專利名稱：：用食油假單胞菌菌株有效防治病毒性植物病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有防治植物病毒病活性的食油假單胞菌(I^eudomonasoleovorans)菌株；和包含它的用于防治植物病毒病的微生物制劑。
背景技術(shù)：
：園林作物的總種植面積逐年增長，然而，大多數(shù)園林作物中發(fā)生多種植物病毒病，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。損害園林作物的植物病毒包括黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)。為了防治這些病毒，開發(fā)了農(nóng)藝防治方法(例如使用無病種子和培育抗病毒的新品系的那些方法)，但其效果并不顯著。同時，通過向植物中引入基因(如衣殼蛋白基因、復(fù)制相關(guān)基因、衛(wèi)星RNA基因和反義基因)開發(fā)了抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物，但要獲得工業(yè)上的成功尚需時日(Fitchen，J.H.禾口Beachy，R.N.，Annu.Rev.Microbiol.,47:739-763,1993)。最近有很多開發(fā)新微生物制劑的研究采用微生物來防治植物病毒。尤其地，微生物制劑是環(huán)境友好的手段，其能保持自然生態(tài)系統(tǒng)并對哺乳動物無毒，因而對微生物制劑的需求在增加。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供有效防治植物病毒病的微生物；和包含它的微生物制劑。根據(jù)上述目的，本發(fā)明提供了具有防治植物病毒病活性的食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)；其培養(yǎng)物；所述培養(yǎng)物的干粉；和用于防治植物病毒性疾病的微生物制劑，其包含作為活性成分的所述菌株、其培養(yǎng)物或所述培養(yǎng)物干粉。附圖簡述結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述的和其它目的和特征會從本發(fā)明如下描述中顯而易見，附圖分別顯示圖1:KBPF_004菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹；圖21000倍稀釋的KBPF-004的25%可濕性粉劑(WP)對煙草花葉病毒的防治活性；圖3通過RT-PCR確證的KBPF-00425%WP對煙草花葉病毒的抑制作用；圖4通過RT-PCR確證的KBPF-00425%WP對病毒單一或復(fù)合感染的抑制作用(C=Chungyang紅辣椒；D=Daemyung辣椒；M分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物；H健康植物；N未處理組；和1，2:KBPF-004處理組)；圖5:KBPF-00425%WP處理的病毒顆粒電子顯微鏡照片(TMV煙草花葉病毒；PVY馬鈴薯Y病毒)；圖6:KBPF-00425%WP對煙草花葉病毒的感染抑制作用；圖7:KBPF-00425%WP對辣椒斑駁病毒(peppermottlevirus)的防治作用；圖8:KBPF-00425%WP對水稻條紋病毒的防治作用(A未處理組；B:500倍稀釋的KBPF-004的25%WP處理組)；圖9:KBPF-0042.5%顆粒劑對煙草花葉病毒的防治作用；和圖10:KBPF-004的70%水懸浮劑(AS)對番茄黃化曲葉病毒的防治作用(A未處理組(市售殺蟲劑處理組)；B:500倍稀釋的KBPF-00470%水懸浮劑和市售殺蟲劑處理組)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有防治植物病毒性疾病活性的食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)菌株。食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)形成具有梳狀條紋輪廓的黃色圓形集落。該菌株為23μm長、0.30.5μm寬的棒狀，并有單條長鞭毛。本發(fā)明菌株具有SEQIDNO=I所示的1479bp核苷酸序列的16SrDNA，其與食油假單胞菌IAM1508T的序列有99.05%的序列同源性。通過依據(jù)Clustal法(ThompsonJD等，Nuc.Acid.Res.25:4876-82,1997)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)來研究本發(fā)明菌株的分類地位。本發(fā)明菌株在其特異性的抗病毒活性方面不同于現(xiàn)有的食油假單胞菌。因此，該菌株被命名為食油假單胞菌KBPF-004，并于2002年1月11日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KoreanCollectionforTypeCultures，KCTC)，登記號為KCTC10159BP。本發(fā)明還提供了有效防治植物病毒病的食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)的培養(yǎng)物?？梢酝ㄟ^將食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)細(xì)胞接種于培養(yǎng)基并使其發(fā)酵來制備所述培養(yǎng)物。