專(zhuān)利名稱(chēng)：用于細(xì)胞粘附、培養(yǎng)和分離的方法、表面改性培養(yǎng)板和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專(zhuān)利申請(qǐng)要求于2008年2月21日提交的臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/030, 544的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，并且提供了用于細(xì)胞粘附于固體基底表面、 在固體基底表面上培養(yǎng)以及從固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約 0. 5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于17. 2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表面不含 飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理 細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，用能夠抑制Mio活性的化合物處理細(xì)胞。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是生命與健康科學(xué)中許多進(jìn)程之一。涉及貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的哺 乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)構(gòu)成，其經(jīng)常需要額 外的表面處理以允許細(xì)胞粘附到容器表面。這樣的處理可以包括在表面施加吸附層，例如， 通過(guò)吸附、接枝或等離子體聚合技術(shù)。作為另外一種選擇，表面處理可以借助于容器表面自 身的化學(xué)改性，其可以通過(guò)(例如)大氣華、射頻真空等離子體、直流輝光放電和微波等離 子體處理等實(shí)現(xiàn)。這些表面處理改變表面內(nèi)的元素組成和化學(xué)基團(tuán)。所得的具體化學(xué)組成 取決于表面處理方法、能量和時(shí)間以及所用氣體的組成。例如，US5449383公開(kāi)了一種基底，其包括本體聚合材料和適于支持細(xì)胞生長(zhǎng)的聚 合物薄層，該薄層包含耐再定位的聚合物，該聚合物包含等離子體聚合的酰胺單體，該單體 具有用于細(xì)胞粘附的酰胺基團(tuán)，其中所述酰胺單體選自二甲基甲酰胺和具有式R1-CO-N (R2) R3的酰胺，其中R1為脂族、脂環(huán)族或芳族基團(tuán)，它們中每一個(gè)都可任選地由鹵素原子或羥基 取代，R2和R3各自獨(dú)立地為氫或烷基，并且其中所述聚合物薄層促進(jìn)所述細(xì)胞的粘附和增 殖。又如，EP0348969A1公開(kāi)了一種用于聚合物表面內(nèi)皮化的方法，包括用由含有氮 氣的氣態(tài)物質(zhì)生成的等離子體接觸聚合物表面，以此將所述聚合物表面改性成含有表面氨 基，并將足夠的內(nèi)皮細(xì)胞施加到所述改性表面以在所述含氨基的表面上形成細(xì)胞的鋪滿(mǎn) 層，而無(wú)需細(xì)胞增殖。又如，EP0092302A2公開(kāi)了一種用于影響在基底上的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的生 長(zhǎng)的方法，其特征在于通過(guò)對(duì)該基底的表面進(jìn)行等離子體處理來(lái)改性該基底的表面化學(xué)， 該等離子體由碳、氫、氧、氮、硫、磷、鹵素或這些元素中任何一者的化合物產(chǎn)生。又如，US 6，617，152B2公開(kāi)了一種用于處理聚合物基底表面的設(shè)備，包括(a)氣 體入口、微波能源和等離子混合室，該等離子混合室與氣體入口和微波能源流體連通；(b) 雙室處理區(qū)，其具有包含在外處理室中的內(nèi)處理室，所述內(nèi)處理室有一個(gè)開(kāi)口與所述外部 腔室流體連通；(c)所述等離子混合室與所述外處理室通過(guò)小孔流體連通；(d)連接到所述 外部腔室的真空出口線(xiàn)；以及(e)在此處將所述內(nèi)處理室中的所述開(kāi)口與所述小孔對(duì)齊， 所述開(kāi)口與所述小孔隔開(kāi)預(yù)定的距離。
在一個(gè)例子中，US 2003/0180903A1公開(kāi)了一種聚合物基底，其具有可以在其上培 養(yǎng)細(xì)胞的工作表面，其中表面氧含量為至少25%，這由用于化學(xué)分析的電子顯微鏡在約50 埃的深度測(cè)得。在一個(gè)例子中，W02006114098公開(kāi)了一種用于外科手術(shù)植入物和細(xì)胞弓I導(dǎo)組織培 養(yǎng)表面的微結(jié)構(gòu)生物相容性材料。選擇生物材料表面的微結(jié)構(gòu)以促進(jìn)未分化的ES細(xì)胞的 生長(zhǎng)；促進(jìn)ES細(xì)胞的神經(jīng)元分化；或促進(jìn)ES細(xì)胞的分化。又如，Bigdeli等人(J. Biotechnol. 133 :146-153,2008(《生物技術(shù)》，第 133 卷 第146-153頁(yè)，2008年))描述了一種適應(yīng)和/或選擇待培養(yǎng)的人ES細(xì)胞的方法，使得人 ES細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下不分化并無(wú)需用胞外基質(zhì)蛋白預(yù)處理固體基底表面，該方法 涉及(i)將培養(yǎng)基由人二倍體胚肺成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基更換為新生軟骨細(xì)胞條件培養(yǎng) 基；(ii)然后將細(xì)胞從小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞層通過(guò)酶法傳代至經(jīng)Matrigel 處理的培養(yǎng)板， 然后傳代至Costar 培養(yǎng)板，最后傳代至I^imaria 培養(yǎng)板；以及(iii)再次換回第一次 使用的培養(yǎng)基。