用于水解苯脲、氨基甲酸酯和有機(jī)磷酸酯的酶和方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：用于水解苯脲、氨基甲酸酯和有機(jī)磷酸酯的酶和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的酶，以及編碼這些酶的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法。
背景技術(shù)：
苯脲除草劑敵草隆(N' -3,4- 二氯苯基N- 二甲基脲)是廣泛用于耕作和非耕作區(qū)的具有寬靶向范圍的系統(tǒng)性光合作用抑制劑。作用方式是經(jīng)由抑制光合作用中的Hill 反應(yīng)(Wessels和Van der Veen，1956)，通過(guò)結(jié)合于光系統(tǒng)II活性中心并阻斷電子傳遞而防止氧產(chǎn)生(Stein 等，1984 ；Sinning, 1992)。敵草隆是一種環(huán)境隱憂(yōu)，原因在于其非現(xiàn)場(chǎng)(off-site)除草劑效應(yīng)及其毒性，以及其初級(jí)代謝物3，4-二氯苯胺(DCA)的非現(xiàn)場(chǎng)除草劑效應(yīng)及其毒性。敵草隆和DCA被懷疑具有遺傳毒性(Osano等，2002 ；Canna-MichaeIidou等，1996)。正常噴灑作業(yè)(Gooddy等， 2002)可導(dǎo)致敵草隆滲至地面(Spliid和Koppen，1998 ；Field等，2003)、表面(Thurman等， 2000 ；Gerecke等，2001a)，以及最終至海水(Gerecke等，2001b)。由于其緩慢的化學(xué)水解和光解速率(Salvestrini等，2002 ;0kamura，2002)，敵草隆是環(huán)境持久的。通過(guò)依據(jù)歐盟委員會(huì)水框架指令(2000/60/EC)(建議在2020年前逐步淘汰敵草隆使用)的No 2455/2001/ EC決議審議，敵草隆被列為重點(diǎn)有害物質(zhì)。隨后歐盟委員會(huì)指導(dǎo)性提案(COM(2006) 397)闡明敵草隆為歐洲主要水隱憂(yōu)的重點(diǎn)物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)減少其傳播、排放及損耗。微生物降解被認(rèn)為是敵草隆降解的主要途徑，其在土壤中的半衰期估計(jì)少于一年 (Okamura, 2002 ；Wauchope等，1992)。除了微生物群落和真菌分離株外，顯示許多細(xì)菌菌株催化分解代謝一系列苯脲除草劑，包括敵草隆(Sorensen等，2003 ；Giacomazzi和Cochet， 2004)。例如，球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)D47降解若干苯脲，按利谷隆> 敵草隆>單利谷隆> 甲氧隆>異丙隆的速度排序(Cullington和Walker，1999 ；Turnbu 11 等，2001a)。隨后，發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.) N2菌株降解敵草隆、綠麥隆和異丙隆 (Widehem等，2002 ；Tixier等，2002)。兩種節(jié)桿菌都不完全礦化敵草隆和積累敵草隆水解造成的DCA。相反，假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株BK8和貪噬菌(Variovorax sp. )SRS16 完全礦化敵草隆(El-Deeb 等，2000 ；Sorensen 等，2008)。第一個(gè)純化的苯脲水解酶被發(fā)現(xiàn)是球形桿菌(Bacillus sphaericus)的75kDa的酶，已報(bào)道其催化許多N-甲氧基-N-甲基苯脲的分解，包括利谷隆、單利谷隆、溴谷隆和氯溴隆(Engelhardt 等，1971 ；Engelhardt 等，1973 ； Wallnofer, 1969)。然而，沒(méi)有觀察到 N-二甲基苯脲底物的代謝周轉(zhuǎn)(turnover)，包括敵草隆。迄今為止，Turnbull等(2001b) 的鑒定是敵草隆水解降解基因的唯一遺傳鑒定，其中他們從球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)D47克隆并測(cè)序了叫做puhA的苯脲水解酶。序列分析顯示PuhA具有與酰胺基水解酶超家族成員的低水平相似性(Turnbull等，2001b)。酰胺基水解酶超家族中的酶在(β/α )8-桶結(jié)構(gòu)折疊中含有單或雙核金屬中心， 并在碳或磷中心催化酰胺或酯功能團(tuán)的水解。金屬中心位于組成桶的八個(gè)鏈的C-末端，其突出環(huán)影響底物特異性。有幾種酰胺基水解酶亞型，其通過(guò)充當(dāng)直接金屬配體的氨基酸的變異而定義(見(jiàn)Seibert和Raushel, 2005)。需要更多的能用來(lái)水解例如敵草隆的苯脲的酶。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人鑒定了能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的細(xì)菌菌株。此外，發(fā)明人鑒定了能用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的酶。因此，本發(fā)明提供了基本上純化的和/或重組的多肽，其包括i)SEQ ID NO 1的氨基酸序列，ii)與i)具有至少83%相同性的氨基酸序列，和/或iii) i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，苯脲是N-二甲基取代的苯脲或N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。所述N- 二甲基取代的苯脲可以是，例如，敵草隆、綠麥隆、優(yōu)草隆、甲氧隆、異丙隆或非草隆。所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲可以是，例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或單利谷隆。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)敵草隆、綠麥隆、優(yōu)草隆、甲氧隆和/ 或非草隆的Km低于包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)敵草隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優(yōu)選至少4倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)綠麥隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少4倍、更優(yōu)選至少8倍、更優(yōu)選至少10倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)優(yōu)草隆的Km低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優(yōu)選至少5倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)甲氧隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優(yōu)選至少3倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)非草隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少8倍、更優(yōu)選至少12倍、更優(yōu)選16倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的酰胺鍵。