專利名稱：生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素的添加劑的方法、以及添加劑及其用途的制作方法
生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素的添加劑的方法、以及添加劑
及其用途本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素、特別是伏馬菌素(Fumonisin)的添加劑的方法，用于酶促降解植物原料和含有植物原料的混合物中的真菌毒素、特別是伏馬菌素的添加劑，以及基因的用途。
真菌毒素很經(jīng)常地出現(xiàn)在農(nóng)業(yè)植物產(chǎn)品中，并且取決于真菌毒素的種類，其引起嚴重的經(jīng)濟損害(尤其在由所述農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的食品中以及在以此類食品喂養(yǎng)的動物或人中)，其中所述損害是極其多樣化的。已開發(fā)了大量的方法，試圖將所述真菌毒素解毒或降解，或者使其無害，從而抑制真菌毒素在動物和人的營養(yǎng)、動物飼養(yǎng)，食品與飼料加工等領(lǐng)域造成的損害。在已知的真菌毒素中存在數(shù)種結(jié)構(gòu)上相互關(guān)聯(lián)的真菌毒素，例如伏馬菌素，其中伏馬菌素Bl是該組中最常出現(xiàn)的毒素。然而，已知有大量的衍生物及相關(guān)分子也在人和動物中具有有毒的效應。已知伏馬菌素通過與神經(jīng)酰胺合酶相作用而損害鞘脂代謝。鞘脂不僅是細胞膜的成分，也作為信號和信使分子在許多基本的細胞過程(例如細胞生長，細胞遷移和細胞結(jié)合)中、在炎癥過程中和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。由于對鞘脂代謝的此種損害，伏馬菌素被認為對各種動物品種以及人中的有毒效應負責。已表明伏馬菌素在嚙齒類動物中有致癌效應，并且根據(jù)流行病學數(shù)據(jù)，已將它們與人的食管癌和神經(jīng)管缺陷相關(guān)聯(lián)。伏馬菌素被認為對于在各種動物(例如豬)中由肺水腫引起的典型的中毒負責。在此情形中，伏馬菌素是各種谷類作物中幾乎普遍存在的污染源，尤其是在玉米及堅果和蔬菜中，此種與人和動物健康相關(guān)的嚴重負面效應是不能被忽視的。伏馬菌素的微生物降解已在EP-A1860954中被描述，根據(jù)所述描述，使用微生物對伏馬菌素及其衍生物進行解毒，其中向飼料中加入選自準確確定的株系的、用于對伏馬菌素進行解毒的解毒性細菌或酵母。生物降解伏馬菌素的分解代謝的代謝途徑，以及對其負責的基因和酶也已被描述。例如，EP 0988383描述了對伏馬菌素進行解毒的組合物和方法，其中所使用的降解伏馬菌素的酶主要在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)，在所述植物中對伏馬菌素的解毒借助于需要分子氧用于其酶活性的氨基氧化酶來實現(xiàn)。此外，WO 2004/085624描述了轉(zhuǎn)氨酶，脫氨酶和氨基變位酶以及用于酶促解毒的組合物和方法，從而特別是對胺化了的毒素(例如伏馬菌素)進行解毒。在此情形中，利用具有脫氨酶活性的多肽來進行解毒。但是，迄今為止已知的方法中共同的是，為了對真菌毒素進行解毒，所述方法需要分子氧用于所述的分解代謝代謝途徑，其中所特別需要的氨基氧化酶在不依賴于氧的條件下不能起作用。使用此種基因和酶來對飼料進行解毒，例如在動物的消化道中，由于動物消化道中基本上無氧的環(huán)境是不可能的，或者所述已知的基因和酶不顯示任何效果。因而，現(xiàn)在本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素的添加劑的方法， 通過所述方法可以安全可靠地將真菌毒素、特別是伏馬菌素降解為毒理學上無害的物質(zhì)， 或?qū)φ婢舅?、特別是伏馬菌素進行解毒。
為了解決此任務，根據(jù)本發(fā)明的方法以如下方式進行提供至少一個對應于序列 ID Nos 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一個核苷酸序列在原核或真核宿主細胞中表達，且至少一種由此制備的、對應于序列ID Nos 3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一種完整的重組宿主生物體，任選地與共底物一起，被用于植物原料中。通過提供至少一種對應于以下序列ID Nos 1、2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22和24的基因的核酸序列，可以克隆和表達特定的降解伏馬菌素或真菌毒素的基因，從而例如，所述表達通過標準方法在E. coli和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) 中進行，通過所述表達將能夠獲得對應于序列ID Nos 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和 25的酶或者以及完整的重組宿主生物體，從而所述至少一種酶任選地與共底物一起被用于待處理的原料。