5，296, 161和美國(guó)專(zhuān)利 5，364，554)。過(guò)氧羧酸可通過(guò)羧酸與過(guò)氧化氫的化學(xué)反應(yīng)制備(參見(jiàn)Organic Peroxides, Daniel Swern 編輯，第 1 卷，第 313-516 頁(yè)；Wiley Interscience, New York，1971)。此反應(yīng)通常由強(qiáng)無(wú)機(jī)酸如濃硫酸催化。過(guò)氧化氫與羧酸的反應(yīng)是一個(gè)平衡反應(yīng)，通過(guò)使用過(guò)剩濃度的過(guò)氧化物和/或羧酸或通過(guò)除去水將有利于過(guò)氧羧酸的制備?！┻^(guò)氧羧酸類(lèi)消毒劑或漂白劑由過(guò)氧羧酸、過(guò)氧化氫和相應(yīng)羧酸的平衡混合物構(gòu)成。這些商業(yè)過(guò)氧羧酸清潔系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)在于處于溶液狀態(tài)時(shí)過(guò)氧羧酸常常會(huì)隨著時(shí)間的推移而不穩(wěn)定。解決穩(wěn)定性問(wèn)題的一種方法是在使用前將多種反應(yīng)組分混合在一起以生成過(guò)氧羧酸，而這些組分單獨(dú)放置時(shí)可長(zhǎng)期穩(wěn)定。優(yōu)選地，各種反應(yīng)組分容易貯存、 操作相對(duì)安全，并在混合后能夠快速地產(chǎn)生有效濃度的過(guò)氧羧酸?？朔^(guò)氧羧酸化學(xué)法制備缺點(diǎn)的一種方法是使用具有過(guò)水解活性的酶催化劑。 授予DiCosimo等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/638,635以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2008/0176783、 2008/0176299、和2009/0005590公開(kāi)了在結(jié)構(gòu)上歸類(lèi)為糖酯酶CE-7家族成員的酶(即先鋒霉素C脫乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[ΑΧΕ])，糖酯酶的特征在于具有明顯的過(guò)水解活性，在足以用作消毒劑和/或漂白劑夠的濃度下，可將羧酸酯(在合適的過(guò)氧源存在下， 如存在過(guò)氧化氫)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧羧酸。已證實(shí)，糖酯酶CE-7家族的一些成員具有足夠的過(guò)水解活性，一旦將反應(yīng)組分混合后，能在1分鐘內(nèi)由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至 5000ppm的過(guò)乙酸，并在5分鐘至30分鐘內(nèi)生成高達(dá)9000ppm的過(guò)乙酸(DiCosimo等人， U. S. 2009/0005590)。
酶催化法過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)可以基于雙組分系統(tǒng)，其中在使用前將各組分貯存在單獨(dú)的隔室中。通常將具有過(guò)水解活性的酶催化劑與羧酸酯底物貯存在一個(gè)隔室中，而將過(guò)氧源(通常為過(guò)氧化氫的水溶液)貯存在第二隔室中。將兩個(gè)隔室的組分混合以生成所需的過(guò)氧羧酸水溶液。然而，多組分酶催化法過(guò)酸生成系統(tǒng)也會(huì)存在某些問(wèn)題。一個(gè)問(wèn)題可能是將兩種組分混合后，使用的一種或多種羧酸酯底物不溶于水或部分不溶于水。某些羧酸酯底物的有限溶解性會(huì)導(dǎo)致至少以下三種情況，它們會(huì)影響有效地制備和遞送過(guò)氧羧酸產(chǎn)物的能力首先，酶催化劑/底物組分的粘度會(huì)過(guò)高，而不能與包含過(guò)氧源的第二組分有效地混合，這會(huì)降低過(guò)氧羧酸的生成速率；其次，酶催化劑/底物組分的粘度會(huì)過(guò)高，而不能以某些方式遞送包含酶催化劑/底物組分與過(guò)氧源的混合物的產(chǎn)物，如不能通過(guò)噴霧方式遞送；第三，與在水溶液中包含過(guò)氧源的第二組分混合后，酶/底物組分中底物的溶解速率過(guò)低，而不能獲得令人滿意的過(guò)氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用包含水性過(guò)氧源的組分與包含酶催化劑/底物的組分時(shí)，羧酸酯的溶解性問(wèn)題也會(huì)變得明顯。就此而論，涉及在進(jìn)行所需時(shí)間的反應(yīng)前對(duì)具有過(guò)水解活性的酶催化劑和底物與過(guò)氧源分開(kāi)貯藏的商用多組分系統(tǒng)仍無(wú)法用于某些應(yīng)用。使用有機(jī)共溶劑以促進(jìn)混合和/或改變羧酸酯在水中的粘度也可能產(chǎn)生問(wèn)題。無(wú)論是將酶直接懸浮在有機(jī)溶劑中時(shí)，還是使用可混溶的有機(jī)/水單相溶劑時(shí)，有機(jī)溶劑都會(huì)降低酶的活性。在兩篇已發(fā)表的文獻(xiàn)中綜述了有機(jī)溶劑對(duì)酶活性和結(jié)構(gòu)的影響，它們是(a) C. Laane 等人，Biotechnol. Bioeng. 30 :81_87 (1987) ； (b) Cowan, D. Α.和 Plant, A. ,"Biocatalysis in Organic Phase Systems. ","Biocatalysis at Extreme Temperatures，，第 7 章，Kelly, R. W. W.禾口 Adams, Μ.編輯，Amer. Chem. Soc. Symposium Series,Oxford University Press,New York，NY，第 86—107 頁(yè)(1992)。 Cowan 禾口 Plant指出(第87頁(yè))在有機(jī)相體系中使用log的有機(jī)溶劑來(lái)穩(wěn)定胞內(nèi)酶幾乎沒(méi)有意義。 log P介于2和4之間的有機(jī)溶劑可根據(jù)酶的穩(wěn)定性視情況使用，而那些log P>4的有機(jī)溶劑一般可用于有機(jī)相體系。