釀造方法

專利名稱：釀造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)麥芽汁(Brewer's wort)和用于產(chǎn)生啤酒的包括縮短的糖化過程(mashing regime)的方法。
背景技術(shù)：
釀造方法在本領(lǐng)域中公知，并且通常包括發(fā)麥芽(malting)、糖化(mashing)和發(fā)酵的步驟。糖化是將來自發(fā)芽谷粒和固體輔料的淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵和不可發(fā)酵的糖，從而產(chǎn)生具有所需組成的麥芽汁的方法。糖化方法在不同溫度進(jìn)行一段時間，以活化負(fù)責(zé)降解蛋白質(zhì)和糖的內(nèi)源酶。至今為止，糖化中帶來的最重要的變化是將淀粉分子轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖。然而，帶來該轉(zhuǎn)化的酶具有不同的最適溫度，且必需將醪(mash)加熱至所述酶效用最佳的不同溫度。
在給定溫度所述酶需要一定時間間隔來適當(dāng)反應(yīng)，該時間通常稱作例如酶靜置 (enzyme rest)(糖化靜置)。這些酶靜置耗費(fèi)時間，且趨于在釀造方法中造成瓶頸，從而對于最大效率和成本效益的糖化方法而言，酶靜置時間應(yīng)盡可能地短。
然而，在糖化中淀粉降解的效力取決于例如酶靜置的時間和溫度，淀粉本身(類型，麥芽度等)和醪中淀粉降解酶的水平和活性。當(dāng)?shù)矸圻_(dá)到糊化溫度，即當(dāng)?shù)矸蹖τ诘矸勖付允峭耆山咏臏囟?，通常約58-62°C時，淀粉水解進(jìn)展非常迅速。在此溫度，α-淀粉酶相對穩(wěn)定，而β-淀粉酶和脫支酶如支鏈淀粉酶最為熱不穩(wěn)定并開始失活。因此，糖化方法一般采用受控的逐步溫度增加，其中每一步相對于其它酶來說有利于一種酶作用，最終降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁和淀粉。因此，在釀造中，糖化是非常耗費(fèi)時間的步驟。大多數(shù)糖化方法耗費(fèi)至少90分鐘，并包括在約45-52°C，約62°C和約72°C的靜置。
溫度和酶靜置長度的組合影響麥芽汁中可發(fā)酵糖對不可發(fā)酵糖的比例并因此影響麥芽汁的可發(fā)酵性和發(fā)酵飲料的最終味道和芳香(aroma)。
W02005121305描述了糖化方法，其中添加酶α -淀粉酶、葡糖淀粉酶和異淀粉酶的組合以產(chǎn)生可發(fā)酵為低糖飲料的麥芽汁。
W02007144393描述了用于產(chǎn)生其中支鏈淀粉酶添加至醪的麥芽汁。
Gregor 等(Journal of Cereal Science, Vol. 29，161-169 頁，1999)描述了糖化方法中淀粉轉(zhuǎn)化酶α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的相互作用。
Odibo 和 Obi 1989,Mircen Journal, 5 (2) 187-192 公開了從高粱麥芽制備醪的方法，包括添加熱穩(wěn)定性微生物支鏈淀粉酶?？偺腔瘯r間為1 分鐘。
存在對改善的方法的需求，由此為了效率和成本利益，糖化時間盡可能地短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過添加熱穩(wěn)定性脫支酶，可縮短或消除在糖化過程中的酶靜置，從而使得產(chǎn)生麥芽汁的方法明顯更快。因此，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生麥芽汁的方法，包括下述步驟 a)將谷物(grist)與水混合， b)添加脫支酶，其中所述脫支酶在641，？!15.0，10分鐘的時間具有60(%以上的酶活性， C)將所述混合物在58-68 V靜置10_40分鐘的時間， d)將所述混合物在72-80 V靜置5-20分鐘的時間，和 e)將麥芽汁與固體組分分離。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法產(chǎn)生的麥芽汁或啤酒。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的酶在任何本發(fā)明的方法中的用途。
除了縮短糖化過程之外，本發(fā)明的酶還可添加至用于產(chǎn)生具有高可發(fā)酵糖量的麥芽汁的方法中。
因此本發(fā)明還涉及產(chǎn)生麥芽汁的方法，包括下述步驟 a)將谷物與水混合，其中所述谷物包含至少50%麥芽， b)添加脫支酶，其中所述脫支酶在641，？!15.0，10分鐘的時間具有60(%以上的酶活性，并將所述混合物在58-68 °C靜置， c)將溫度增加至72-80°C，并將所述混合物在72_80°C靜置，和 d)將麥芽汁與固體組分分離， 其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%。
本發(fā)明還涉及從50-100%麥芽和0-50%含淀粉的輔料(adjunct)制備的麥芽汁， 其中可發(fā)酵糖的量高于可溶性碳水化合物的75%，或由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的麥芽汁，其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量為可溶性碳水化合物的至少75%。
定義 在整個該公開中，使用了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般理解的多個術(shù)語。一些術(shù)語更加寬泛地描述于“發(fā)明詳述”中。下面給出一些頻繁使用的術(shù)語的簡短定義。
在本上下文中，“酶靜置”或簡稱為“靜置”或“放置”是一段時間或時間間隔，其中將谷物和水和任選的輔料的混合物保持在一定溫度，以供酶(內(nèi)源酶和任選的外源酶)作用于淀粉。
如本文中使用的術(shù)語“谷物”理解為含有糖的材料，其為啤酒生產(chǎn)的基礎(chǔ)，例如，大麥麥芽和輔料。