經(jīng)此方法處理的很少人ES細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生已建立細(xì)胞系，表明此方法涉及選擇 適于培養(yǎng)條件的人ES細(xì)胞。改變表面自身元素組成和化學(xué)基團(tuán)的表面處理已成功用于制備適于培養(yǎng)多種類(lèi) 型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的聚合物固體基底。然而，使用某些類(lèi)型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，多能干細(xì) 胞和人胚腎(HEK) 293細(xì)胞)時(shí)，弱粘附和/或培養(yǎng)方面有明顯的限制。Graham 等人(J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977 (《普通病毒學(xué)雜志》，第 36 卷第 59-72 頁(yè)，1977年))公開(kāi)了 HEK293細(xì)胞系的生成?？梢栽趯EK293細(xì)胞加入培養(yǎng)容器之前，通過(guò)使用(例如)胞外基質(zhì)蛋白、聚賴(lài) 氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸或聚乙烯亞胺在固體基底表面制備吸附層來(lái)促進(jìn)HEK293細(xì)胞粘附。然而， 制備吸附層很耗時(shí)，并且通常得到非無(wú)菌的固體基底，其儲(chǔ)存壽命比裸露固體基底更短。因 此，明顯需要用于促進(jìn)HEK293細(xì)胞粘附到不含吸附層的固體基底的方法和材料。目前培養(yǎng)多能干細(xì)胞、尤其是胚胎干(EQ細(xì)胞的方法要求復(fù)雜的培養(yǎng)條件，例 如，在具有飼養(yǎng)細(xì)胞層的固體基底表面上或在具有胞外基質(zhì)蛋白的吸附層的固體基底表面 上培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。采用這些方法的培養(yǎng)體系通常使用飼養(yǎng)細(xì)胞或胞外基質(zhì)蛋白，這些飼 養(yǎng)細(xì)胞或胞外基質(zhì)蛋白取自與培養(yǎng)中的干細(xì)胞的物種不同的物種(異種材料)。通過(guò)暴露 于飼養(yǎng)細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基，即未分化ES細(xì)胞之外的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可以用于培養(yǎng)ES細(xì) 胞，并且可以在培養(yǎng)基中添加動(dòng)物血清。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol. 18 :399-404,2000(《自然-生物 技術(shù)》，第 18 卷第 399-404 頁(yè)，2000 年))和 Thompson 等人(Science 282:1145-1147， 1998(《科學(xué)》，第282卷第1145-1147頁(yè)，1998年))公開(kāi)了使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng) 細(xì)胞層來(lái)培養(yǎng)取自人囊胚的ES細(xì)胞系。又如，Xu等人(Nature Biotechnology 19 :971_974，2001 (《自然-生物技術(shù)》，第 19卷第971-974頁(yè)，2001年))公開(kāi)了在無(wú)分化無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞層的人ES細(xì)胞培養(yǎng)之前，使用 Matrigel 和層粘連蛋白處理固體基底表面。又如，Vallier等人(J. Cell Sci. 118 :4495-4509,2005(《細(xì)胞科學(xué)雜志》，第 118 卷第4495-4509頁(yè)，2005年))公開(kāi)了在無(wú)分化無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞層的人ES細(xì)胞培養(yǎng)之前，使用胎 牛血清處理固體基底表面。
又如，W02005014799公開(kāi)了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞維持、增殖和分化的條件培養(yǎng)基。 W02005014799描述了 “根據(jù)本發(fā)明制備的培養(yǎng)基由鼠細(xì)胞、尤其是那些分化的和無(wú)限增殖 化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞(稱(chēng)為MMH(Met鼠肝細(xì)胞))的細(xì)胞分泌活性調(diào)整?！庇秩?，Wanatabe等人(Nature Biotechnol. 35 :681_686，2007 (《自然-生物技術(shù)》， 第35卷第681-686頁(yè)，2007年))描述了“ROCK抑制劑允許分離的人胚胎干細(xì)胞成活”，并且 證實(shí)減少了分離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加了克隆率(從大約增加到大約27%)，促進(jìn)了基 因轉(zhuǎn)移后的亞克隆，該文獻(xiàn)使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用膠原和Matrigel 作為胞外基質(zhì)蛋白，使用Y-27632或法舒地爾抑制ROCK。此外，用Y-27632處理的分離的人 ES細(xì)胞可避免無(wú)血清懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞凋亡。又如，Peerani等人(EMBO Journal 26 :4744-4755,2007(《歐洲分子生物學(xué)組織 雜志》，第沈卷第4744-4755頁(yè)，2007年))描述了“人胚胎干細(xì)胞(hESC)培養(yǎng)物中的空間 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性產(chǎn)生影響hESC命運(yùn)的異質(zhì)微環(huán)境(小生境(niche))。