上文的Cowan和Plant還指出(第91頁(yè))溶于單相有機(jī)-水溶劑中的酶的直接暴露影響取決于溶劑濃度、溶劑/酶表面基團(tuán)相互作用、以及溶劑/酶水化層相互作用。因?yàn)槿軇┑膌og P值必須足夠低，使得溶劑可完全與水相混溶以形成單相，因此，包含低log P 值有機(jī)溶劑的單相有機(jī)-水溶劑通常會(huì)對(duì)酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響(在低有機(jī)溶劑濃度應(yīng)用中除外)。當(dāng)貯存于羧酸酯底物中或羧酸酯與一種或多種分配系數(shù)(以log P值度量，即底物在辛醇和水之間的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)，P =[溶質(zhì)]^l/[溶質(zhì)]為2或更小的共溶劑的混合物中時(shí)，具有過(guò)水解活性的CE-7酶的貯存穩(wěn)定性是個(gè)問(wèn)題。DiCosimo等人在 U. S. 2009/0005590中描述的若干有機(jī)酯底物的log P值小于2。例如，據(jù)報(bào)道甘油三乙酸酯的 log P 值為 0. 25 (Y. M. Gunning 等人，J. Agric. Food Chem. 48 :395-399 (2000))，其類(lèi)似于乙醇(log P-0. 26)和異丙醇(log P 0. 15) (Cowan和Plant)；因此在甘油三乙酸酯中貯存酶粉預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致不可接受的酶活性喪失，使用log P < 2的附加共溶劑也會(huì)一樣，這些共溶劑如環(huán)己酮，log P = 0. 94 (Cowan 和 Plant) ；1，2-丙二醇，log P =-1. 41 (Gunning 等人)； 1,3-丙二醇，log P =-1.3 (S-J. Kuo 等人，J. Am. Oil Chem. Soc. 73 1427-1433 (1996)) ；二乙二醇丁醚，log P = O. 56 (N. Funasaki 等人，J. Phys. Chem. 88 :5786-5790(1984))；三甘醇，log P = -1. 75 (L. Braeken 等人，ChemPhysChem 6 :1606-1612 (2005))。代理人檔案號(hào)為CL4205 US NA、名稱(chēng)為 “ENZYMATIC PERACID PRODUCTION USING A C0S0LVENT”的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)描述了利用log P值為約2 或更小的有機(jī)共溶劑，該共溶劑控制含底物組分的粘度并且提高含水反應(yīng)混合物中底物的溶解度，而不會(huì)使酶催化劑實(shí)質(zhì)上喪失過(guò)水解活性。代理人檔案號(hào)為CL4386 US NA 和 CL4387 US NA、標(biāo)題均為"STABILIZATION OF PERHYDR0LASES”的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)描述了 當(dāng)酶粉存在于多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)的羧酸酯底物組分中時(shí)，使酶粉的過(guò)水解活性穩(wěn)定的多種方法。代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA、名稱(chēng)為“頂PROVED PERHYDROLASES FOR ENZYMATIC PERACID GENERATION”的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)描述了具有改善的過(guò)水解活性的變體CE-7酶。需要解決的問(wèn)題是提供多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其包含多種成分的組合，這些成分的特征在于CE-7催化劑的過(guò)水解活性具有增強(qiáng)的貯存穩(wěn)定性，和/或含羧酸酯底物的組分具有改進(jìn)的混合和/或粘度特性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)優(yōu)選地包含具有改善的過(guò)水解活性的變體CE-7酶。發(fā)明概述通過(guò)提供包括第一隔室和第二隔室的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)已解決了上述問(wèn)題，其中在相應(yīng)隔室中的組分提供了增強(qiáng)的貯存穩(wěn)定性和/或改善的混合特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其包括包含第一組分的第一隔室和包含第二組分的第二隔室，以及用于混合第一組分和第二組分以制備過(guò)乙酸的水溶液的裝置；其中第一組分包含(i)酶粉，所述酶粉包含以下物質(zhì)的制劑(a)至少一種具有過(guò)水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包含具有糖酯酶家族7(CE-7)特征基序的酶，所述特征基序利用CLUSTALW與SEQ ID NO 1比對(duì)并包含(1)與SEQ ID NO :1的118至120對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQ ID NO 1的179至183對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的GXSQG基序；以及(3)與SEQ ID NO 1的298至299對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的HE基序；所述酶包含與SEQ ID NO 1至少30%的氨基酸同一性；以及(b)至少一種賦形劑；(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物選自(a)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種酯[XJmR5其中X 