專利名稱：生產(chǎn)連續(xù)細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)細(xì)胞系的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞系已成為用于疫苗制造的有價(jià)值的工具。一些重要疫苗和病毒載體的生產(chǎn) 仍然在雞胚或雞胚原代成纖維細(xì)胞中進(jìn)行。用于病毒復(fù)制的禽類原代組織由SPF(無特 定病原體)生產(chǎn)廠提供。SPF來源的組織昂貴，并且原料供應(yīng)的質(zhì)量通常難以控制。因 此，供應(yīng)的不一致性和短缺是基于SPF蛋技術(shù)的最主要缺點(diǎn)。對(duì)于使用原代成纖維細(xì)胞 單層培養(yǎng)物的方法來說，同樣也是這樣。為了無限地增殖細(xì)胞系，需要將細(xì)胞永生化。 目前使用的大多數(shù)永生化細(xì)胞系是癌細(xì)胞或融合的雜交瘤細(xì)胞的后裔。但是，后一種技 術(shù)受到與骨髓瘤細(xì)胞融合的限制。不存在能夠產(chǎn)生不同類型的永生化細(xì)胞的通用技術(shù)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是從不連續(xù)的細(xì)胞材料生產(chǎn)連續(xù)細(xì)胞。具體來說，目的是提供不 弓I入外來病毒基因的具有增殖潛力的連續(xù)細(xì)胞系。因此，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)連續(xù)細(xì)胞系的方法，所述方法包括提供動(dòng)物 或人類的活細(xì)胞，用紫外光輻照所述細(xì)胞，增殖所述細(xì)胞，以及選擇在至少20次傳代后 能夠增殖的細(xì)胞作為連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞。這樣的連續(xù)細(xì)胞系是能夠增殖并用于生物分子例如蛋白質(zhì)的重組表達(dá)，或用于 制造病毒產(chǎn)品例如病毒抗原或完整病毒群，特別是用于疫苗接種目的的細(xì)胞的培養(yǎng)物。因此，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)病毒的方法，所述方法包括提供可通過本發(fā)明 的方法獲得的連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞，用所述病毒感染所述細(xì)胞，在所述細(xì)胞中增殖所述病 毒，以及收集所述病毒。另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組基因產(chǎn)物的方法，所述方法包括提供可 通過本發(fā)明的方法獲得的連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞，用編碼所述基因產(chǎn)物的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表 達(dá)所述基因產(chǎn)物，以及任選地收集所述基因產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明提供了可以通過一種方法獲得的連續(xù)細(xì)胞系，所述方法包括 提供動(dòng)物或人類的活細(xì)胞，用有效劑量的紫外光輻照所述細(xì)胞，增殖所述細(xì)胞，以及選 擇在至少20次傳代后能夠增殖的細(xì)胞作為所述連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞。
圖1顯示了 UV處理步驟的流程。圖2顯示了鵪鶉的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)物。圖3顯示了生產(chǎn)鵪鶉連續(xù)細(xì)胞系的系統(tǒng)樹以及處理路線。圖4顯示了采用用于生產(chǎn)連續(xù)細(xì)胞的設(shè)置，UV劑量與輻照時(shí)間的相關(guān)性。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過細(xì)胞的UV處理來生產(chǎn)連續(xù)細(xì)胞系。細(xì)胞系是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)物形成的細(xì)胞群。每輪傳