本研究證明可以通過(guò) 改造hESC小生境特性來(lái)控制hESC的分化率和分化軌跡。小生境的大小和組成調(diào)節(jié)分化誘 導(dǎo)因子和抑制因子之間的平衡。在機(jī)制上，Smadl信號(hào)的小生境大小依賴(lài)空間梯度是由于 hESC和hESC來(lái)源的胚外內(nèi)胚層(EXE)之間的拮抗相互作用產(chǎn)生。這些相互作用由骨形成 蛋白2(BMP》的EXE定位分泌及其拮抗劑生長(zhǎng)分化因子3 (⑶F3)的hESC定位分泌介導(dǎo)。 由⑶F3、BMP2和Smadl的小干擾RNA(siRNA)以及Rho相關(guān)激酶(ROCK)抑制劑處理的hESC 的縮微成像證明，對(duì)Smadl激活的獨(dú)立控制可以挽救hESC的集落大小依賴(lài)分化。我們的結(jié) 果首次示出了 Smadl在整合空間信息和小生境大小依賴(lài)控制hESC自我更新和分化中的作田 ，，又如，Koyanagi，M等人(J Neurosci Res. 2007 Sep 7 [Epubahead of print](《神 經(jīng)科學(xué)研究雜志》，2007年9月7日(先于印刷版的電子版)))描述了“已發(fā)現(xiàn)Mio-GTP酶 參與包括神經(jīng)元的多種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞凋亡，但還未完全理解其作用機(jī)制。在此，我們研究 了他0和ROCK在胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元前體細(xì)胞移植期間發(fā)生的細(xì)胞凋亡中的作用。我 們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元前體細(xì)胞的分離激活Mio并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用Mio抑制劑C 3胞外酶和/或 ROCK抑制劑Y-27632處理減少了 20-30%的分離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(失巢凋亡)量。膜空泡 化(其是細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)標(biāo)志)、半胱天冬酶3的切割和細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體的釋放也 因ROCK的抑制而減少。這些結(jié)果表明神經(jīng)元前體細(xì)胞的分離誘發(fā)細(xì)胞死亡的內(nèi)源性通路， 其至少部分地由Mio/ROCK通路介導(dǎo)。此外，在一個(gè)動(dòng)物移植模型中，Mio和/或ROCK的抑 制可減少移植細(xì)胞的急性細(xì)胞凋亡。移植后，腫瘤壞死因子α和神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體在移植 物周?chē)弑磉_(dá)。ROCK抑制也可減少由這些炎性細(xì)胞因子促進(jìn)的細(xì)胞凋亡。綜上所述，這些 結(jié)果表明Mio/ROCK信號(hào)的抑制可以改善細(xì)胞替代療法中移植細(xì)胞的存活。又如，Yoneda等人(J. Cell Biol. 170 :443-453, August 3,2005(《細(xì)胞生物學(xué)雜 志》，第170卷第443-453頁(yè)，2005年8月3日))描述了“據(jù)推定，同源哺乳動(dòng)物rho激酶 (ROCK I和II)是功能冗余的，主要依據(jù)是激酶構(gòu)造過(guò)表達(dá)。作為Iih0 GTP酶的下游效應(yīng) 子，它們主要的底物為肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白磷酸酶。這兩個(gè)激酶都參與微絲束組裝和 平滑肌收縮。在此，成纖維細(xì)胞對(duì)纖粘蛋白的粘附性的分析揭示，雖然ROCK II豐度更高，但 是其活性通常低于ROCK I。盡管存在持久性ROCKII和結(jié)合有鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸的I^hoA， 由siRNA引起的ROCK I特異性減少會(huì)導(dǎo)致應(yīng)力纖維和粘著斑的喪失。相反，微絲細(xì)胞骨架因ROCK II的下調(diào)而增強(qiáng)。對(duì)涂布有纖粘蛋白的小珠的吞噬攝取在清除ROCK II的細(xì)胞中 強(qiáng)烈下調(diào)，但在缺少ROCK I的細(xì)胞中并不下調(diào)。這些效應(yīng)部分源于ROCKpleckstrin同源 結(jié)構(gòu)域的不同脂質(zhì)結(jié)合偏好。ROCK II連接磷脂酰肌醇3，4，5P3，并對(duì)其水平敏感，而ROCK I無(wú)此性質(zhì)。因此，內(nèi)源ROCK被不同調(diào)控并繼而涉及不同的肌球蛋白隔室。”又如，Harb等人(PloS ONE 3(8) :e3001. oi 10. 1371/journal. pone. 0003001, August 2008(《公共科學(xué)圖書(shū)館·綜合》，第3卷第8期第e3001頁(yè)，數(shù)字對(duì)象唯一標(biāo)識(shí)符 (doi) 10. 1371/journal. pone. 0003001，2008 年 8 月))公開(kāi)了 Rho-Rock-肌球蛋白信號(hào) 軸在小鼠和人ES細(xì)胞中調(diào)控基本細(xì)胞-細(xì)胞通訊中的重要作用，并將有助于人類(lèi)多能干細(xì) 胞在醫(yī)學(xué)相容的無(wú)異質(zhì)環(huán)境中的擴(kuò)增[原文如此]。使用異種材料可能不適用于采用多能干細(xì)胞的某些應(yīng)用?？梢允褂每商娲牧?。 例如，Stojkovic 等人(Stem Cells 23 :895-902,2005(《干細(xì)胞》，第 23 卷第 895-902 頁(yè)， 2005年))公開(kāi)了在無(wú)分化無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞層的人ES細(xì)胞培養(yǎng)之前，使用人血清處理固體基底表面。