為式 Ii6C(O)O 的酯基；R6為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分， 其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵，其中&為C2至C7 ；R5為任選地由羥基取代的Cl至C6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烴基部分，其中&中的每個(gè)碳原子各自包含不超過(guò)一個(gè)羥基或不超過(guò)一個(gè)酯基，并且其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；m為1至&中的碳原子數(shù)，在25°C下，所述一種或多種酯在水中具有至少5ppm的溶解度；(b)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種甘油酯
O
R1-C——O——CH2-CH——CH2-OR4
OR3其中R1為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈或支鏈烷基，并且 R3和R4各自為H或R1C(O)；(c)下式的一種或多種酯
O
R1-C-O-R2其中R1為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈或支鏈烷基，并且 &為Cl至ClO直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基、(CH2CH2O) n、或(CH2CH(CH3)-O)nH,并且 η 為 1 至 10 ；(d) 一種或多種乙?；瘑翁恰⒁阴；?、或乙?；嗵?；以及(e) (a)至(d)的任意組合；其中，第一組分中羧酸酯底物的量被設(shè)計(jì)成在通過(guò)混合第一和第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至10重量％的終濃度；(iii)選自以下的緩沖劑碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、甲基磷酸鹽、琥珀酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和馬來(lái)酸鹽；(iv)選自以下的共溶劑三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2_丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、異丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1， 3-丙二醇、以及它們的任意組合；以及(ν)任選地，至少一種表面活性劑；其中第二組分包含水、過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫穩(wěn)定劑。在另一方面，提供了一種多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其包括包含第一組分的第一隔室和包含第二組分的第二隔室，以及用于混合第一和第二組分以制備過(guò)乙酸的水溶液的裝置；其中第一組分包含(i)酶粉，所述酶粉包含以下制劑(a)至少一種具有過(guò)水解活性的CE-7酶，其中所述至少一種CE_7酶包含選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 20 的氨基酸序列或基本上類(lèi)似于 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO 20 的氨基酸序列；以及(b)至少一種賦形劑；(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物；其中，第一組分中羧酸酯底物的量被設(shè)計(jì)成在通過(guò)混合第一和第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至10重量％的終濃度；(iii)選自以下的緩沖劑碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、甲基磷酸鹽、琥珀酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和馬來(lái)酸鹽；(iv)選自以下的共溶劑三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2_丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、異丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1， 3-丙二醇、以及它們的任意組合；以及(ν)任選地，至少一種表面活性劑；其中第二組分包含水、過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫穩(wěn)定劑。在另一方面，提供了上述多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中(i)所述至少一種 CE-7 酶包含選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :19 和 SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :20的氨基酸殘基277選自
丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸；(ii)所述羧酸酯底物為甘油三乙酸酯；其中所述第一組分中的甘油三乙酸酯的量被設(shè)計(jì)為在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至10重量％的終濃度；(iii)所述緩沖劑的濃度為所述第一組分的約0. 1重量％至約10重量％，并且所述緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物；(iv)所述共溶劑為三丙二醇甲醚，其濃度最高為所述第一組分的80重量％ ；(vi)所述表面活性劑是存在的并且為聚山梨酸酯80 ；以及(vi)所述第二組分中的所述過(guò)氧化氫的含量在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 33重量％至約30重量％的終濃度。在另一方面，多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)還包括將通過(guò)混合第一和第二組分而制備的過(guò)乙酸水溶液應(yīng)用于表面漂白或消毒的方法。此外，提供了一種使用多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)的方法，包括(a)利用用于混合第一和第二組分的裝置，從而制備包含過(guò)乙酸的含水制劑；以及(b)將(a)中制備的包含過(guò)乙酸的含水制劑應(yīng)用于表面、衣物或紡織物上，以進(jìn)行漂白、脫色、除臭、衛(wèi)生處理、消毒、或它們的組合。附圖
簡(jiǎn)述圖Ia和Ib示出了使用雙隔室噴霧瓶根據(jù)本發(fā)明制備過(guò)氧羧酸的示例性系統(tǒng)。參見(jiàn)圖la，一般性噴霧瓶系統(tǒng)包括包含第一組分[2]的第一室[1]和包含第二組分W]的第二室[3]。輸送管[5]用于將第一和第二組分傳輸至流量控制元件[6]和[7]，后者優(yōu)選地具有單個(gè)調(diào)節(jié)控制旋鈕[8]，它允許兩種組分以所需的體積比或重量比混合。圖Ia示出了泵[9]，它用于泵送和混合兩種液體組分，再?gòu)膰婌F嘴[10]中噴出。圖Ib類(lèi)似于圖la， 但不同的是泵[9]和噴嘴[10]被構(gòu)造成將第一和第二組分的混合延遲在噴霧嘴處或目標(biāo)表面上進(jìn)行。圖加和2b示出了利用具有多個(gè)隔室的包制備過(guò)氧羧酸的示例性系統(tǒng)。對(duì)于形成多室系統(tǒng)的外部屏障[11]和/或?qū)⒌谝唤M分[2]與第二組分[4]分開(kāi)的內(nèi)室屏障[12]的阻擋材料，將其設(shè)計(jì)成易于降解和/或破碎(通過(guò)機(jī)械、化學(xué)和/或熱作用)，以生成含水過(guò)氧羧酸混合物。參見(jiàn)圖2a，該遞送系統(tǒng)包括可溶性包裝和內(nèi)室，其中可溶性包裝包括可破碎的外部屏障[11]，內(nèi)室具有內(nèi)室屏障[12]并包含第一組分[2]，而第一組分被第二組分 [4]包圍。內(nèi)室屏障[12]被設(shè)計(jì)為可破碎和/或可降解的，以混合兩種組分而生成所需的過(guò)氧羧酸。圖2b示出了具有平行分開(kāi)的雙隔室的可溶性包。如圖2b所示，“雙隔室包”包括可溶解和/或可破碎的外部屏障[11]以及第一隔室[1]和第二隔室[3]，它們分別包含組分[2]和W]。第一和第二隔室以屏障[13]分開(kāi)。圖3a和圖北示出了利用多室、柔性擠壓包/瓶根據(jù)本發(fā)明制備過(guò)氧羧酸的示例性系統(tǒng)。參見(jiàn)圖3a，手壓變形容器[16]包括非剛性壁[14]。容器[16]中是包含第一組分的可手壓破裂/破碎的內(nèi)室[15]，其中內(nèi)室[15]被第二組分[4]包圍。內(nèi)室[15]的破裂可讓組分混合并生成活性物質(zhì)。如圖3a所示，手壓變形容器(如塑料擠壓瓶)還包括具有可移除的塞子[17]的定向噴口。圖北示出了非剛性容器[16]，其包括包含第一組分[2] 的第一隔室[1]和包含第二組分[4]的第二隔室[3]，其中兩個(gè)隔室以平行構(gòu)型分開(kāi)。在圖北中，也示出了手壓變形瓶具有定向噴口 [18]和可移除的塞子[17]，其中兩種組分在瓶外混合ο牛物序列簡(jiǎn)述下面的序列遵循37 C. F. R. § § 1. 821-1. 825( "Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization, WIPO)標(biāo)準(zhǔn) ST. 25(1998)、歐洲專(zhuān)禾Ij 公約(European Patent Convention, EPC)序列表要求、專(zhuān)利合作條約(Patent Cooperation Treaty, PCT)細(xì)則 5· 2 和 49. 5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第 208 節(jié)和附錄 C。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37 C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。SEQ ID NO 1 是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ATCC 31954 先鋒霉素 C 脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 2是枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC 6633 先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 3 是地衣芽孢桿菌(B. licheniformis) ATCC 14580 先鋒霉素 C 脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :4是短小芽孢桿菌(B.pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :5 是熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC 27405 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :6是那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :7是海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)