培養(yǎng)基可沒有任何限定地包含培養(yǎng)革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)基的常規(guī)成分。優(yōu)選地，該培養(yǎng)基可在IL水中包含Ig至20g葡萄糖、Ig至30g酵母提取物、0.Ig至Ig硫酸鎂、0.5g至5g磷酸二氫鉀和0.5g至5g磷酸氫二鉀。更優(yōu)選地，該培養(yǎng)基可在IL水中包含7g至14g葡萄糖、15g至25g酵母提取物、0.1至0.2g硫酸鎂、Ig至2g磷酸二氫鉀和Ig至2g磷酸氫二鉀。發(fā)酵可在20°C至40°C的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選至;34°C；通氣速率為501/分鐘至2001/分鐘，優(yōu)選1001/分鐘至1201/分鐘，旋轉(zhuǎn)速度為IOOrpm至250rpm，優(yōu)選120rpm至200rpmo為制備本發(fā)明的微生物制劑，優(yōu)選菌株細(xì)胞和培養(yǎng)物濾液二者都使用。而且，本發(fā)明提供所述培養(yǎng)物的干粉。干粉可以通過滅菌、濃縮和粉碎(冷凍干燥和研磨)的步驟來制備。滅菌步驟可在培養(yǎng)完成后通過加熱細(xì)胞培養(yǎng)物來進(jìn)行，加熱溫度為80°C至120°C，時間為1至20分鐘，優(yōu)選90°C至100°C，5至10分鐘。濃縮步驟可通過在40°C至80°C溫度下將滅菌培養(yǎng)物減壓濃縮12-48小時來進(jìn)行，優(yōu)選在65°C至75°C進(jìn)行M至36小時。粉碎步驟可通過采用冷凍干燥或噴霧干燥法對濃縮培養(yǎng)物進(jìn)行干燥處理，并將其研磨制成粉末培養(yǎng)物而進(jìn)行，但并不限于該方法。冷凍干燥過程可通過從_80°C開始將溫度順次升高48至96小時(優(yōu)選60至80小時)以干燥濃縮培養(yǎng)物來進(jìn)行。研磨過程通過使用針磨粉碎機(jī)(pinmillgrinder)將所得的凍干產(chǎn)物研磨至2mm或更小的粒徑來進(jìn)行。微生物制劑可通過將所述細(xì)胞、所述培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的干粉與表面活性劑、營養(yǎng)物和載體聯(lián)合配制而制備。此外，本發(fā)明提供了用于防治植物病毒病的微生物制劑，其包含作為活性成分的食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)細(xì)胞、其培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的干粉。用于防治植物病毒性疾病的微生物制劑表現(xiàn)出依賴于活性成分濃度的抗病毒活性。本發(fā)明的微生物制劑可包含按重量計(jì)2.5至70%的食油假單胞菌KBPF_004(KCTC10159BP)細(xì)胞、其培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的干粉；按重量計(jì)2-30%的表面活性劑；和剩余量的載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物制劑可包含按重量計(jì)2.5至70%的食油假單胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)細(xì)胞、其培養(yǎng)物或培養(yǎng)物的干粉。所述表面活性劑可包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或其混合物。表面活性劑可選自磺酸化合物的鈉鹽或鈣鹽，如c812烷基芳基磺酸鹽、c812二烷基芳基磺酸鹽、C8^12二烷基磺基琥珀酸鹽、木質(zhì)素磺酸鹽、萘磺酸鹽縮合物、萘磺酸鹽福爾馬林縮合物、C8^12烷基萘磺酸鹽福爾馬林縮合物和聚氧乙烯c812烷基苯基磺酸鹽；硫酸鹽化合物的鈉鹽或鈣鹽，如c812烷基硫酸鹽、C8^12烷基芳基硫酸鹽、聚氧乙烯c812烷基硫酸鹽和聚氧乙烯C812烷基苯基硫酸鹽；琥珀酸化合物的鈉鹽或鈣鹽，如聚氧化烯琥珀酸鹽；陰離子表面活性劑，如苯甲酸鈉和烷基羧酸鹽；非離子表面活性劑，如聚氧乙烯C12^18烷基醚、聚氧乙烯c812烷基苯基醚、聚氧乙烯c812烷基苯基聚合物和環(huán)氧乙烷環(huán)氧丙烷共聚物’聚羧酸鹽Jriton100；Tween80；和它們的混合物，但不限于此。載體可選自膨潤土、滑石、粘土、高嶺土、碳酸鈣、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠巖、白炭(whitecarbon)、硫酸銨、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物，但不限于此。另外，可用所述表面活性劑和/或載體將本發(fā)明的微生物制劑制備成選自以下的形式可濕性粉劑(wettablepowder，WP)、水分散顆粒劑(waterdispersiblegranule,WG)、濃縮懸浮劑(suspensionconcentrate，SC)、顆粒劑、/K懸浮劑(aqueoussuspension,AS)、可溶性粉劑(solublepowder，SP)、水溶性顆粒劑(watersolublegranule,SG)和膠囊劑。