一種可替代的培養(yǎng)體系采用添加了能夠促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ；19 Oct 2005(《生殖生物學(xué)》，數(shù)字對(duì)象唯一標(biāo)識(shí)符10. 1095/biolreprod. 105. 046870,2005年10月19日))公開(kāi)了一種無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞、無(wú)血清培養(yǎng)體系，其中ES細(xì)胞維持于添加有能夠引發(fā) ES細(xì)胞自我更新的不同生長(zhǎng)因子的非條件血清置換培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568_574，2OO6 (《干細(xì)胞》，第 24 卷第 568-574頁(yè)，2006年))公開(kāi)了用于在不含成纖維細(xì)胞或條件培養(yǎng)基情況下使用添加有堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的培養(yǎng)基長(zhǎng)期培養(yǎng)人ES細(xì)胞的方法。又如，US20050148070公開(kāi)了一種在無(wú)血清和無(wú)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的限定培養(yǎng) 基中培養(yǎng)人ES細(xì)胞的方法，此方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種 轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，該 培養(yǎng)基基本上不含哺乳動(dòng)物胎血清，并且含有至少約lOOng/ml能夠激活FGF信號(hào)受體的 FGF，其中提供該生長(zhǎng)因子的來(lái)源不只是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，此培養(yǎng)基支持干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng) 細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開(kāi)了一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞，包括未分化的靈長(zhǎng)類(lèi)原始干細(xì) 胞的限定培養(yǎng)基。在溶液中，此培養(yǎng)基與培養(yǎng)中的干細(xì)胞相比基本上是等滲的。在給定培 養(yǎng)物中，具體的培養(yǎng)基包含基本培養(yǎng)基以及各自一定量的堿性FGF、胰島素和抗壞血酸，這 些成分對(duì)于基本上支持原始干細(xì)胞的未分化生長(zhǎng)是必需的。又如，US6800480描述“在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)生長(zhǎng)靈 長(zhǎng)類(lèi)來(lái)源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內(nèi)毒素堿性培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基對(duì) 于支持靈長(zhǎng)類(lèi)來(lái)源的原始干細(xì)胞的生長(zhǎng)是有效的。堿性培養(yǎng)基混合了有效支持靈長(zhǎng)類(lèi)來(lái)源 的原始干細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細(xì)胞和衍生自飼養(yǎng)細(xì)胞的胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)。 該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長(zhǎng)因子?！庇秩?，US20050244962描述“在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干 細(xì)胞的方法。在基本上不含哺乳動(dòng)物胎血清(優(yōu)選地也基本上不含任何動(dòng)物血清)的培養(yǎng)物中，并在存在由不只是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的來(lái)源提供的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子情況下培養(yǎng) 干細(xì)胞。在一種優(yōu)選的形式中，通過(guò)添加足夠的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，此成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 (以前維持干細(xì)胞培養(yǎng)所需)變成了非必需的?！庇秩?，W020050653M公開(kāi)了一種基本上不含飼養(yǎng)層和血清的限定的等滲培養(yǎng)基， 其包含a.基本培養(yǎng)基；b. —定量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其足以支持基本上未分化 的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的生長(zhǎng)；c. 一定量的胰島素，其足以支持基本上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì) 胞的生長(zhǎng)；以及d. —定量的抗壞血酸，其足以支持基本上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的生長(zhǎng)。