3代培養(yǎng)被稱為傳代。當(dāng)細(xì)胞被傳代培養(yǎng)時(shí)，它們被稱為已被傳代。特定細(xì)胞群、或細(xì) 胞系，可以由它已被傳代的次數(shù)來表征。原代培養(yǎng)物是細(xì)胞從組織分離后的第一代培養(yǎng) 物。在第一次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為第二代培養(yǎng)物(一次傳代)。在第二次傳代培 養(yǎng)后，細(xì)胞變成第三代培養(yǎng)物(兩次傳代)，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在傳 代期間可能存在多次群體加倍；因此，培養(yǎng)物群體加倍的數(shù)量大于傳代次數(shù)。傳代之間 的時(shí)間中細(xì)胞的擴(kuò)增(即群體加倍的數(shù)量)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基 底、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和傳代之間的時(shí)間。培養(yǎng)可以通過接種細(xì)胞培養(yǎng)基，使細(xì)胞生長(zhǎng) 至細(xì)胞形成匯合細(xì)胞培養(yǎng)物或連續(xù)的膜，并用一部分匯合細(xì)胞接種新的細(xì)胞培養(yǎng)基來進(jìn) 行。然而，傳代是評(píng)估增殖能力的工具。一般來說，從組織分離到的細(xì)胞、包括未輻照 細(xì)胞，在它們達(dá)到不發(fā)生進(jìn)一步增殖或細(xì)胞加倍的狀態(tài)之前，能夠傳代約10-20次。然 后細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，不能從其獲得進(jìn)一步的傳代培養(yǎng)。與此相反，連續(xù)細(xì)胞系在20次 以上傳代之后、例如在 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、55、60、65、70、75或80次以上傳代之后能夠增殖?，F(xiàn)在，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這 種在第20次傳代后能夠傳代多次的連續(xù)細(xì)胞、特別是永生化細(xì)胞，可以通過用UV處理 改變細(xì)胞、即通過用有效劑量的UV光輻照這些細(xì)胞來獲得。本發(fā)明的術(shù)語“有效劑量 的UV光”是將非連續(xù)細(xì)胞系轉(zhuǎn)化成連續(xù)細(xì)胞系所需的輻照的量。有效劑量的UV光的 范圍，從這種轉(zhuǎn)化所必需的最小劑量直到這些細(xì)胞所耐受的對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物整體沒有致死 結(jié)果的最大劑量。顯然，高于或低于有效劑量限度，不能獲得連續(xù)細(xì)胞系。本領(lǐng)域技術(shù) 人員在本文中獲得的信息和指導(dǎo)的基礎(chǔ)上，經(jīng)常規(guī)的最適化過程就能容易地確定每個(gè)細(xì) 胞系的最適有效劑量。細(xì)胞可以是原代細(xì)胞或幾次傳代后能夠增殖的細(xì)胞。細(xì)胞系的培 養(yǎng)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來進(jìn)行，例如在T型瓶系統(tǒng)或轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)中，或在攪拌釜 或其他生物反應(yīng)器形式中。在本發(fā)明的幾種實(shí)施方案中，培養(yǎng)物適合于并保持在無血清 條件下。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“UV光”是指波長(zhǎng)從10到400nm、特別是100到400nm的 紫外輻射。UV光可以選自UV C (100到280nm)、UV B (280到320nm)和UV A (320到 400nm)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，波長(zhǎng)在200到300nm之間?？梢允褂霉饷魟├?如嵌入到DNA中并被UV光活化的光敏劑來加速UV輻照的改變效應(yīng)，盡管它們?cè)诒景l(fā) 明的所有實(shí)施方案中不是必需的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，UV光是波長(zhǎng)為約100到 約280nm的UV C。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，UV光具有約240到約290nm的波 長(zhǎng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，約85%或85%以上的UV光具有約254nm的波長(zhǎng)。不受任何理論的束縛，據(jù)信UV光改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，這引入了突變。盡管 這樣的改變一般能夠被細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制修復(fù)，但某些改變可能保留。這些改變能夠引入 致死突變以及導(dǎo)致細(xì)胞永生化的變化。從UV輻照實(shí)驗(yàn)，可以選擇導(dǎo)致顯著部分的細(xì)胞 永生化并能夠培養(yǎng)的最適劑量。