將術(shù)語“麥芽”理解為任何發(fā)芽的谷類谷粒(malted cereal grain)，特別是大麥。
將術(shù)語“麥芽汁”理解為糖化過程中提取谷物后的未發(fā)酵的液體流出物(liquor run-off)ο 將術(shù)語“啤酒”理解為發(fā)酵的麥芽汁。
術(shù)語“同一性”是兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS =Ilie European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16: 276-277)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來確定的。使用的可選參數(shù)是 缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的 (相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù)) 就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice 等，2000，見上)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，見上)確定。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的 (相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù)) 發(fā)明詳述 在釀造方法中，糖化條件，如溫度、PH和酶量以及這些酶作用于淀粉(例如酶靜置)的時間對發(fā)酵結(jié)果具有巨大影響。在啤酒釀造中，產(chǎn)生的啤酒的類型高度依賴于酶靜置的長度和溫度。
糖化 本發(fā)明人現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過使用熱穩(wěn)定性脫支酶可縮短或消除糖化中的酶靜置。因此本發(fā)明的第一個方面涉及制備麥芽汁的方法，包括下述步驟 一種產(chǎn)生麥芽汁的方法，包括下述步驟 a)將谷物(grist)與水混合， b)添加脫支酶，其中所述脫支酶在641，？!15.0，10分鐘的時間具有60(%以上的酶活性， c)將所述混合物在58-68 V靜置10_40分鐘的時間， d)將所述混合物在72-80 V靜置5-20分鐘的時間，和 e)將麥芽汁與固體組分分離。
在一個實(shí)施方案中，溫度在20分鐘內(nèi)從步驟C)增加至步驟d)。
在另一個實(shí)施方案中，步驟b)_d)在30-70分鐘之內(nèi)完成。
溫度曲線(temperature profile) 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)添加熱穩(wěn)定性脫支酶減少了糖化中酶靜置的長度，和/或消除了所需的酶靜置的量，由此可觀地減少了總體糖化時間。
在本發(fā)明中，根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法的步驟C)的溫度優(yōu)選實(shí)施為 58-680C，如 59-670C，如 60-66°C，如 61-65°C，如 62-64°C，如 63-64°C，優(yōu)選溫度為 63-65°C 如 64 0C ο 所述混合物(其為與水混合的谷物)，在選自上述溫度間隔的溫度靜置10-40分鐘，如11-39分鐘，如12-38分鐘，如13-37分鐘，如14-36分鐘，如15-35分鐘，如16-34分鐘，如17-33分鐘，如18-32分鐘，如19-31分鐘，如20-30分鐘，如21-29分鐘，如22-28分鐘，如23-27分鐘，如M46分鐘，如2546分鐘的時間。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述混合物靜置15-35分鐘，在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物靜置20-30分鐘，在一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物靜置25-30分鐘，在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述混合物靜置15-30分鐘。
在根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法中，步驟C)至步驟d)的溫度優(yōu)選以1°C /分鐘增加。因此在一個實(shí)施方案中，所述溫度在20分鐘之內(nèi)，如在19分鐘之內(nèi)，如在比18分鐘之內(nèi)，如在17分鐘之內(nèi)，如在16分鐘之內(nèi)，如在15如在14分鐘之內(nèi)，如在13分鐘之內(nèi)，如在 12分鐘之內(nèi)，如在11分鐘之內(nèi)，如在10分鐘之內(nèi)，如在9分鐘之內(nèi)，如在8分鐘之內(nèi)，如在 7分鐘之內(nèi)，如在6分鐘之內(nèi)，如在5分鐘之內(nèi)，如在4分鐘之內(nèi)從步驟c)增加至步驟d)。
在步驟d)中，所述混合物在72-80 V，如73-79 V，如74-78 V，如75-78 V，如 76-78°C，優(yōu)選如77-78°C的溫度靜置5_20分鐘的時間，如6_19分鐘的時間，如7_18分鐘的時間，如8-17分鐘的時間，如9-16分鐘的時間，如10-15分鐘的時間，如11-14分鐘的時間，如12-13分鐘的時間，如10-20分鐘，優(yōu)選在該溫度靜置10-15分鐘的時間。
可將所述糖化方法分為三部分預(yù)糖化(mashing in)，其中將磨制的谷物填充于容器并與水混合；糖化，其中內(nèi)源和外源供應(yīng)的酶降解淀粉；和后糖化(mashing out)，其中提升溫度并將混合物轉(zhuǎn)移至濾桶(lauter tun)。