又如，W02005086845公開(kāi)了一種用于維持未分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括 將干細(xì)胞暴露于一定量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ)蛋白家族中的一個(gè)成員、成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(FGF)蛋白家族中的一個(gè)成員或煙酰胺(NIC)，使得足以在未分化的狀態(tài)下維持細(xì) 胞足夠時(shí)間，從而獲得所需結(jié)果。多能干細(xì)胞為研究和藥物篩選提供潛在資源。目前，人ES細(xì)胞系的大規(guī)模培養(yǎng)是 困難的，并且?guī)?lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。針對(duì)這些挑戰(zhàn)的可能解決方案是以單細(xì)胞形式傳代和培養(yǎng) 人ES細(xì)胞。單細(xì)胞更適合標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)，例如，計(jì)數(shù)、轉(zhuǎn)染等。例如，Nicolas等人提供了一種用于從單細(xì)胞生產(chǎn)和擴(kuò)增人ES細(xì)胞系的方法， 此單細(xì)胞通過(guò)慢病毒載體進(jìn)行遺傳修飾，然后通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選來(lái)分離(Stem Cells Dev. 16 :109-118,2007(《干細(xì)胞與發(fā)育》，第16卷第109-118頁(yè)，2007年))。又如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2005158852公開(kāi)了一種“用于改善人胚胎干細(xì)胞單細(xì)胞生 長(zhǎng)和存活的方法。此方法包括以下步驟獲得未分化hES單細(xì)胞；將未分化單細(xì)胞與胞外基 質(zhì)混合以包圍該細(xì)胞；以及在含有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)環(huán)境中，將該混合物接種到飼養(yǎng)細(xì)胞 上”。又如，Sidhu等人(Stem Cells Dev. 15 :61_69，2006 (《干細(xì)胞與發(fā)育》，第15卷第 61-69頁(yè)，2006年))描述了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞制備物的分選，首次報(bào)道了三種衍 生自親本系hES3的人ES細(xì)胞克隆hES 3. 1、3. 2和3. 3。然而，人ES細(xì)胞作為單細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)導(dǎo)致遺傳異常和多能性喪失。培養(yǎng)條件 對(duì)于多能性和遺傳穩(wěn)定性的保持是重要的。通常，通過(guò)人工或用酶學(xué)試劑(例如膠原酶、釋 放酶(Iiberase)或分散酶(dispase))進(jìn)行人ES細(xì)胞系的傳代。例如，Draper等人注意到“在三種獨(dú)立的人胚胎干細(xì)胞系中，在五種獨(dú)立的情形 下，涉及17號(hào)染色體長(zhǎng)臂的獲得的核型改變”的存在(Nature Biotechnol. 22 =53-54, 2004 (《自然-生物技術(shù)》，第22卷第53巧4頁(yè)，2004年))。又如，Buzzard等人描述，“我們?cè)?jīng)只檢測(cè)到一個(gè)核型改變事件......考慮到我們的方法與大部分其他研究組所用的方法完全不同，所用的培養(yǎng)方法可能對(duì)我們的結(jié)果......有一些影響。通常我們?cè)?天后通過(guò)首先用破碎的移液管邊緣分離集落來(lái)傳代人ES細(xì)胞......細(xì)胞分離的酶學(xué)或化學(xué)方法未并入該方法中。我們推測(cè)這可以解釋我們擁有的hES(人ES)細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞遺傳彈性(cytogenetic resilience)?！?Nature Biotechnol. 22 :381-382, 2004 (《自然-生物技術(shù)》，第 22 卷第 381-382 頁(yè)，2004 年))。又如，Mitalipova等人.描述了“批量傳代方法......能夠在培養(yǎng)物的擴(kuò)大傳代后保持非整倍性細(xì)胞群，但可用于更短的周期(高達(dá)至少15次傳代)，而無(wú)核型異常......可以在長(zhǎng)期人工增殖條件下，隨后在要求比人工傳代方法單獨(dú)能夠提供的數(shù)量更多的hES細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行有限的批量傳代后，保持hES細(xì)胞中的正常核型?！?(Nature Biotechnol. 23 19-20，2005(《自然-生物技術(shù)》，第 23 卷第 19-20 頁(yè)，2005 年))。又如，Heng等人描述了 “結(jié)果證明第二個(gè)方案(用輕輕抽吸進(jìn)行胰蛋白酶化)比 第一個(gè)方案(用劃痕進(jìn)行膠原酶處理)對(duì)細(xì)胞活力的危害更小。這繼而轉(zhuǎn)化為更高的凍融 存活率?！?Biotechnology and Applied Biochemistry 47 :33-37,2007(《生物技術(shù)與應(yīng) 用生物化學(xué)》，第47卷第33-37頁(yè)，2007年))。又如，Hasegawa等人描述，“我們已經(jīng)建立了耐完全分離的hES細(xì)胞亞系。這些 細(xì)胞顯示具有高傳代效率和高克隆效率，并且它們保持分化成三個(gè)胚層的能力?！?(Stem Cells 24 :2649-2660,2006(《干細(xì)胞》，第 24 卷第洸49-2660 頁(yè)，2006 年))。因此，明顯需要用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和組合物，包括在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和 吸附層、同時(shí)保持細(xì)胞多能性的情況下培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于細(xì)胞粘附于固體基底表面、在固體基底表面 上培養(yǎng)以及從固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約0. 