氨基酸序列。SEQ ID NO :8 是熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp. ) JW/SLYS485 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 9是芽孢桿菌屬(Bacillus sp. )NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)指出的是，在GENBANK 登錄號(hào)ZP_01168674中報(bào)告的編碼芽孢桿菌屬NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的核酸序列似乎會(huì)編碼在N端增加的15個(gè)氨基酸，根據(jù)與其他先鋒霉素C脫乙酰酶的序列比對(duì)，以及根據(jù)報(bào)告長(zhǎng)度(340個(gè)氨基酸)與其他CAH酶的觀測(cè)長(zhǎng)度(通常為318至325個(gè)氨基酸；參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4205 US NA、 名稱(chēng)為 “ENZYMATIC PERACID PRODUCTION USING A C0S0LVENT” 的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)；其以引用方式并入本文)的比較，此核酸序列可能不正確。因此， 本文報(bào)道的芽孢桿菌屬NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列與GENBANK 登錄號(hào)ZP_01168674下報(bào)道的不同，其不含N-端的15個(gè)氨基酸。SEQ ID NO 10是耐鹽嗜堿芽孢桿菌(Bacillus halodurans) C-125先鋒霉素C脫
乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :11是克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)KSM-K16先鋒霉素C脫乙
酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID N0 12是枯草芽孢桿菌ATCC ^233 先鋒霉素C脫乙酰酶(CAH)的推導(dǎo)
氨基酸序列。SEQ ID NO 13 ^ Thermoanearobacterium saccharolyticum 5^11 C M^k 酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 14是Thermotoga Iettingae乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 15是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 16是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2第一種乙酰木聚糖酯酶(本文稱(chēng)為“RQ2 (a) ” )的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 17是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2第二種乙酰木聚糖酯酶(本文稱(chēng)為“RQ2 (b) ”)的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 18是含SEQ ID NO :1的118至299位氨基酸殘基區(qū)域的氨基酸序列。SEQ ID NO 19是那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA、名稱(chēng)為“IMPROVED PERHYDROLASES FOR ENZYMATIC PERACID GENERATION”的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(全文以引用方式并入本文)，其中第277位的Xaa殘基為Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO :20是海棲熱袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其中第 277 位的 Xaa 殘基為 Ala、Val、kr、或 Hir。SEQ ID NO :21是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列， 參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其中第277位的Xaa殘基為Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO :22是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)， 其中第277位的Xaa殘基為Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO :23是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2乙酰木聚糖酯酶變體(衍生自“RQ2(a)”)的推導(dǎo)氨基酸序列，參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其中第277位的Xaa殘基為Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO : 是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2乙酰木聚糖酯酶變體(衍生自“RQ2(b)”)的推導(dǎo)氨基酸序列，參見(jiàn)代理人檔案號(hào)為CL4392 US NA的共同擁有、共同提交、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其中第278位的Xaa殘基為A1 a、Va 1、kr、或Thr。