因此在本發(fā)明的一個目標(biāo)中，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的方法的糖化，即步驟 b) -d)在30-70分鐘之內(nèi)，如31-69分鐘之內(nèi)，如32-67分鐘之內(nèi)，如33-66分鐘之內(nèi)，如 34-65分鐘之內(nèi)，如35-64分鐘之內(nèi)，如36-63分鐘之內(nèi)，如37-62分鐘之內(nèi)，如38_61分鐘之內(nèi)，如39-60分鐘之內(nèi)，如40-59分鐘之內(nèi)，如41-58分鐘之內(nèi)，如42-57分鐘之內(nèi)，如43-56 分鐘之內(nèi)，如44-55分鐘之內(nèi)，如45-54分鐘之內(nèi)，如46-53分鐘之內(nèi)，如47-52分鐘之內(nèi)， 如48-51分鐘之內(nèi)，如49-50分鐘之內(nèi)完成。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖化在70分鐘之內(nèi)，更優(yōu)選60分鐘之內(nèi)，更優(yōu)選50分鐘之內(nèi)，甚至更優(yōu)選40分鐘之內(nèi)或更優(yōu)選30分鐘之內(nèi)完成。
因此在該上下文中，糖化時間包括所有的酶靜置和所有加熱步驟，如本發(fā)明產(chǎn)生麥芽汁的方法的所有步驟b)_d)在上述限定的該期間之內(nèi)完成。
在某個方面，根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法在30-70分鐘之內(nèi)完成。換言之，所有步驟a) -e)在30-70分鐘之內(nèi)，如40-60分鐘，如60分鐘之內(nèi)，如50分鐘之內(nèi)和如45分鐘之內(nèi)完成。
因此根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，無需45-52°C的靜置。
在該上下文中，在糖化方法中消耗的時間與總糖化時間和完成本發(fā)明方法的所有糖化步驟例如步驟b)-d)所需的時間相同。糖化曲線(mashing profile)、糖化、糖化過程、 糖化時間和糖化方法可互換使用。
熱穩(wěn)定的 在該上下文中，熱穩(wěn)定的酶是在64°C和pH水平5在10分鐘之后具有60%以上酶活性的酶。
在一個實(shí)施方案中，在64°C，pH 5.0，在10分鐘的時間所述酶活性為60%以上，如 61%以上，如62%以上，如63%以上，如64%以上，如65%以上，如66%以上，如67%以上， 如68%以上，如69%以上，如70%以上，如71%以上，如72%以上，如73%以上，如74%以上，如75%以上，如76%以上，如77%以上，如78%以上，如79%以上，如80%以上，如81% 以上，如82%以上，如83%以上，如84%以上，如85%以上，如86%以上，如87%以上，如 88%以上，如89%以上，如90%以上，如91%以上，如92%以上，如93%以上，如94%以上， 如95%以上，如96%以上，如97%以上，如98%以上，如99%以上和甚至100%。
在本發(fā)明一個具體實(shí)施方案中，所述酶在64°C和pH水平5. 6-6. 2在醪中10分鐘之后，具有最少80%的活性，如85%以上，如90%以上如95%以上，或甚至100%的活性。 應(yīng)注意在糖化過程中醪的PH的范圍是5. 6-6. 2。更具體而言，其范圍為5. 6至5. 8。
在另一個實(shí)施方案中，所述酶在大麥麥芽的糊化溫度10分鐘之后具有至少80% 的活性，如85%以上，如90%以上如95%以上或甚至100%的活性。
谷物 根據(jù)本發(fā)明，所述谷物可包含任何可從任何植物和植物部分包括塊莖、根、莖、葉和種子獲得的淀粉。優(yōu)選所述谷物包含谷粒(grain)如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、 稻、買羅高粱(milo)、黍(millet)和高粱的谷粒，且更優(yōu)選地，麥芽汁的谷物的至少50%， 如至少60%，如至少70%，如至少80%，如至少90%或甚至100% (w/w)來源于谷粒。
根據(jù)本發(fā)明第一個方面的谷物包含含淀粉的發(fā)芽谷粒和/或輔料。所述谷物可優(yōu)選包含0%至100%，優(yōu)選20%至100%，優(yōu)選30%至100%，更優(yōu)選40%至100%，甚至更優(yōu)選50%至100%，還更優(yōu)選60%至100%，如70%至100%，如80%至100%或甚至最優(yōu)選90 %至100 %的發(fā)芽谷粒。在一個具體實(shí)施方案中，所述谷物包含至少50 %發(fā)芽谷粒，例如發(fā)芽大麥，和大約50%輔料，例如未發(fā)芽谷粒如未發(fā)芽大麥，在另一個實(shí)施方案中，所述谷物包含至少60 %發(fā)芽谷粒，還在另一個實(shí)施方案中，所述谷物包含至少70 %發(fā)芽谷粒， 在一個具體實(shí)施方案中，所述谷物包含至少80%發(fā)芽谷粒，或甚至更優(yōu)選地所述谷物包含至少90 %發(fā)芽谷?；蛏踔粮鼉?yōu)選地所述谷物包含至少95 %發(fā)芽谷粒，且在某些優(yōu)選實(shí)施方案中所述谷物包含100%發(fā)芽谷粒。100%發(fā)芽在該上下文中是指“全部發(fā)芽”。因此全麥芽醪是包含100%發(fā)芽谷粒的醪。根據(jù)本發(fā)明使用的谷?？蔀槿魏喂攘＃覂?yōu)選為選自如下發(fā)芽谷粒發(fā)芽的大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻，且最優(yōu)選發(fā)芽的大麥。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用預(yù)糊化的淀粉，如來自大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻的預(yù)糊化淀粉。
用于本發(fā)明方法中的谷?？捎尚揎検侄涡揎棧了龉攘Ｖ械牡矸鄯肿佑珊唵捂溙欠肿佣侵Щ溙欠肿咏M成的程度，完全修飾的谷粒僅含有簡單鏈淀粉分子。未經(jīng)完全修飾的谷粒需要在多步驟中糖化以供脫支酶作用于分支。因此在本發(fā)明的一個方面，所述谷物包含良好修飾的發(fā)芽谷粒。