5%的N，0和N 的總數(shù)大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表面不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面的方法，所述表面包含 至少約0.5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表 面不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，所述方法包括以下步驟a.獲得細(xì)胞懸浮液，b.用至少一種選自以下物質(zhì)的化合物處理該細(xì)胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性 的化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將該細(xì)胞懸浮液添加到表面，并使細(xì)胞粘附。在一個(gè)實(shí)施例中，在細(xì)胞粘附于表面后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)替代實(shí)施例中， 去除此至少一種化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)去除此至少一種化合物來(lái)從表面分離細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞懸浮液為細(xì)胞群懸浮液。在一個(gè)替代實(shí)施例中，細(xì)胞懸浮液 為單細(xì)胞懸浮液。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞為多能干細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，細(xì)胞為干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面的方法，所述表面包含 至少約0. 9%的N，0和N的總數(shù)大于或等于22. 3%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表 面不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，所述方法包括以下步驟a.獲得細(xì)胞懸浮液，以及b.將該細(xì)胞懸浮液添加到表面，并使細(xì)胞粘附。
圖1示出了人ES細(xì)胞系Hl的細(xì)胞相差顯微圖(虹)，這些細(xì)胞以用LIBERASE處理的細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板2、3或4上傳代兩次。也示出了培養(yǎng)在用稀釋比為1 30 的Matrigel 處理的培養(yǎng)板上、Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的人ES細(xì)胞系Hl的細(xì)胞圖象。圖2示出了 10 μ M Υ-27632對(duì)人ES細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板的影響。該圖示 出了人ES細(xì)胞系Hl的細(xì)胞相差顯微圖(虹)，這些細(xì)胞以細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3 和4上傳代兩次。然后在含有10 μ M Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板2、 3或4上傳代細(xì)胞。在拍照之前培養(yǎng)細(xì)胞四天。將在不存在Υ-27632的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞 作為對(duì)照。圖3示出了對(duì)培養(yǎng)在本發(fā)明表面改性培養(yǎng)板上的人ES細(xì)胞進(jìn)行化合物處理的時(shí) 間進(jìn)程示意圖。人ES細(xì)胞系Hl細(xì)胞以用LIBERASE處理的細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3 或4上傳代四次，并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。傳代后的前兩天用ΙΟμΜ的他0激酶抑制 劑Υ-27632或0. 5ng/ml的Iih0抑制劑(胞外酶C3轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞可滲透形式)處理細(xì)胞。 用Mio激酶抑制劑Y-27632處理細(xì)胞，隨后每次在表面改性培養(yǎng)板3上傳代后的前兩天用 Y-27632處理細(xì)胞，經(jīng)過(guò)這些處理的細(xì)胞稱(chēng)為“7s”。用Iih0激酶抑制劑Y-27632處理細(xì)胞， 隨后每次在表面改性培養(yǎng)板4上傳代后的前兩天用Y-27632處理細(xì)胞，經(jīng)過(guò)這些處理的細(xì) 胞稱(chēng)為“3s”。每次傳代后，用Mio抑制劑處理細(xì)胞兩天，再用Mio激酶抑制劑Y-27632處理 細(xì)胞兩天，隨后在表面改性培養(yǎng)板3上傳代后的前兩天用Y-27632處理細(xì)胞，經(jīng)過(guò)這些處理 的細(xì)胞稱(chēng)為“5s”。每次傳代后，用Mio抑制劑處理細(xì)胞兩天，再用Mio激酶抑制劑Y-27632 處理細(xì)胞兩天，隨后在表面改性培養(yǎng)板4上傳代后的前兩天用Y-27632處理細(xì)胞，經(jīng)過(guò)這些 處理的細(xì)胞稱(chēng)為“Is”。圖4示出了在根據(jù)圖6概括的方案處理的人ES細(xì)胞中，由qRT-PCR測(cè)定的多能性 與分化相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)。圖5示出了人ES細(xì)胞系Hl細(xì)胞中的多能性標(biāo)記物的表達(dá)，這由流式細(xì)胞術(shù)在第 4代(p4)、第9代(p9)以及第10、11或12代(plO、pll、或pl2)測(cè)定。