SEQ ID NO :25 是熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp.) JW/SLYS485 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO J6是卡那霉素鏈霉菌(Sti^ptomyces kanamyceticus)的卡那霉素抗性基因(kan)的編碼區(qū)。SEQ ID NO 27是含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pKD13。SEQ ID NO :28是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katG的正向引物。SEQ ID NO 29是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katG的反向引物。SEQ ID NO 30 是使用 SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29 的引物從質(zhì)粒 pKD13 擴(kuò)增 katG得到的PCR產(chǎn)物。SEQIDNO:31是過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶基因(katG)的編碼區(qū)。
SEQIDNO32是katG的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQIDNO33是包含λ -Red重組酶基因的質(zhì)粒pKD46。
SEQIDNO34是用于確認(rèn)katG中斷的正向引物。
SEQIDNO35是用于確認(rèn)katG中斷的反向引物。
SEQIDNO36是包含F(xiàn)LP重組酶的溫敏質(zhì)粒pCP20。
SEQIDNO37是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katE的正向引物。
SEQIDNO38是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katE的反向引物。
SEQIDNO39是使用SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38的引物從質(zhì)粒pKD13擴(kuò)增
katE得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO :40是過(guò)氧化氫酶HPII基因(katE)的編碼區(qū)。SEQ ID NO :41是katE的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :42是用于確認(rèn)katE中斷的正向引物。SEQ ID NO :43是用于確認(rèn)katE中斷的反向引物。SEQ ID NO :44是編碼那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因的編碼區(qū)，如在 GENBANK (登錄號(hào) AEOOO5I2)中報(bào)告。SEQ ID NO 45是用于擴(kuò)增那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。SEQ ID NO 46是用于擴(kuò)增那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。SEQ ID NO 47是使用SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的引物擴(kuò)增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO :48是編碼海棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因，如在GENBANK (登錄號(hào) NP_227893. 1)中報(bào)告。SEQ ID NO 49是用于擴(kuò)增海棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。SEQ ID NO 50是用于擴(kuò)增海棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。SEQ ID NO 51是使用SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 50的引物擴(kuò)增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO 52和53是實(shí)例25中所述的正向和反向引物。SEQ NO力4是通過(guò)SEQ ID NO :52和53擴(kuò)增得到的核酸產(chǎn)物的核酸序列，其用于制備質(zhì)粒PSW207。SEQ ID NO 55和56是實(shí)例25中所述的正向和反向引物。SEQ NO 57是密碼子優(yōu)化的海棲熱袍菌編碼序列，用于制備質(zhì)粒pSW228。SEQ ID NO 58至65是用于制備實(shí)例沈中海棲熱袍菌變體的編碼序列的正向和反向引物。發(fā)明詳述在本公開(kāi)中，使用了大量的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。除非另外特別說(shuō)明，將采用下述定義。如本文所用，在本發(fā)明的元件或組分之前的詞語(yǔ)“一個(gè)”、“一種”旨在表明元件或組分的實(shí)例(即出現(xiàn)的事物)數(shù)量為非限制性的。因此，應(yīng)將“一個(gè)”和“一種”理解為包括一個(gè)(種)或至少一個(gè)(種)，并且元件或組分的詞語(yǔ)單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有