發(fā)麥芽是谷類谷粒(cereal grain)萌發(fā)的過程，其通常通過將所述谷粒浸于水中來起始。該過程可通過用熱空氣的干燥加熱來停止。因此術(shù)語“麥芽”理解為任何發(fā)芽的谷類谷粒，根據(jù)本發(fā)明使用的發(fā)芽的谷?？蔀槿魏伟l(fā)芽的谷粒，且優(yōu)選為選自發(fā)芽的大麥、 小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻的發(fā)芽谷粒，且最優(yōu)選發(fā)芽的大麥。
麥芽的良好品質(zhì)會給釀造者提供高水平的提取物，并產(chǎn)生容易通過酵母發(fā)酵的麥芽汁。
因此在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，起始材料為全麥芽醪，在該上下文中是100%發(fā)芽的谷粒。
MM 將輔料理解為谷物并非發(fā)芽谷粒的部分。所述輔料可包含任何富淀粉植物材料， 例如未發(fā)芽的谷粒，如大麥、稻、玉米、小麥、黑麥、高粱和容易發(fā)酵的糖和/或糖漿。用于第一個方面的方法中的輔料可從塊莖、根、莖、葉、豆類、谷類和/或全谷粒獲取。輔料可包含含粗淀粉和/或精制淀粉和/或糖的材料，其來源于植物像小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻、 買羅高粱、黍、高粱、馬鈴薯、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、樹薯(tapioca)、西米 (sago)、香蕉、糖甜菜和/或甘蔗。優(yōu)選地，輔料包含未發(fā)芽的谷粒，例如選自下組的未發(fā)芽谷粒大麥、小麥、黑麥、高粱、黍、玉米和稻，且最優(yōu)選未發(fā)芽的大麥。
RDF 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的熱穩(wěn)定的脫支酶添加于用于產(chǎn)生麥芽汁的方法，其中起始材料為具有至少50%麥芽的谷物，且產(chǎn)生的麥芽汁中的可發(fā)酵糖為至少 75%可發(fā)酵糖。
因此本發(fā)明的另一個方面涉及一種方法，包含下述步驟 a)將谷物與水混合，其中所述谷物包含至少50%麥芽， b)添加脫支酶，其中所述脫支酶在641，？!15.0，10分鐘的時間具有60(%以上的酶活性，并將所述混合物在58-68 °C靜置， c)將溫度增加至72-80°C，并將所述混合物在72-80°C靜置，和 d)將麥芽汁與固體組分分離， 其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量為多于可溶性碳水化合物的75%。
可發(fā)酵糖和不可發(fā)酵糖 在糖化循環(huán)過程中，首先將淀粉溶解，然后將一部分淀粉分子水解為不可發(fā)酵的糊精和釀造酵母可發(fā)酵為乙醇的低分子量糖如葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖。不可發(fā)酵的或極限糊精級分是比麥芽三糖具有更高聚合度(DP)的糖，其為DP4或更高。在糖化方法過程中，糊精通過β-淀粉酶水解為可發(fā)酵糖，所述β-淀粉酶從糊精的非還原端順序去除麥芽糖單元。然而，(1 —6)_α支化點(diǎn)耐受淀粉酶的攻擊，而這些支化點(diǎn)需由脫支酶(極限糊精)如支鏈淀粉酶、極限糊精酶和異淀粉酶水解。
DP是聚合度，本文中用于多糖水解物中聚合物中葡萄糖單元的平均數(shù)。因此 DP1-3糖根據(jù)本發(fā)明是可為葡萄糖(DPI)、麥芽糖(DP》或麥芽三糖(DP3)的可發(fā)酵糖，而例如糊精(DP4)是不可發(fā)酵(或非可發(fā)酵)糖。
RDF (發(fā)酵實(shí)際程度)計算為RDF%= 100* (0E% P_ER% )/0E% P，而OE意指以％ P表示的起始提取物，而ER意指由密度計(Analytica EBC參照)測量的實(shí)際提取物％ P。
根據(jù)本發(fā)明，麥芽汁中可發(fā)酵糖的量為多于75%的可溶性碳水化合物，如至少 76 %，如至少77 %，如至少78 %，如至少79 %，如至少80 %，如至少81%,如至少82 %，如至少83 %，如至少84 %，如至少85 %，如至少86 %，如至少87 %，如至少88 %，如至少89 %，如至少90 %，如至少91 %，如至少92 %，如至少93 %，如至少94 %，如至少95 %，如至少96 %， 如至少97%，如至少98%，如至少99%，如至少100%。
一些釀造廠將釀造糖漿(brewery syrup)，例如高麥芽糖釀造糖漿添加至煮麥芽汁鍋(wort kettle)中，其可增加可發(fā)酵糖的量。然而，盡管根據(jù)本發(fā)明可添加釀造糖漿， 對于增加可發(fā)酵糖的量或RDF這并非必需的。
在糖化方法過程中，淀粉轉(zhuǎn)化為包含可發(fā)酵和不可發(fā)酵糖的麥芽汁。根據(jù)本發(fā)明， 可顯著地縮短糖化方法，并使得釀造廠能夠使用非常簡單的糖化曲線而不降低麥芽汁中的可發(fā)酵性。舉例而言，不再需要在45-52°C的糖化步驟來產(chǎn)生其中可發(fā)酵糖量多于可溶性碳水化合物的75%的麥芽汁。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的脫支酶可用于產(chǎn)生麥芽汁的方法，其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量多于75%的可溶性碳水化合物，其中所述方法包括下述步驟 a)將谷物與水混合，其中所述谷物包含至少50%的麥芽， b)添加熱穩(wěn)定的脫支酶， c)將所述混合物在58-68 V靜置10_40分鐘的時間， d)將溫度增加至72_80°C， e)將所述混合物在72-80 V靜置5_20分鐘的時間，和 f)將麥芽汁與固體組分分離。
其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%。
重要的是，本發(fā)明的方法涉及通過減少或消除酶靜置所需的時間來縮短糖化過程，并且產(chǎn)生包含高可發(fā)酵糖量的麥芽汁。