圖6示出了人ES細(xì)胞系Hl的細(xì)胞免疫熒光圖象，這些細(xì)胞以用LIBERASE處理的 細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板4上連續(xù)傳代，并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。在表面改性培 養(yǎng)板4上培養(yǎng)了傳代11次的細(xì)胞中檢測(cè)到多能性標(biāo)記物相關(guān)蛋白的表達(dá)。每次傳代后，用 10 μ M的Υ-27632處理細(xì)胞兩天。圖7示出了人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)后形成定形內(nèi)胚層的能力。人ES 細(xì)胞系Hl細(xì)胞以用LI BERASE處理的細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3或4上傳代11次， 并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。在第8代(ρ8)和第10或11代(plO-11)，用含有0. 5% FBS、 100ng/ml激活素A和20ng/ml Wnt3a的DMEM :F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞兩天，然后用含有2% FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM :F12培養(yǎng)基再處理細(xì)胞三天。此圖上的Y軸示出了由流 式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的陽(yáng)性CXCR4細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。還可參見(jiàn)表5。圖8示出了人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)后形成胰內(nèi)胚層的能力。人ES細(xì) 胞系Hl細(xì)胞以用LIBERASE處理的細(xì)胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3或4上傳代八次，并培養(yǎng) 于MEF條件培養(yǎng)基中。在第8代(p8)，通過(guò)用含有0. 5% FBS、100ng/ml激活素A和20ng/ ml Wnt3a的DMEM :F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞兩天，然后用含有2% FBS和lOOng/ml激活素A的 DMEM :F12培養(yǎng)基再處理細(xì)胞三天，從而使細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層。用含有2% FBSUOOng/ ml FGF-IO和1 μ M環(huán)巴胺-KAAD的DMEM :F12培養(yǎng)基處理四天后，細(xì)胞進(jìn)一步分化成胚胎前腸。用含有 B-27、100ng/ml FGF-10、1 μ M 環(huán)巴胺-KAAD 和 2 μ M 視黃酸的 DMEM :F12 培養(yǎng)基處理四天后，細(xì)胞分化成胰內(nèi)胚層。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，以檢測(cè)PDX-I (綠色) 和E-鈣粘蛋白(紅色)，并用Hoechst染料(藍(lán)色)確定總細(xì)胞數(shù)目。圖9示出了在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)的人ES細(xì)胞形成胚狀體的能力。圖10示出了在表面改性培養(yǎng)板4上培養(yǎng)的人ES細(xì)胞的核型。圖11示出了用Rho激酶抑制劑(得自EMD biosciences的Y-27632、得自Sigma 的Y-27632、法舒地爾和羥基法舒地爾)處理對(duì)人ES細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板的影響。 在含有所列濃度的所示化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞三天。用結(jié)晶紫為細(xì)胞染色并拍照。圖12示出了 Y-27632對(duì)人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性的劑量反應(yīng)。第 一天將在特定濃度(0、1、2、4或10μΜ&Υ-2763》下的各種濃度的Mio激酶抑制劑Y-27632 添加到培養(yǎng)物中。然后，從第二天開(kāi)始在含有ΙΟμΜ Y-27632的培養(yǎng)基中維持細(xì)胞五天，并 每天更換培養(yǎng)基。在第五天將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板上去除，用0. 5%的結(jié)晶紫為細(xì)胞染色并拍 照。圖13示出了在含或不含10 μ M Y-27632的表面改性培養(yǎng)板2、3或4上傳代四天 后，人ES細(xì)胞集落的形成。圖14示出了在用含或不含ΙΟμΜ Y-27632的Matrigel 處理平板上傳代四天后， 人ES細(xì)胞集落的形成。圖15示出了用Y-27632連續(xù)和間歇處理人ES細(xì)胞對(duì)細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上粘 附性的差異。圖16描述了人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞圖象，這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳代，并在含⑶ 或不含(A) 10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3上接種。接種M小 時(shí)后拍照。圖17描述了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的多能性相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)，使 用TrypLE Express將這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳代5次，并接種到含或不含10 μ M Y-27632 (Y)的表面改性培養(yǎng)板3和4上。