數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”意指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟、或組分的存在，但它不預(yù)先排除一種或多種其他特征、整數(shù)、步驟、組分或其組的存在或添加。術(shù)語(yǔ) “包含”旨在包括由術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”和“由…組成”涵蓋的實(shí)施方案。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ) “基本上由…組成”旨在包括由術(shù)語(yǔ)“由…組成”涵蓋的實(shí)施方案。如本文所用，修飾成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指可以通過(guò)例如以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化在真實(shí)世界中用于制備濃縮物或使用溶液的一般測(cè)量和液體處理操作；這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來(lái)源或純度中的差異；等等。術(shù)語(yǔ)“約”還包括因特定起始混合物所產(chǎn)生的組合物的不同平衡條件而不同的量。無(wú)論是否通過(guò)術(shù)語(yǔ)“約”來(lái)修飾，權(quán)利要求都包括量的等同量。當(dāng)存在時(shí)，所有的范圍都包括端值以及其中的組合。例如，當(dāng)列出范圍“1至5”時(shí)， 所列范圍應(yīng)視為包括范圍“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2&4至5”、“1至；3&5”等等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“底物”、“合適的底物”、以及“羧酸酯底物”可互換地專(zhuān)指(a)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種酯[XlfflR5其中X 為式 Ii6C(O)O 的酯基；R6為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分， 其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵，其中&為C2至C7 ；R5為任選地由羥基取代的Cl至C6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烴基部分，其中&中的每個(gè)碳原子各自包含不超過(guò)一個(gè)羥基或不超過(guò)一個(gè)酯基，并且其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；m為1至&中的碳原子數(shù)，在25°C下，所述一種或多種酯在水中具有至少5ppm的溶解度；或者(b)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種甘油酯
權(quán)利要求
1.多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括包含第一組分的第一隔室和包含第二組分的第二隔室，以及用于混合所述第一組分和所述第二組分以制備過(guò)乙酸的含水制劑的裝置；其中所述第一組分包含(i)酶粉，所述酶粉包含以下物質(zhì)的制劑(a)至少一種具有過(guò)水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包含具有糖酯酶家族 7 (CE-7)特征基序的酶，所述特征基序利用CLUSTALW與SEQ ID NO=I比對(duì)并包含(1)與SEQID NO :1的118至120對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQID NO 1的179至183對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的GXSQG基序；以及(3)與SEQID NO 1的298至299對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處的HE基序； 所述酶包含與SEQ ID NO 1至少30%的氨基酸同一性；以及(b)至少一種賦形劑；( )羧酸酯底物，所述羧酸酯底物選自(a)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種酯 [X] mR5其中X為式Ii6C(O)O的酯基；R6為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其中 R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵，其中&為C2至C7 ；R5為任選地由羥基取代的Cl至C6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烴基部分，其中&中的每個(gè)碳原子各自包含不超過(guò)一個(gè)羥基或不超過(guò)一個(gè)酯基，并且其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； m為1至&中的碳原子數(shù)，在25°C下，所述一種或多種酯在水中具有至少5ppm的溶解度；(b)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種甘油酯
2.權(quán)利要求1的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述至少一種賦形劑的含量在所述酶粉的約95重量％至約25重量％范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中(i)所述羧酸酯底物為甘油三乙酸酯；其中所述第一組分中的甘油三乙酸酯的量被設(shè)計(jì)成在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至10 重量％的終濃度；( )所述緩沖劑的濃度為所述第一組分的約0. 1重量％至約10重量％，并且所述緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物；(iii)所述共溶劑為三丙二醇甲醚，其濃度最高為所述第一組分的80重量％；(iv)所述表面活性劑是存在的并且為聚山梨酸酯80；并且(ν)所述第二組分中的所述過(guò)氧化氫的含量在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 33重量％至約30重量％的終濃度。