因此，根據(jù)本發(fā)明，縮短糖化時間并未減少麥芽汁的可發(fā)酵性，也就是說，麥芽汁中可發(fā)酵糖的量與不可發(fā)酵糖的量相比是高的。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法產(chǎn)生具有相對于葡萄糖的高量麥芽糖的麥芽汁。這是有利的，因?yàn)槠渥柚沽藢湍傅臐B透壓，并調(diào)節(jié)酯產(chǎn)生，并因此調(diào)節(jié)最終啤酒的味道和芳香概貌。
因此本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及方法，其中麥芽汁中麥芽糖葡萄糖的比例高于2 1，如高于2. 5 1，如高于3 1，優(yōu)選高于3. 2 1，優(yōu)選高于3. 3 1，優(yōu)選高于 3.4 1，優(yōu)選高于3.5 1，在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，麥芽汁中麥芽糖葡萄糖的比例高于3. 3 1。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從50-100%麥芽和0-50%含淀粉輔料制備的麥芽汁，其中可發(fā)酵糖的量高于可溶性碳水化合物的75%，優(yōu)選高于80%，且其中麥芽糖葡萄糖比例高于2. 5 1，優(yōu)選高于3. 3 1。
又一個實(shí)施方案涉及由本發(fā)明方法產(chǎn)生的麥芽汁，其中麥芽汁中的可發(fā)酵糖為可溶性碳水化合物的至少75%。
脫支酶 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，外源提供支鏈淀粉酶(E.C.3.2. 1.41)酶活性并使其存在于醪中?？稍谛纬甚仓?、過程中或之后將支鏈淀粉酶添加于醪成分，例如水和 /或谷物?？蓪⒘硪环N酶添加至醪，所述酶選自下組淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)和/或葡糖淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 3)、異淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、β -葡聚糖酶、木聚糖酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、非汀(Phytin)和酯酶。
然而，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法例如短糖化可僅用本發(fā)明的脫支酶實(shí)施。因此在本發(fā)明的一個方面僅將脫支酶添加至醪。
本發(fā)明的脫支酶包括異淀粉酶和支鏈淀粉酶。脫支酶，其攻擊膠淀粉(amylopectin)，可分為兩類分別為異淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 68)和支鏈淀粉酶 (E. C. 3. 2. 1. 41)。異淀粉酶水解膠淀粉和β-極限糊精中的a-l，6-D-葡糖苷分支鍵 (branch linkage)，并可因異淀粉酶不能攻擊支鏈淀粉(pullulan)，以及對α -極限糊精的有限作用來與支鏈淀粉酶相區(qū)分。
支鏈淀粉酶(Ε.C. 3. 2. 1. 41) 最優(yōu)選所述支鏈淀粉酶來源于酸解支鏈淀粉芽孢桿菌 (Bacillusacidopullulyticus)。待用于本發(fā)明方法和/或組合物中的優(yōu)選支鏈淀粉酶是具有與SEQ ID NO :1中所示的序列至少50%，如至少55%，如至少60%，如至少65%，如至少66 %，如至少70 %，如至少75 %，如至少80 %，如至少85 %，如至少86 %，如至少87 %，如至少88 %，如至少89 %，如至少90 %，如至少91 %，如至少92 %，如至少93 %，如至少94 %， 如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%或甚至100%相同的氨基酸序列的支鏈淀粉酶；特別是當(dāng)使用Needle程序使用矩陣BL0SUM62 ；缺口起始罰分 10. 0 ；缺口延伸罰分0. 5 ；無缺口同一性矩陣時如此。
用于本發(fā)明的方法中的支鏈淀粉酶優(yōu)選來自例如火球菌屬(Pyrococcus)或芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種，如酸解支鏈淀粉芽孢桿菌(例如，F(xiàn)EMSMicrobiol. Letters 115 :97-106 中所描述的)或 Bacillus deramificans,或長野芽孢桿菌(Bacillus naganoencis)。所述支鏈淀粉酶也可是來自例如芽孢桿菌屬菌株的工程改造的支鏈淀粉酶。
優(yōu)選用于本發(fā)明的方法的其它支鏈淀粉酶包括Bacillus deramif icans (美國專利5，736，375號)，或支鏈淀粉酶可來源于PCT/DK91/00219中描述的沃氏火球菌 (Pyrococcus woesei)，或者支鏈淀粉酶可來源于PCT/DK92/00079中描述的閃爍桿菌屬菌種 Ven 5 (Fervidobacterium sp. Ven 5)，或者支鏈淀粉酶可來源于 PCT/DK95/00097 中描述的速生熱球菌(Thermococcus celer)，或者支鏈淀粉酶可來源于PCT/DK95/00211 中描述的Pyrodictium abyssei，或者支鏈淀粉酶可來源于PCT/DK95/00095中描述的 Fervidobacterium pennavorans,或者支鏈淀粉酶可來源于PCT/DK95/00098中描述的 Desulforococcus mucosus。