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包括與SEQ ID NO :1具有至少95%相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽可以從分枝桿菌(Mycobacterium sp.)純化。優(yōu)選地，所述分枝桿菌是在2008年5月16日以保藏號(hào)V08/013277保藏于澳大利亞國(guó)家計(jì)量石if究院(National Measurement Institute)的Mycobacterium brisbanense JKl。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽與至少一種其它多肽融合。所述至少一種其它多肽可以是，例如，增強(qiáng)本發(fā)明中的多肽的穩(wěn)定性的多肽，或幫助純化所述融合蛋白的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供分離和/或外源的多核苷酸，其包括i)SEQ ID NO 2的核苷酸序列，ii)編碼本發(fā)明中的多肽的核苷酸序列，
ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基
iii)與i)具有至少80%相同性的核苷酸序列，iv)在嚴(yán)格條件下與i)雜交的核苷酸序列，和/或ν)與i)至iv)中任一核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供載體，其包括本發(fā)明的多核苷酸。優(yōu)選地，所述多核苷酸可操縱地連接于啟動(dòng)子。在另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，其包括至少一種本發(fā)明的多核苷酸和/或至少一種本發(fā)明的載體。該宿主細(xì)胞可以是任何類(lèi)型的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明中的多肽通過(guò)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)而由所述細(xì)胞產(chǎn)生。在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括在使得編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)編碼所述多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞或編碼所述多肽的本發(fā)明的載體，并回收表達(dá)的多肽。還提供使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供分離的抗體，其特異地結(jié)合本發(fā)明的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供組合物，其包括至少一種本發(fā)明的多肽、至少一種本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物， 所述組合物包括本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包括一或多種可接受的承載體(carrier)。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物還包括金屬離子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述金屬離子是二價(jià)金屬離子。更優(yōu)選地，所述金屬離子選自Mg2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+以及其組合。更優(yōu)選地，所述金屬離子選自Mg2+、Zn2+、C02+以及其組合。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述金屬離子是Zn2+。本發(fā)明的多肽可以用作可選擇標(biāo)記檢測(cè)宿主細(xì)胞。因此，也提供本發(fā)明的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸的用途，其用作檢測(cè)和/或選擇宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括i)在使得細(xì)胞可以攝取編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的條件下使細(xì)胞或一群細(xì)胞與所述多核苷酸接觸，以及ii)通過(guò)將來(lái)自步驟i)的細(xì)胞或其后代細(xì)胞暴露至苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯選擇宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述多核苷酸包括編碼本發(fā)明的多肽的第一開(kāi)放讀框，以及不編碼本發(fā)明的多肽的第二開(kāi)放讀框。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二開(kāi)放讀框編碼多肽。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述第二開(kāi)放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。在兩個(gè)實(shí)例中，都優(yōu)選第二開(kāi)放讀框可操縱地連接于合適的啟動(dòng)子。所述不翻譯的多核苷酸可以編碼，例如，催化核酸、dsRNA分子或反義分子。合適的細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選
8地，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法， 所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與本發(fā)明的多肽接觸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述多肽由本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。本文提供的多肽可以在植物中產(chǎn)生，增強(qiáng)宿主植物暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/ 或有機(jī)磷酸酯時(shí)的生長(zhǎng)能力。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，其包括編碼至少一種本發(fā)明的多肽的外源多核苷酸。優(yōu)選地，所述多核苷酸穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的部分。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物的部分是種子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解樣品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將樣品與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物接觸。 優(yōu)選地，所述樣品是土壤。這樣的土壤可以在田里。