4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中將所述第一組分與所述第二組分以約1 1至約1 10的重量比混合。
5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)以?xún)蓚€(gè)獨(dú)立瓶、兩隔室噴霧瓶、兩隔室包、或兩隔室非剛性擠壓瓶的形式提供。
6.多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括包含第一組分的第一隔室和包含第二組分的第二隔室，以及用于混合所述第一組分和所述第二組分以制備過(guò)乙酸的含水制劑的裝置；其中所述第一組分包含(i)酶粉，所述酶粉包含以下物質(zhì)的制劑(a)至少一種具有過(guò)水解活性的CE-7酶，其中所述至少一種CE-7酶包含選自SEQID NO 6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :19禾口 SEQ ID NO :20的氨基酸序列或基本上類(lèi)似于SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO 20 的氨基酸序列；以及(b)至少一種賦形劑；( )羧酸酯底物，所述羧酸酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、 以及它們的混合物；其中所述第一組分中的所述羧酸酯底物的量被設(shè)計(jì)成在通過(guò)混合所述第一和第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至10重量％的終濃度；(iii)選自以下的緩沖劑碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、甲基磷酸鹽、琥珀酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和馬來(lái)酸鹽；(iv)選自以下的共溶劑三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、 二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、異丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、以及它們的任意組合；以及(ν)任選地，至少一種表面活性劑；其中所述第二組分包含水、過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫穩(wěn)定劑。
7.權(quán)利要求6的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中⑴所述至少一種 CE-7 酶包含選自 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :19 禾口 SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :20的氨基酸殘基277選自丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸；( )所述羧酸酯底物為甘油三乙酸酯；其中所述第一組分中的甘油三乙酸酯的量被設(shè)計(jì)為在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 5重量％至 10重量％的終濃度；(iii)所述緩沖劑的濃度為所述第一組分的約0.1重量％至約10重量％，并且所述緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物；(iv)所述共溶劑為三丙二醇甲醚，其濃度最高為所述第一組分的80重量％； (vi)所述表面活性劑是存在的并且為聚山梨酸酯80 ；并且(vi)所述第二組分中的所述過(guò)氧化氫的含量在通過(guò)混合所述第一組分和所述第二組分而形成的反應(yīng)制劑中提供0. 33重量％至約30重量％的終濃度。
8.權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中將所述第一組分與所述第二組分以約1 1至約1 10的重量比混合。
9.權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，其中所述多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)以?xún)蓚€(gè)獨(dú)立瓶、兩隔室噴霧瓶、兩隔室包、或兩隔室非剛性擠壓瓶的形式提供。
10.權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，還包括將通過(guò)混合所述第一和第二組分而制備的包含過(guò)乙酸的含水制劑應(yīng)用于表面、衣物或紡織物以進(jìn)行漂白、脫色、 除臭、衛(wèi)生處理、消毒、或它們的組合的裝置。
11.使用權(quán)利要求1或權(quán)利要求6的多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)的方法，所述方法包括(a)利用用于混合所述第一和第二組分的裝置，從而制備包含過(guò)乙酸的含水制劑；以及(b)將(a)中制備的包含過(guò)乙酸的含水制劑應(yīng)用于表面、衣物或紡織物以進(jìn)行漂白、脫色、除臭、衛(wèi)生處理、消毒、或它們的組合。
全文摘要
本文公開(kāi)了多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)，用于以酶催化法制備適用于如消毒劑和/或漂白應(yīng)用的過(guò)氧羧酸含水制劑。所述多組分過(guò)氧羧酸生成系統(tǒng)包含至少一種具有過(guò)水解活性的糖酯酶家族7的酶。
文檔編號(hào)C12N9/18GK102264893SQ200980148563
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者A·本-巴薩, D·G·迪皮特羅, E·C·罕, M·S·佩恩, R·A·雷諾, R·R·佐蘭茲, R·迪科西莫, W·R·卡希爾 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司