所述支鏈淀粉酶是以0. 1至3PUN/g DM，如0.2至2.9，如0.3至2.8，如0.3至2.7， 如 0. 3 至 2. 6，如 0. 3 至 2. 5，如 0. 3 至 2. 4，如 0. 3 至 2. 3，如 0. 3 至 2. 2，如 0. 3 至 2. 1，如 0. 3至2. O,如0. 3至1. 9，如0. 3至1. 8，如0. 3至1. 7，如0. 3至1. 6的劑量添加，最優(yōu)選支鏈淀粉酶是以如0. 3至1. 5，優(yōu)選0. 4至1. 4，更優(yōu)選0. 5至1. 3，更優(yōu)選0. 6至1. 2，更優(yōu)選0.7至1. 1，更優(yōu)選0.8至1.0，更優(yōu)選0.9至1.0的劑量添加。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，所述酶以0. 3PUN/g DM，如0. 4PUN/g DM，如0. 5PUN/g DM添加。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶劑量不大于lPUN/g DM。
異淀粉酶(E.C. 3. 2. L 68) 本發(fā)明方法和/或組合物中應(yīng)用的另一種酶可為另一種脫支酶，如異淀粉酶 (E. C. 3. 2. 1. 68)。異淀粉酶可為微生物的。異淀粉酶水解膠淀粉和β -極限糊精中的α -1， 6-D-葡糖苷分支鍵，并可因異淀粉酶不能攻擊支鏈淀粉(pullulan)，以及對α -極限糊精的有限作用來與支鏈淀粉酶相區(qū)分。異淀粉酶可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有效量添加。 異淀粉酶可以單獨(dú)添加或與支鏈淀粉酶一起添加。
任選的酶 α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1) α-淀粉酶酶還可為外源、微生物的，并添加于本發(fā)明的方法和/或組合物。α -淀粉酶可為芽孢桿菌屬α-淀粉酶。公知的芽孢桿菌屬α-淀粉酶包括源自地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophi Ius)的菌株的α-淀粉酶。在本發(fā)明的上下文中，涵蓋的芽孢桿菌屬α-淀粉酶是WO 99/19467第3頁第18行至第6頁第27行中所定義的α-淀粉酶。優(yōu)選的α -淀粉酶具有氨基酸序列，其與W099/19467中SEQ ID NO :4具有至少90%，如至少 92 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或者特別是至少99 %同一性。最優(yōu)選的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶是WO 99/43794中公開的SEQ ID NO :9或包括其變體。涵蓋的變體和雜合體在WO 96/23874、W0 97/41213和WO 99/19467中描述。特別涵蓋的是來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α -淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)，其具有WO 99/19467中SEQID NO 3所公開的氨基酸序列及突變I181*+G182*+N193F。芽孢桿菌屬α -淀粉酶可以以1. 0-1000NU/kg DS，優(yōu)選2. 0-500NU/kg DS，優(yōu)選10-200NU/kg DS的量加入。本發(fā)明的方法使用的另一種特定的 α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶。例如，源自曲霉屬(Aspergillus)菌種的α -淀粉酶，并且優(yōu)選來自黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。特別涵蓋的是與WO 2002/038787 中SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列顯示高同一性，即至少50%，至少55%，至少60%，至少 65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %或者甚至至少90 %同一性的真菌α -淀粉酶。真菌 α-淀粉酶可以以 l-1000AFAU/kg DS，優(yōu)選 2_500AFAU/kg DS，優(yōu)選 20-100AFAU/ kg DS的量加入。
葡糖淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 3) 可用于本發(fā)明方法中的葡糖淀粉酶可來源于微生物或植物。優(yōu)選的是真菌來源的葡糖淀粉酶如曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)， EMBO J. 3(5)，p. 1097-1102)。還優(yōu)選其變體，如 W092/00381 和 W000/04136 中公開的 泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(W084/02921),米曲霉(Agric. Biol. Chem. (1991)， 55(4), p. 941-949)或其變體或片段。優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括來源于黑曲霉的葡糖淀粉 _，如與 W000/04136 中所述的氨基酸序列具有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%或甚至90%同源性的葡糖淀粉酶和SEQ ID N0:13。還優(yōu)選來源于米曲霉的葡糖淀粉酶，如與W000/04136 SEQ ID NO :2中所列的氨基酸序列具有50 %、55 %、60 %、65 %、 70%、75(%、80(%、85(%或甚至90(%同源性的葡糖淀粉酶。其它優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括包括踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是來源于埃默森踝節(jié)菌(Talaromyces emersonii) (ffO 99/28448)、Talaromyces Ieycettanus (美國專利 Re. 32，153 號)、杜邦踝節(jié)菌(Talaromycesduponti)、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)(美國專禾丨J 4，587，215號)的葡糖淀粉酶，梭菌屬(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特別是熱解淀粉梭菌(C. thermoamylolyticum) (EP135’ 138)禾口熱硫化氫梭菌(C. thermohydrοsu 1 furicum) (TO86/01831)的葡糖淀粉_。