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包括編碼至少一種本發(fā)明的多肽的外源多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在2008年5月16日以保藏號(hào)V08/013277保藏于澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院的分枝桿菌(Mycobacterium)分離菌株。所述菌株可以是活的或死的(被殺死)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的菌株以及任選地，一或多種可接受的承載體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、本發(fā)明的菌株的提取物，其中所述提取物包括本發(fā)明的多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物，所述組合物包括本發(fā)明的提取物，以及任選地，一或多種可接受的承載體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與本發(fā)明的菌株、本發(fā)明的組合物和/或本發(fā)明的提取物接觸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的聚合海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包括固定在聚合多孔支持物上的本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，所述多孔支持物包括聚氨酯。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述海綿或泡沫還包括包埋或摻入多孔支持物之上或里面的碳。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法， 所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與本發(fā)明的海綿或泡沫接觸?？梢酝蛔儽景l(fā)明的多肽，并針對(duì)所獲得的突變體的改變的活性，例如增強(qiáng)的酶活性，進(jìn)行篩選。這樣的突變體可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)獲得，包括但不限于體外誘變和 DNA 改組(DNA shuffling)。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有增強(qiáng)的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，或?qū)Σ煌?lèi)型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯具有改變的底物特異性的多肽的方法，所述方法包括i)改變本發(fā)明的最初的多肽的一或多個(gè)氨基酸，ii)測(cè)定獲得自步驟i)的改變的多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，以及iii)選擇改變的多肽，其與步驟i)中使用的多肽相比，具有增強(qiáng)的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，或?qū)Σ煌?lèi)型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯具有改變的底物特異性。步驟i)可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的合適的技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于在編碼核苷酸上的定點(diǎn)誘變、化學(xué)誘變和DNA改組(DNA shuffling)。還提供通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于篩選能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括i)在苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯作為單一氮源存在時(shí)培養(yǎng)候選微生物， 以及ii)測(cè)定微生物是否能夠生長(zhǎng)和/或分裂。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供試劑盒，其包括至少一種本發(fā)明的多肽、至少一種本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的組合物、至少本發(fā)明的植物一個(gè)部分、至少一種本發(fā)明的菌株、至少一種本發(fā)明的提取物和/或至少一種本發(fā)明的聚合海綿或泡沫。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于水解氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與基本純化的和/或重組的多肽接觸，該多肽包括i)SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 3 的氨基酸序列，ii)與i)具有至少40%相同性的氨基酸序列，和/或iii) i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽水解氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚所述方法可以通過(guò)使氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯接觸以下各項(xiàng)而實(shí)施編碼所述多肽的多核苷酸、包含編碼所述多肽的多核苷酸的載體和 /或宿主細(xì)胞、包含所述載體的宿主細(xì)胞、包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或其部分、包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、在2008年5月16日以保藏號(hào) V08/013277保藏于澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院的分枝桿菌分離菌株、包括所述多肽的提取物 (其中所述提取物是宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或菌株的提取物)和/或包括所述多肽的聚合海綿或泡沫。在本說(shuō)明書(shū)全文中，詞語(yǔ)“包括”及其變形意指包含所述的元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組，而不排除任何其它元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組。在本說(shuō)明書(shū)全文中，除非另外具體規(guī)定或上下文另外要求，提到單個(gè)步驟、事物組合物、步驟的組或事物組合物的組應(yīng)當(dāng)包括包括一個(gè)以及多個(gè)這些步驟、事物組合物、步驟的組或事物組合物的組。
除非另外具體規(guī)定，本文描述的每個(gè)實(shí)施方案加以必要修訂適用于每個(gè)其它實(shí)施方案。在下文中通過(guò)下面非限制性實(shí)施例以及參照附圖描述本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)述