在本發(fā)明中，細(xì)胞或培養(yǎng)物可以包含它的用于防治植物病毒病的微生物制劑的形式提供，或長期保存并在使用前與其它成分混合的獨(dú)立儲存形式提供。對于長期存放，細(xì)胞或培養(yǎng)物可以在-70°C以下儲存在甘油儲存液中，或以凍干形式儲存。本發(fā)明提供的可濕性粉劑形式的微生物制劑可通過以下方法制備通過后處理過程獲得培養(yǎng)物的干粉；向其中加入表面活性劑、營養(yǎng)物和載體；并將其混合。本發(fā)明提供的顆粒劑形式的微生物制劑可通過以下方法制備通過后處理過程獲得培養(yǎng)物的干粉；向其中加入表面活性劑，載體和崩解劑；并將其混合。用于本發(fā)明的崩解劑可選自膨潤土、滑石、dialite、高嶺土、碳酸鈣及其混合物。除了微生物細(xì)胞和/或發(fā)酵產(chǎn)物(微生物的培養(yǎng)物)之外，顆粒劑還可包含選自以下的成分表面活性劑、無活性載體、防腐劑、潤濕劑、供應(yīng)促進(jìn)劑(supply-promotingagent)、吸引劑(attractingagent)、包封劑、粘合劑、乳化劑、染料、UV防護(hù)劑、緩沖劑或助流劑。本發(fā)明中提供的微生物制劑水懸浮劑可通過以下方法制備通過后處理過程無菌濃縮培養(yǎng)物；向其中加入選自以下的成分表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、供應(yīng)促進(jìn)劑、引誘劑(attractingagent)、UV防護(hù)劑和緩沖劑；并將其混合。本發(fā)明的微生物制劑可有效地防治大多數(shù)由以下病原性病毒組引起的植物病毒病例如，青蔥X病毒屬(Allexivirus)、苜蓿花葉病毒屬(Alfamovirus)、葡萄卷葉病毒屬(Ampelovirus)、大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)、菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)>毛狀病毒組(Capillovirus)、香石竹潛病毒組(Carlavirus)、香石竹斑駁病毒組(Carmovirus)、花椰菜花葉病毒組(Caulimovirus)、線形病毒組(Closterovirus)、豇豆花葉病毒組(Comovirus)、南瓜花葉病毒組(Cucumovirus)、長線狀病毒屬(Crinivirus)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)、蠶豆萎蔫病毒組(Fabavirus)、彎曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒屬(Foveavirus)、真菌傳桿狀病毒組(Furovirus)、雙粒病毒組(Geminivirus)、大麥病毒組(Hordeivirus)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組(Ilarvirus)、黃矮病毒組(Luteovirus)、葡萄斑點(diǎn)病毒屬(Maculavirus)、線蟲傳多面體病毒組(Nepovirus)、馬鈴薯X病毒組(Potexvirus)、馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)、植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)、馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)、馬鈴薯病毒屬(Pomovirus)、溫州蜜柑矮縮病毒屬(&idwavirus)、Taastrupvirus、細(xì)病毒組(Tenuivirus)、煙草花葉病毒組(Tobamovirus)、煙草脆裂病毒組CTobravirus)、番茄叢矮病毒組(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)、發(fā)狀病毒屬(Trichovirus)及其組合。特別地，本發(fā)明的微生物制劑非常有效地防治包含棒狀(線狀)單鏈RNA的煙草花葉病毒組、馬鈴薯Y病毒組和細(xì)病毒組，包含環(huán)狀單鏈RNA的南瓜花葉病毒組和包含環(huán)狀單鏈DNA的菜豆金黃花葉病毒屬。更特別地，本發(fā)明的微生物制劑對以下病毒顯示出極佳的防治作用辣椒斑駁病毒(PepMoV)、辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)、黃瓜綠斑點(diǎn)花葉病毒(CGMMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)、蕪菁花葉病毒(TuMV)或水稻條紋病毒(RSV)等。以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明而不限制其范圍。實(shí)施例1:KBPF_004的分離和鑒定<1-1>KBPF-0Q4菌株的分離從忠清北道陰城郡的煙草田中收集含有煙草植物根的土樣。用無菌蒸餾水稀釋所收集的土樣，將稀釋液涂布到補(bǔ)充有IOOppm環(huán)己酰胺的TSA瓊脂培養(yǎng)基上(Difco，Detroit,MI)，并在27°C下孵育以分離菌株純培養(yǎng)物。<1-2>KBPF-0Q4菌株的鑒定在30°C下在MuellerHinton培養(yǎng)基(包含2.Og牛肉浸膏、17.5g酪蛋白、1.5g淀粉和17.5g瓊脂)中將實(shí)施例<1_1>中分離出的菌株孵育M小時。