商業(yè)上可獲得的包含葡糖淀粉酶的組合物包括AMG 200L ； AMG 300L ；SAN SUPER, SAN EXTRA L 禾口 AMG E (來自 Novozymes A/S) ；0PTIDEX 300 (來自 Genencor Int.) ；AMIGASE 禾口 AMIGASE PLUS (來自 DSM) ；G-ZYME G900、G-ZYME 和 G990ZR(來自Genencor Int.)。葡糖淀粉酶活性可以以0. 1至100000AGU/kg DS的量，優(yōu)選以1至10000A⑶/kg DS的量，更優(yōu)選以10至1000A⑶/kg DS的量，如100至500AGU/kg DS的量使用。葡糖淀粉酶可以以O(shè).OOlmg至100000mgEP/kg DS的量，優(yōu)選以0. Olmg至 IOOOOmg EP/kg DS的量，更優(yōu)選以0. Img至IOOOmg EP/kg DS的量，最優(yōu)選以Img至IOOmg EP/kg DS的量添加。
蛋白酶 合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和細(xì)菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通過在PH 7以下的酸性條件下水解蛋白質(zhì)的能力表征的蛋白酶。
蛋白酶負(fù)責(zé)在醪中將全長的高分子量蛋白降解成低分子量蛋白。低分子量蛋白對于酵母的營養(yǎng)是必需的，而高分子量蛋白保證泡沫穩(wěn)定性。因此技術(shù)人員熟知蛋白酶應(yīng)該以平衡量加入，同時為酵母提供緩慢(amble)游離氨基酸并且保留足夠的高分子量蛋白以使泡沫穩(wěn)定化?？梢砸?. l-1000AU/kg DS，優(yōu)選l-100AU/kg DS并且最優(yōu)選5_25AU/kg DS 的量加入蛋白酶。
纖維素酶(E.C. 3. 2. 1. 4) 纖維素酶可以是微生物來源的，如源自絲狀真菌(例如，曲霉屬、木霉屬 (Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium))的菌株。纖維素酶的具體實(shí)例包括從特異腐質(zhì)霉(H. insolens)可獲得的內(nèi)切葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶I)，其還由WO 91/17244中

圖14的氨基酸序列定義，和WO 91/17243中所述的43kD特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶。
本發(fā)明的方法中使用的特定纖維素酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶，如內(nèi)切-1，4-β -葡聚糖酶。特別涵蓋的是WO 2003/062409中SEQ ID NO :2中所示的葡聚糖酶和同源序列?？梢允褂玫纳虡I(yè)上可獲得的纖維素酶制備物包括 CELLUCLAST 、CELLUZYME 、CEREFLO 和 ULTRAFLO (可從 Novozymes A/S 獲得)，LAMINEX 和SPEZYMETM CP(可從 Genencor Int.獲得)和 ROHAMENT 7069W(可從R0hm, Germany 獲得)。可以以 1. 0-10000B⑶/kg DS,優(yōu)選 10-5000BGU/kg DS，優(yōu)選 50-1000B ⑶/kg DS 和最優(yōu)選 100_500BGU/kg DS 的量加入 β-葡聚糖酶。
麥芽汁的分離 從醪獲得麥芽汁通常包括將麥芽汁與固體組分如酒糟分離，即構(gòu)成谷物部分的不溶性谷粒和殼材料?？蓪崴鹘?jīng)所述酒糟以潤洗或噴灑任何來自谷物的殘余提取物。
在從任何前述第一方面的實(shí)施方案的谷物的酒糟分離麥芽汁之后，可按原樣(as it is)使用麥芽汁將其脫水以提供濃縮和/或干燥的麥芽汁。濃縮和/或干燥的麥芽汁可用作釀造提取物、用作麥芽提取物調(diào)味料、用于非酒精麥芽飲料、麥芽醋、早餐谷類、用于糖果店等。
啤酒的產(chǎn)生 在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵麥芽汁以產(chǎn)生酒精飲料，優(yōu)選為啤酒例如愛兒啤酒 (ale)、烈性愛兒啤酒(strong ale)、苦味酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porter)、陳貯啤酒(lager)、Export啤酒、麥芽酒(malt liquor)、大麥酒、低麥芽啤酒 (happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。麥芽汁的發(fā)酵可包括向麥芽汁中投入 (pitch with)酵母漿料，該漿料包含新鮮酵母(即先前未用于本發(fā)明的酵母)或者所述酵母可以是回收的酵母。應(yīng)用的酵母可以是適于啤酒釀造的任何酵母，特別是選自酵母屬菌種(Saccharomyces spp.)的酵母，如酸酒酵母(S. cerevisiae)禾口葡萄汁酵母(S. uvarum)， 其包括這些生物體的天然或人工產(chǎn)生的變體。用于產(chǎn)生啤酒的麥芽汁的發(fā)酵方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明的方法可包括向發(fā)酵麥芽汁中加入二氧化硅水凝膠(silicahydrogel)，以增加啤酒的膠質(zhì)穩(wěn)定性(colloidal stability)。這些方法還可以包括向發(fā)酵的麥芽汁中加入硅藻土(kieselguhr)并過濾以使啤酒鮮亮(bright)。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供由第二或第三方面的麥芽汁產(chǎn)生的啤酒，如通過將麥芽汁發(fā)酵以產(chǎn)生啤酒而產(chǎn)生的啤酒。啤酒可以是任何類型的啤酒，例如，愛兒啤酒、烈性愛兒啤酒、烈性黑啤酒、缽爾透黑啤酒、陳貯啤酒、苦味酒、Export啤酒、麥芽酒、低麥芽啤酒、高醇啤酒、低醇啤酒、低熱量啤酒或清淡啤酒。