圖1.分枝桿菌Mycobacterium brisbanense菌株JKl所造成的敵草隆水解和DCA 積累。3個(gè)平行測(cè)定的瓶中的敵草隆濃度標(biāo)為(厶、口、〇)，用閉合標(biāo)志(▲、圓、·)表示在相同的3個(gè)瓶中的DCA濃度。在僅為對(duì)照的培養(yǎng)基(X)中沒(méi)有觀察到敵草隆的消耗。圖2. puhA和puhB間的同線(xiàn)性以及假定的調(diào)控基因tetR。puhA和puhB基因用箭頭表示，指示相對(duì)于保守的假定tetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的轉(zhuǎn)錄方向。顯示了 puhA和puhB基因上游的預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域(-10，-35)以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)。puhA上游的14bp回文序列(用反向箭頭指示)與puhB上游的不完全回文序列類(lèi)似。圖3.金屬依賴(lài)水解酶組A(⑶01299)分歧最大的32個(gè)成員當(dāng)中的PuhA和B的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。節(jié)點(diǎn)的數(shù)字是來(lái)自1000次重復(fù)的自展再抽樣頻率。圖4.用于同源建模的2QS8和PuhB的序列比對(duì)。金屬配體以黑體顯示，第二層 (shell)催化殘基以黑體和下劃線(xiàn)顯示。圖5.基于2QS8的PuhB的同源模型。PuhB模型(左)與2G0K活性位點(diǎn)并排顯示。該模型基于圖4中顯示的比對(duì)。圖6.在分枝桿菌M. smegmatis中表達(dá)的PuhA和PuhB的純化。用含有大致等量的來(lái)自每一純化步驟的靶蛋白樣品上樣的10% SDS-PAGE凝膠；無(wú)細(xì)胞提取物(CFE)、疏水作用層析(HIC)、陰離子交換層析(AEX)和尺寸排阻層析(SEC)。圖7.反應(yīng)溫度對(duì)PuhA(_)和B(A)的活性的影響。測(cè)定在指定溫度進(jìn)行1小時(shí)。誤差棒是三個(gè)平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。圖8. PuhA( ■)和B( ▲)的穩(wěn)定性。暴露于㈧各種溫度下10分鐘以及⑶溶劑乙腈[PuhA( ■)和B(A)]和甲醇[PuhA( □)和Β(Δ)](在25°C下1小時(shí)的測(cè)定) 的殘余活性。誤差棒是三個(gè)平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。圖9.苯脲水解酶的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)圖10. PuhA ( ■)和PuhB ( ▲)的pH依賴(lài)性。pH依賴(lài)性用恒定離子強(qiáng)度緩沖液中的底物敵草隆測(cè)量并通過(guò)LCMS分析。pH對(duì)log(kcat) (A)、pH對(duì)log(kcat/Km) (B)和pH對(duì) Kffl(C)作圖證明這些酶具有寬最優(yōu)pH范圍。圖11.建議的苯脲水解酶催化機(jī)制。在活性位點(diǎn)第二層的H273結(jié)合苯脲底物?；钚晕稽c(diǎn)金屬激活的氫氧化物對(duì)底物脲部分中心碳的攻擊和K206對(duì)苯胺離去基團(tuán)的穩(wěn)定協(xié)同發(fā)生。圖12. PuhA( □)和PuhB(Δ)的Bmnsted圖。kcat和圖7中N- 二甲基苯脲離去基團(tuán)的PKaI示出相關(guān)性。序列列表關(guān)鍵字SEQ ID NO Ι-PuhB 的氨基酸序列SEQ ID NO :2_編碼PuhB的核苷酸序列SEQ ID NO :3_PuhA 的氨基酸序列SEQ ID NO :4_編碼PuhA的核苷酸序列
SEQ ID NO 5-引物(PuhA_petl4b 正向)SEQ ID NO :6_ 引物(PuhA_petl4b 反向)SEQ ID NO -J-引物(PuhB_pET14b 正向)SEQ ID NO :8_ 引物(PuhB_pET14b 反向)SEQ ID NO :9_ 引物(His AB pMV 正向)SEQ ID NO :10_ 引物(PuhA_pMV261 正向)SEQ ID NO 11-引物(PuhB_pMV261 正向)SEQ ID NO 12-引物(PuhA pMV261 反向)SEQ ID NO 13-引物(PuhB pMV261 反向)SEQ ID NO :14_2QS8 的氨基酸序列優(yōu)選實(shí)施方案詳述通用技術(shù)除非另外具體定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、植物生物學(xué)和/或植物化學(xué)、重組細(xì)胞生物學(xué)包括轉(zhuǎn)基因植物、生物除污、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)以及生物化學(xué))。除非另外指明，本發(fā)明中使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中到處被描述和解釋?zhuān)鏙.Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons (1984) ；J. Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) ；T· A· Brown (編輯)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumes 1 and 2，IRL Press (1991) ；D. M. Glover 禾口 B. D. Hames (編輯)，DNA Cloning A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press (1995 and 1996) ；F. Μ. Ausubel 等 (編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的所有更新)；Ed Harlow 和 David Lane(編輯)Antibodies :A Laboratory Manual， Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)； J· Ε· Coligan 等(編輯)，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括
至今的所有更新)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“水解酶”指的是本發(fā)明的多肽，其催化苯脲、氨基甲酸酯和/ 或有機(jī)磷酸酯的水解。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“水解(hydrolysis水解作用)”指的是分解的化學(xué)過(guò)程，包括鍵的裂開(kāi)并添加來(lái)自水的氫陽(yáng)離子和氫氧根陰離子。對(duì)于本文所用“水解 (hydrolyse) ”，是使遭受或遭受水解作用。^M苯脲除草劑一般具有通式結(jié)構(gòu) 其中，R1可以是，例如，CH3 ;R2可以是，例如，CH3或OCH3 ;R3可以是，例如，H、Cl或