在傳代后，據(jù)信只有能夠增殖的活細(xì)胞被選擇，預(yù)計(jì)它 們僅具有少量變化，其中至少一個(gè)變化導(dǎo)致了永生化。顯著部分的被輻照細(xì)胞將不被永 生化而是獲得了不同的變化，產(chǎn)生凋亡或壞死的細(xì)胞。但是，原則上說，對(duì)于獲得連續(xù) 細(xì)胞培養(yǎng)物來說，僅僅一個(gè)具有誘導(dǎo)永生化的變化的細(xì)胞就已足夠，因?yàn)樵摷?xì)胞將通過 本文描述的多輪傳代繼續(xù)增殖和存活。UV光發(fā)射可以是連續(xù)形式的UV光發(fā)射例如汞燈技術(shù)，或脈沖式UV光例如單色激光技術(shù)。所需UV強(qiáng)度可以通過組合兩個(gè)或以上燈來產(chǎn)生。至少兩個(gè)輻照步驟可以 組合，其間具有暫停。本發(fā)明的主題包含任何有效劑量的UV光，即使細(xì)胞改變成連續(xù) 增殖的任何劑量的UV光。有效劑量可以依賴于各種不同的本技術(shù)領(lǐng)域所公知的因素，例 如UV輻照室的物理參數(shù)，例如燈和室的尺寸和直徑、包含細(xì)胞的培養(yǎng)基與UV光源之間 的距離、室的材料的光吸收和反射性質(zhì)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，細(xì)胞以單層、表 面上的一個(gè)細(xì)胞層的形式被輻照。同理，UV光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度以及細(xì)胞暴露于UV光的接 觸時(shí)間對(duì)于有效劑量來說也是關(guān)鍵的。此外，有效劑量還受細(xì)胞自身、含有病毒的培養(yǎng) 基及其光吸收性質(zhì)的影響。在本發(fā)明的各種不同實(shí)施方案中，有效劑量足以改變樣品中 包含的至少 20%、30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%或 100% 的細(xì)胞，在其 他實(shí)施方案中，有效劑量足以將細(xì)胞改變到其中至少10%的細(xì)胞被改變成連續(xù)生長(zhǎng)的水 平。10%到90%的細(xì)胞可以被輻照殺死。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，含有細(xì)胞的樣品 被暴露于至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或 70mJ/cm2 的 有效劑量。在某些實(shí)施方案中，有效劑量高達(dá)約500、450、400、350、300、250、200、 180、150、130或105mJ/cm2。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，UV劑量在約70到105mJ/ cm2之間。在某些實(shí)施方案中，這些劑量被UVC光使用。術(shù)語“約”是指通常的UV燈 不提供離散的單一波長(zhǎng)UV光(如同激光那樣)，而是具有也發(fā)射附近波長(zhǎng)的光的高斯形 狀的光譜的性質(zhì)。在利用了某些這樣的燈的實(shí)施方案中，“約”是指波長(zhǎng)值偏差10%。在輻照或傳代之前或之后，能夠?qū)?xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步選擇，以滿足質(zhì)量控制標(biāo) 準(zhǔn)例如無菌性、不含支原體污染、不含外來病毒污染和/或通過用于檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄酶活性 存在的F-Pert測(cè)試，以及本技術(shù)領(lǐng)域中選擇細(xì)胞系用于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用時(shí)使用的其他 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在這種意義上，“不含”應(yīng)該被理解為污染被降低到低于當(dāng)前質(zhì)量測(cè)試 步驟的檢測(cè)極限。因?yàn)楸景l(fā)明的技術(shù)不使用病毒載體或?qū)敕崔D(zhuǎn)錄病毒就能夠產(chǎn)生連續(xù) 細(xì)胞系，因此本發(fā)明的細(xì)胞系通常不具有任何反轉(zhuǎn)錄酶活性，正如可以通過用于反轉(zhuǎn)錄 酶活性的測(cè)定方法所測(cè)試的。但是，出于例如在細(xì)胞系中生產(chǎn)病毒或蛋白質(zhì)的目的，可 以通過分子工程技術(shù)將這種反轉(zhuǎn)錄病毒活性特異性地引入本發(fā)明的細(xì)胞系。細(xì)胞系可以是任何真核細(xì)胞的，特別是較高等生物體的，例如魚類、禽類、爬 行類、兩棲類或哺乳類細(xì)胞以及甚至昆蟲和植物細(xì)胞的細(xì)胞系。