實(shí)施例 支鏈淀粉酶活件(PUN) 一個支鏈淀粉酶單位(PUN)定義為在pH 5檸檬酸鹽緩沖液中，在50°C能從支鏈淀粉底物每分鐘形成1微摩爾葡萄糖的酶量。
支鏈淀粉酶樣品和底物(紅色支鏈淀粉)一起溫育。內(nèi)切支鏈淀粉酶水解支鏈淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，釋放底物降解產(chǎn)物。使用乙醇將未降解的底物沉淀。在510nm用分光光度法測定釋放顏色的量，其與樣品中的內(nèi)切-支鏈淀粉酶活性成比例。將樣品的顏色形成與由支鏈淀粉酶活性已知的樣品產(chǎn)生的顏色形成相比較。
支鏈淀粉酶是支鏈淀粉6-葡聚糖-水解酶，酶分類號為E. C. 3. 2. 1. 41。
反應(yīng)條件 試劑/底物 氯化鉀溶液0. 5M 支鏈淀粉底物2%。供應(yīng)商為Megazyme，Australia 檸檬酸鹽緩沖液0. 05M pH 5. 0 包括25mM半胱氨酸的檸檬酸鹽緩沖液0. 05M pH 5. 0 乙醇 99. 8% 將904PUN/g的支鏈淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品制備物在檸檬酸鹽緩沖液0.05M中稀釋成 0. 05-0. 20PUN/ml的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液系列。
空白檸檬酸鹽緩沖液0.05M 將酶樣品在檸檬酸鹽緩沖液0. 05M中稀釋至活性為0. 06-0. 20PUN/ml，并與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液系列比較。
實(shí)施例1 在該實(shí)施例中，在64°C 15分鐘和30分鐘之后以及在78°C 15分鐘之后研究了縮短的糖化過程的糖分布。以rc /分鐘進(jìn)行了從64°C至78°C的加熱，因此在該情況下，在14
溫度 pH
50°C ±2°C 5.0
0.67%紅色支鏈淀粉 0.04-0.13 PUN/mL 30分鐘 510 nm
底物濃度酶濃度反應(yīng)時間波長分鐘之內(nèi)加熱醪。在該情況下總糖化時間為在64°C靜置30分鐘+用14分鐘加熱至78°C + 在78°C靜置15分鐘，總糖化時間為59分鐘。
使用100%良好修飾的麥芽，而使用的酶是具有SEQ ID NO 1的支鏈淀粉酶。
用于該實(shí)施例的支鏈淀粉酶是具有SEQ ID NO 1的支鏈淀粉酶，其在t = 0分鐘 (糖化開始)以下面指示的濃度添加。
糖化分布和樣品收集
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生麥芽汁的方法，包括下述步驟a)將谷物與水混合，b)添加脫支酶，其中所述脫支酶在64°C，pH5.0，10分鐘的時間具有60%以上的酶活性，c)將所述混合物在58-68°C靜置10-40分鐘的時間，d)將所述混合物在72-80°C靜置5-20分鐘的時間，和e)將麥芽汁與固體組分分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中溫度在20分鐘之內(nèi)從步驟c)增加至步驟d)。
3.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述谷物包含至少50%麥芽。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中麥芽汁中可發(fā)酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%0
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟b)-d)在30-70分鐘之內(nèi)完成。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述脫支酶為支鏈淀粉酶。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述支鏈淀粉酶來源于芽孢桿菌屬 (Bacillus)。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述支鏈淀粉酶具有與SEQIDNO 1至少 80%相同的氨基酸序列。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述麥芽是大麥麥芽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述麥芽汁中可發(fā)酵糖的量高于可溶性碳水化合物的 80%。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述麥芽汁中麥芽糖葡萄糖的比例高于 2 I0
12.—種產(chǎn)生啤酒的方法，包括產(chǎn)生根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的麥芽汁，并發(fā)酵該麥芽汁。
全文摘要
一種產(chǎn)生麥芽汁的方法，包括下述步驟將谷物與水混合，添加脫支酶，其中所述脫支酶在64℃，pH5.0，10分鐘的時間具有60％以上的酶活性，將所述混合物在58-68℃靜置10-40分鐘的時間，將所述混合物在72-80℃靜置5-20分鐘的時間，和將麥芽汁與固體組分分離。
文檔編號C12C5/00GK102186965SQ200980140696
公開日2011年9月14日 申請日期2009年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者斯蒂芬·克賴茨, 安妮·M·弗雷德里克森 申請人:諾維信公司