12CF3 ；以及 R4 可以是，例如，H、CH3、0CH3、CH(CH3)2、C1 或 Br。大多當(dāng)前可獲得的苯脲除草劑或者是N-二甲基_取代的化合物(例如，敵草隆、 綠麥隆、伏草隆、甲氧隆、異丙隆和非草隆)或者是N-甲氧基-N-甲基-化合物(例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆和單利谷隆)。苯脲除草劑一般具有相對(duì)高的水中溶解性和低的對(duì)土壤的吸附傾向，致使它們?cè)谕寥乐锌梢苿?dòng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和方法可用于水解N-二甲基脲和/或 N-甲氧基-N-甲基脲。在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和方法可用于水解敵草隆(N' -3，4-二氯苯基N-二甲基脲)。通常，本發(fā)明的多肽通過(guò)脲羰基的水解作用將苯脲轉(zhuǎn)換成苯胺和氨基甲酸，或?qū)τ谌〈诫?，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的取代苯胺(例如，敵草隆水解為3，4-二氯苯胺(DCA)而異丙隆水解為4-異丙苯胺)和N-二甲基或N-甲氧基、N-甲基氨基甲酸(其可以進(jìn)一步降解為 CO2和二甲基或甲氧甲基胺(Engelhardt，1971))。氨基甲酸酯氨基甲酸酯具有酰胺鍵，其羰基基團(tuán)也形成羧基酯鍵。氨基甲酸酯農(nóng)藥衍生自氨基甲酸(HOOC-NH2)并具有通式結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.基本上純化的和/或重組的多肽，其包括 i)SEQ ID NO 1的氨基酸序列， )與i)具有至少83%相同性的氨基酸序列，和/或 iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述苯脲是N-二甲基取代的苯脲或者N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敵草隆、綠麥隆、優(yōu)草隆、甲氧隆、異丙隆或非草隆。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敵草隆。
5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的多肽，其對(duì)敵草隆、綠麥隆、優(yōu)草隆、甲氧隆和/或非草隆的Km低于包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求2的多肽，其中所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲是利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或單利谷隆。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基甲酸酯是利谷隆酯或DMNPC。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述有機(jī)磷酸酯是對(duì)氧磷。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的多肽，其包括與SEQID NO :1具有至少95%相同性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽可以從分枝桿菌純化。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中所述分枝桿菌是在2008年5月16日以保藏號(hào) V08/013277保藏于澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院的Mycobacterium brisbanense JK1。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的多肽，其與至少一種其它多肽融合。
13.分離的和/或外源多核苷酸，其包括 i)SEQ ID NO 2的核苷酸序列， )編碼根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，iii)與i)具有至少80%相同性的核苷酸序列，iv)在嚴(yán)格條件下與i)雜交的核苷酸序列，和/或v)與i)至iv)中任一核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸，其編碼水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的多肽。
15.載體，其包括權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的多核苷酸。
16.權(quán)利要求15的載體，其中所述多核苷酸可操縱地連接于啟動(dòng)子。
17.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的至少一種多核苷酸和/或包括權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的至少一種載體。
18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
19.產(chǎn)生權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的編碼所述多肽的宿主細(xì)胞、或權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的編碼所述多肽的載體，并回收表達(dá)的多肽。
20.使用權(quán)利要求19的方法產(chǎn)生的多肽。
21.分離的抗體，其特異地結(jié)合權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽。
22.組合物，其包括權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)或權(quán)利要求20的至少一種多肽、權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的至少一種多核苷酸、權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的載體、權(quán)利要求17 和權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞、和/或權(quán)利要求21的抗體。
23.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物，所述組合物包括權(quán)利要求 1至12中任一項(xiàng)或權(quán)利要求20的多肽和/或權(quán)利要求17和權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的組合物，其包括一或多種可接受的承載體。
25.權(quán)利要求22至M中任一項(xiàng)的組合物，其包括金屬離子。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述金屬離子是Co2+、Si2+和/或Mg2+。
27.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸的用途，其用作檢測(cè)和/或選擇宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記。
28.檢測(cè)宿主細(xì)胞方法，所述方法包括i)在使得細(xì)胞可以攝取編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸的條件下將細(xì)胞或一群細(xì)胞與所述多核苷酸接觸，以及ii)通過(guò)將來(lái)自步驟i)的細(xì)胞、或其后代細(xì)胞暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯選擇宿主細(xì)胞。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述多核苷酸包括編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽的第一開(kāi)放讀框，以及不編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽的第二開(kāi)放讀框。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述第二開(kāi)放讀框編碼多肽。