某些實(shí)施方案利用了哺 乳動(dòng)物細(xì)胞例如倉(cāng)鼠、小鼠、大鼠、狗、馬、牛、靈長(zhǎng)類或人類；其他實(shí)施方案利用了 禽類細(xì)胞例如雞、鴨、金絲雀、鸚鵡、鵪鶉、駝鳥、鴯鹋、火雞或鵝的細(xì)胞。一般來 說，任何鳥類物種可以作為本發(fā)明中使用的禽類細(xì)胞的來源。在某些實(shí)施方案中，利用 馴養(yǎng)得較少的物種(例如鵪鶉或鴯鹋)以避免原種組織被更常見馴養(yǎng)物種(例如雞)中流 行的病毒的潛在污染，是有利的。被輻照細(xì)胞可以來自任何類型的組織。在某些實(shí)施方案中，組織源自于胚胎。 在許多實(shí)施方案中，使用一種以上類型組織的混合培養(yǎng)物，正如可以通過分解組織或多 個(gè)組織所獲得的。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞來自胚胎的臍帶。被輻照細(xì)胞可以來自、或 組織可以來自或包括例如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、多能或全能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng) 元細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、白細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、皮膚細(xì) 胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和/或它們的前體細(xì)胞及其組
口 O
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在許多實(shí)施方案中，細(xì)胞在輻照過程或培養(yǎng)過程中附著于表面。在表面上培養(yǎng) 特別適合于內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞可以由此進(jìn)一步選擇以滿足其他質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，例如它們形成單 層的能力，如果UV劑量引入了過多損傷性改變的話，這種能力可能受到妨礙。在這種 表面上，細(xì)胞可以形成單層。具體來說，細(xì)胞在微載體上培養(yǎng)或輻照?；蛘撸?xì)胞可以 在懸液中輻照或培養(yǎng)或進(jìn)行兩者。最初在表面上輻照或培養(yǎng)的細(xì)胞，后來可以適用于在 懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)。另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)病毒的方法，所述方法包括提供可通過本發(fā) 明的方法獲得的連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞，用所述病毒感染所述細(xì)胞，在所述細(xì)胞中增殖所述 病毒，以及收集所述病毒。在本發(fā)明中，將要生產(chǎn)的病毒選自具有正義或反義的，連續(xù)的或分段的單鏈或 雙鏈(DNA)基因組的有包膜或無包膜的DNA或RNA病毒。病毒可以選自桿狀病毒、 痘病毒、腺病毒、乳多空病毒、細(xì)小病毒、嗜肝DNA病毒、冠狀病毒、黃病毒、披膜病 毒、星狀病毒、小核糖核酸病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、正粘病毒、線狀病毒、副粘病毒、彈狀 病毒、沙粒病毒和布尼亞病毒。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，病毒選自有包膜病毒，包 括黃病毒、披膜病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、彈狀病毒、布尼亞病毒、正 粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒和痘病毒。在其他實(shí)施方案 中，病毒是有包膜病毒例如流感病毒包括流感病毒A、B或C、西尼羅病毒、痘苗病毒、 修飾的痘苗病毒或羅斯河病毒。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，病毒選自有包膜的RNA病 毒，包括黃病毒、披膜病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、彈狀病毒、布尼亞病 毒、正粘病毒、副粘病毒和沙粒病毒。在具體實(shí)施方案中，病毒是MVA(修飾的痘苗病 毒安卡拉)、TBE(蜱媒的腦炎)病毒、黃熱病病毒、西尼羅病毒、新加勒多尼亞病毒或 流感病毒。在收集步驟后，可以通過任何已知的用于病毒滅活的手段使病毒滅活，例如在 美國(guó)專利
發(fā)明者曼弗雷德·賴特爾, 沃爾夫?qū)っ商? 西蒙·馮菲爾克斯, 西蒙·費(fèi)格爾 申請(qǐng)人:巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 巴克斯特國(guó)際公司