以根據(jù)此類方法生產(chǎn)的添加劑，可以一方面例如，直接在原料中完全地和可靠地降解真菌毒素，從而用通過此方法生產(chǎn)的特定的酶來催化伏馬菌素和降解途徑的中間產(chǎn)物的降解；且另一方面，也可以例如直接在生物乙醇生產(chǎn)中、在用于醇生產(chǎn)的糊狀物 (Maische)中降解真菌毒素，或者以及在生產(chǎn)食品時直接在生產(chǎn)過程中降解真菌毒素或使其無害。此處，植物原料理解為谷物或谷物產(chǎn)品、草、水果或蔬菜，以及含有用于生產(chǎn)食品和飼料的此類物質(zhì)的中間產(chǎn)物，例如青貯飼料、水果泥或類似物。添加劑被理解為特別是飼料添加劑、食品添加劑以及用于生物乙醇生產(chǎn)的添加劑。 通過此類方法還可以使通過伏馬菌素與神經(jīng)酰胺合酶的相互作用而被損害的鞘脂代謝得到維護，且與此同時，將伏馬菌素生物性地降解為無毒物質(zhì)。最后，將能夠?qū)崿F(xiàn)解毒的工藝上的應用，因為該方法也可用于更大的工藝規(guī)格中，從而將能夠通過根據(jù)本發(fā)明的方法安全可靠地生產(chǎn)不含真菌毒素的產(chǎn)品。在根據(jù)本發(fā)明的方法中所用的核酸序列，或利用所述核酸序列在原核和真核宿主細胞中表達的、在不依賴于氧的環(huán)境下催化性地起作用的酶如下面所示核酸序列> Seq ID 1 (fum(伏馬菌素分解代謝)基因簇，15420bp)TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTCGCCCACAKCATACATCACAGACRTCGGGATT TCCAACTGAACGGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCCATATGGGTGATTTCGACAATCCGGTTCCA GGCGAAGATGGGTGCGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTGGTCTTGTCCCTGAAAGGTTTTTGGCG TGCAGGGATAAACGACACCAAGTTGATGCTGGGACGTTATTGCGACGAAGGGAACCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACG ACTCCAGGCAGAAGGTTTGCCGTACCGGGACCCGGATTCGTGACAATCGCGGCGACCTGTCCGGTGGTCTTGTAAAT GCCCTCGGCCATATAGGCTGCGGCGGCCTCGTGCCGCACCGGGACGAACAATATCCCATTGTCTTCGAGCGCAGCCA GGAGCGGATCCACCTCCGGCGACATGAGGCCGAAGACATACCGGACGCCTTCGACGGCCAAACATCGTGCCAATAAT TCTCCGCCCGTGAGGCGCATGACGATCTCCAGTACGAAAGGTGAGTGCCCAGGTTCCGGCACATTCGCTGTGGTTAG TTGATGCGCTGATCGGCCAACCGACTGAGTGGAGTTGGATGGCCGCACCTTACCCTGTCGCGCATAACTCTCAGATC 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權(quán)利要求
1.生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素、特別是伏馬菌素的添加劑的方法，其特征在于，提供至少一種對應于序列ID Nos. 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一種核酸序列在原核或真核宿主細胞中表達，且至少一種由此制備的、對應于序列 ID Nos. 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一種完整的重組宿主生物體，任選地與共底物一起，被用于植 物原料中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述真菌毒素、特別是伏馬菌素不依賴于氧地被降解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，在將酶用于植物原料中之前，通過分子遺傳學方法、誘變或分子進化來修飾所述酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其特征在于，所述酶是經(jīng)分離的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其特征在于，所述酶被包裹在保護性包被中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其特征在于，所述酶選自通透酶IDNo. 3，羧酸酯酶ID No. 9，丙三羧酸脫氫酶ID No. 11，檸檬酸利用蛋白ID No. 13，醇脫氫酶ID No. 17， 氨基轉(zhuǎn)移酶ID No. 19和/或25，和/或乙酰乳酸合酶ID No. 23。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其特征在于，使用與酶IDNo. 