31.權(quán)利要求四的方法，其中所述第二開(kāi)放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述不翻譯的多核苷酸編碼催化核酸、dsRNA分子或反義分子。
33.權(quán)利要求觀至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
35.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽接觸。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述多肽由權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。
37.轉(zhuǎn)基因植物，其包括編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的至少一種多肽的外源多核苷酸。
38.權(quán)利要求37的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多核苷酸穩(wěn)定整合入植物基因組。
39.權(quán)利要求37或權(quán)利要求38的植物的部分。
40.權(quán)利要求39的植物的部分，其是種子。
41.用于水解樣品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將樣品與權(quán)利要求37或權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物接觸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述樣品是土壤。
43.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包括編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的至少一種多肽的外源多核苷酸。
44.分枝桿菌的分離菌株，其在2008年5月16日以保藏號(hào)V08/013277保藏于澳大利亞國(guó)家計(jì)量研究院。
45.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物，所述組合物包括權(quán)利要求 44的菌株。
46.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求37或權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或權(quán)利要求44的菌株的提取物，其中所述提取物包括權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽。
47.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的組合物，所述組合物包括權(quán)利要求 46的提取物。
48.水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與權(quán)利要求44的菌株、權(quán)利要求45或權(quán)利要求47的組合物和/或權(quán)利要求46的提取物接觸。
49.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的聚合的海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包括固定于聚合多孔支持物上的權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的多肽。
50.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與權(quán)利要求49的海綿或泡沫接觸。
51.產(chǎn)生多肽的方法，所述多肽具有增強(qiáng)的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，或?qū)Σ煌?lèi)型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯具有改變的底物特異性，所述方法包括i)改變權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的最初多肽的一或多個(gè)氨基酸， )測(cè)定獲得自步驟i)的改變的多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，以及iii)選擇改變的多肽，其與步驟i)中使用的多肽相比，具有增強(qiáng)的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的能力，或?qū)Σ煌?lèi)型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯具有改變的底物特異性。
52.多肽，其通過(guò)權(quán)利要求51的方法產(chǎn)生。
53.用于篩選能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括i)在苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯作為單一氮源存在時(shí)培養(yǎng)候選微生物，以及 )測(cè)定微生物是否能夠生長(zhǎng)和/或分裂。
54.試劑盒，其包括權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)、權(quán)利要求20或權(quán)利要求52的至少一種多肽，權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的至少一種多核苷酸，權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的載體，權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求21的抗體，權(quán)利要求22至沈中任一項(xiàng)、權(quán)利要求45或權(quán)利要求47的組合物，至少權(quán)利要求39或權(quán)利要求40的植物的至少一部分，權(quán)利要求44的至少一種菌株，權(quán)利要求46的至少一種提取物，和/或權(quán)利要求49的至少一種聚合海綿或泡沫。
55.用于水解氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法，所述方法包括將氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯與基本上純化的和/或重組的多肽接觸，所述多肽包括i)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的氨基酸序列， )與i)具有至少40%相同性的氨基酸序列，和/或 iii)i)或ii)的生物學(xué)活性片段，其中所述多肽能夠水解氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的酶，以及編碼這些酶的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機(jī)磷酸酯的方法。
文檔編號(hào)C12N15/06GK102164951SQ200980135008
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日
發(fā)明者C·J·杰克遜, C·斯科特, G·潘迪, J·G·奧克肖特, J·L·庫(kù)拉納, R·J·魯賽爾 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織