分離出的菌株形成具有梳狀條紋輪廓的黃色圓形集落。該菌株為23μπι長、60.30.5μm寬的棒狀，，并有單條長鞭毛。為鑒定菌株的生物化學(xué)特征，進(jìn)行了脂肪酸組成分析、BiologGN微孔板分析和API20NE分析，結(jié)果分別參加表1_3?！幢?>權(quán)利要求1.具有針對植物病毒病的防治活性的食油假單胞菌O^seudomonasoleovorans)菌株KBPF-004(KCTC10159BP)。2.權(quán)利要求1所述食油假單胞菌菌株的培養(yǎng)物。3.權(quán)利要求2所述培養(yǎng)物的干粉。4.權(quán)利要求3的干粉，其中所述干粉通過冷凍干燥或噴霧干燥制備。5.用于防治植物病毒病的微生物制劑，其包含作為活性成分的食油假單胞菌菌株KBPF-004(KCTC10159BP)、其培養(yǎng)物或所述培養(yǎng)物的干粉。6.權(quán)利要求5的微生物制劑，其包含按重量計(jì)2.5至70%的食油假單胞菌菌株、其培養(yǎng)物或所述培養(yǎng)物的干粉；按重量計(jì)2至30%的表面活性劑；和剩余量的載體。7.權(quán)利要求6的微生物制劑，其中所述表面活性劑為陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或其混合物。8.權(quán)利要求6的微生物制劑，其中所述載體選自膨潤土、滑石、粘土、高嶺土、碳酸鈣、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠巖、白炭、硫酸銨、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物。9.權(quán)利要求5的微生物制劑，其形式選自可濕性粉劑(WP)、水分散顆粒劑(WG)、濃縮懸浮劑(Sc)、顆粒劑、水懸浮劑(AQ、可溶性粉劑(SP)、水溶性顆粒劑(SG)和膠囊劑。10.權(quán)利要求5的微生物制劑，其中所述植物病毒病由選自以下的植物病毒組引起青蔥X病毒屬(Allexivirus)、苜?；ㄈ~病毒屬(Alfamovirus)、葡萄卷葉病毒屬(Ampelovirus)、大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)、菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)>毛狀病毒組(Capillovirus)、香石竹潛病毒組(Carlavirus)、香石竹斑駁病毒組(Carmovirus)、花椰菜花葉病毒組(Caulimovirus)、線形病毒組(Closterovirus)、豇豆花葉病毒組(Comovirus)、南瓜花葉病毒組(Cucumovirus)、長線狀病毒屬(Crinivirus)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdovirus)、蠶豆萎蔫病毒組(Fabavirus)、彎曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒屬(Foveavirus)、真菌傳桿狀病毒組(Furovirus)、雙粒病毒組(Geminivirus)、大麥病毒組(Hordeivirus)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組(Ilarvirus)、黃矮病毒組(Luteovirus)、葡萄斑點(diǎn)病毒屬(Maculavirus)、線蟲傳多面體病毒組(Nepovirus)、馬鈴薯X病毒組(Potexvirus)、馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)、植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)、馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)、馬鈴薯病毒屬(Pomovirus)、溫州蜜柑矮縮病毒屬(&idwavirus)、Taastrupvirus、細(xì)病毒組(Tenuivirus)、煙草花葉病毒組(Tobamovirus)、煙草脆裂病毒組CTobravirus)、番茄叢矮病毒組(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)、發(fā)狀病毒屬(Trichovirus)及其組合。全文摘要本發(fā)明涉及使用食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)菌株對植物病毒病進(jìn)行有效防治。本發(fā)明的整合了食油假單胞菌菌株的生物劑針對煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus)、馬鈴薯Y病毒(potyvirus)、細(xì)病毒(tenuyivirus)、黃瓜花葉病毒(koo-koomosaicvirus)和菜豆金黃花葉病毒(begomosaicvirus)的植物病毒感染提供極佳的防護(hù)。文檔編號C12N1/00GK102239247SQ200980148301公開日2011年11月9日申請日期2009年12月1日優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日發(fā)明者張哲,李容溱,金亨珉,金南圭,黃仁天申請人:李容溱