3、5、7、9、11、13、 15、17、19、21、23或25中的至少一個具有至少90%序列一致性的酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其特征在于，當使用至少一種氨基轉(zhuǎn)移酶ID No. 19或ID No. 25時，使用酮，特別是α -酮酸作為共底物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其特征在于，當使用羧酸酯酶IDNo. 9時，還使用至少一種吸附劑，所述吸附劑特別地選自黏土礦物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其特征在于，在用于生物乙醇生產(chǎn)的糊狀物或待發(fā)酵的植物原料中使用所述添加劑。
11.用于酶促降解植物原料和含有植物原料的混合物中的真菌毒素、特別是伏馬菌素的添加劑，其特征在于，所述添加劑含有至少一種序列ID Nos. 3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23和25的酶，或至少一種用于表達所述酶基因序列的完整的重組宿主生物體，以及任選地另外的至少一種用于至少一種或數(shù)種所使用的酶的共底物和惰性載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的添加劑，其特征在于，使用通過分子遺傳學方法、誘變或分子進化來修飾的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的添加劑，其特征在于，所使用的酶與IDΝο.3、5、7、9、11、 13、15、19、21、23或25的酶具有至少90%的序列一致性。
14.根據(jù)權(quán)利要求11、12或13的添加劑，其特征在于，所述酶、經(jīng)修飾的酶和/或至少 90 %—致的酶以保護性包被包覆而被使用。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項的添加劑，其特征在于，所述酶選自羧酸酯酶ID No. 9，丙三羧酸脫氫酶ID No. 11，檸檬酸利用蛋白ID No. 13，醇脫氫酶ID No. 17，氨基轉(zhuǎn)移酶ID No. 19或ID No. 25，和/或乙酰乳酸合酶ID No. 23。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項的添加劑，其特征在于，所述添加劑含有羧酸酯酶ID No. 9，至少一種氨基轉(zhuǎn)移酶ID No. 19或IDNo. 25，α -酮酸作為共底物，以及惰性載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項的添加劑，其特征在于，所述添加劑含有羧酸酯酶ID No. 9，至少一種吸附劑，特別是至少一種黏土礦物，以及任選地惰性載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項的添加劑，其特征在于，在生物乙醇生產(chǎn)時、在不依賴于氧的環(huán)境中使用所述添加劑，特別是與糊狀物或植物起始材料一起使用。
19.下列在生產(chǎn)用于降解植物材料中的真菌毒素、特別是伏馬菌素的添加劑中的用途 序列ID Nos. 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和對中所示的基因，或用于表達酶序列ID No. 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的完整重組宿主生物體，以及任選地共底物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其特征在于，使用選自羧酸酯酶IDNo. 9、氨基轉(zhuǎn)移酶ID No. 19或ID No. 25、或α -酮酸的共底物，以及惰性載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其特征在于，使用羧酸酯酶、至少一種吸附劑特別是黏土礦物、以及任選地惰性載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21中任一項的用途，用于不依賴于氧地處理生物乙醇生產(chǎn)中的糊狀物或植物起始材料。
全文摘要
在生產(chǎn)用于酶促降解真菌毒素、特別是伏馬菌素的添加劑的方法中，提供至少一種對應于序列ID Nos.1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的基因的核酸序列，所述至少一種核酸序列在原核或真核宿主細胞中表達，且至少一種由此制備的、對應于序列IDNos.3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的酶或至少一種完整的重組宿主生物體，以及任選地與共底物一起，被用于植物原料中。
文檔編號C12N9/10GK102159706SQ200980136294
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者D·哈廷格, E·M·賓德, G·沙茨邁爾, K·格里布勒, W-D·莫爾 申請人:愛爾伯股份公司