X軸上列出了多能性標(biāo)記物，Y軸上示出了陽(yáng)性 細(xì)胞的百分比。圖18描述了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)，這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳 代，并接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上。檢測(cè)10 μ M的Υ-27632⑴對(duì)在Matrigel 上傳代 的細(xì)胞(初始型(nai_ve)，N)和在表面改性培養(yǎng)板上傳代10次的細(xì)胞(適應(yīng)型，A)的細(xì)胞 數(shù)目的影響。X軸上列出了不同的細(xì)胞條件，Y軸示出了除以IO4后的細(xì)胞數(shù)目。圖19描述了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，在此項(xiàng)研究之前，將這些細(xì) 胞以單細(xì)胞形式在Matrigel 處理培養(yǎng)板上傳代。將細(xì)胞以104/cm2的密度接種，并在含或 不含10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3和4上培養(yǎng)。Y軸示出了在 接種后2、3或4天收集的細(xì)胞數(shù)目(除以IO4)。圖20描述了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，在此項(xiàng)研究之前，將這些細(xì) 胞以單細(xì)胞形式在表面改性培養(yǎng)板上傳代10次。將細(xì)胞以IOVcm2的密度接種，并在含或 不含10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3和4上培養(yǎng)。Y軸示出了在 接種后2、3或4天收集的細(xì)胞數(shù)目(除以IO4)。圖21描述了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的圖象，這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳代，并接種到96孔板格式的表面改性培養(yǎng)板2-4和13上。MEF條件培養(yǎng)基含有10 μ M的Υ-27632。 接種48小時(shí)后拍照。圖22示出了來(lái)自人ES細(xì)胞系Η9的細(xì)胞的能力，這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳代，并 接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上以分化成定形內(nèi)胚層。通過(guò)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量CXCR的表 達(dá)來(lái)確定定形內(nèi)胚層形成的程度。研究了 10 μ M Υ-27632對(duì)定形內(nèi)胚層形成的影響。在擴(kuò) 增期間用Υ-27632處理細(xì)胞。將在Matrigel 上擴(kuò)增和分化的細(xì)胞作為對(duì)照。Y軸示出了 由流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的陽(yáng)性CXCR4細(xì)胞的百分比。圖23示出了來(lái)自人ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞的能力，這些細(xì)胞以單細(xì)胞形式傳代，并 接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上以分化成胰內(nèi)胚層。將細(xì)胞接種到表面改性培養(yǎng)板上，培 養(yǎng)于含10 μ M Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基中，并在分化前在表面改性培養(yǎng)板上傳代8次。Y 軸示出了通過(guò)q-PCR在后方前腸期(PF)和表達(dá)激素的內(nèi)分泌細(xì)胞期(EN)測(cè)定的胰分化標(biāo) 記物(Ngn3、Pdxl、胰島素)表達(dá)增加的倍數(shù)。圖M示出了人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第50代人H9 ES細(xì)胞 以1 2的稀釋比接種到表面3和4以及CellBIND 和Primaria 上。在接種24小時(shí)后 將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結(jié)晶紫為細(xì)胞染色并拍照。箭頭指示的是集落。圖25示出了人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第50代人H9 ES細(xì)胞 以1 2的稀釋比接種到含各種濃度￥-27632(0、1、2、4、10和20微摩爾)的表面3和4以 及CellBIND 和I^imaria 上。在接種M小時(shí)后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結(jié)晶 紫為細(xì)胞染色并拍照。集落在孔上是黑點(diǎn)。箭頭用于突出顯示未處理孔上的集落。圖沈示出了人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第53代人H9ES細(xì)胞以 1 3的稀釋比接種到含或不含Y-27632(0或20微摩爾)的表面2-4和13以及CellBIND 和I^imaria 上。在接種48小時(shí)后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結(jié)晶紫為細(xì)胞染色 并拍照。集落在孔上是黑點(diǎn)。箭頭用于突出顯示未處理孔上的集落。圖27示出了將人H9 ES細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板14和15上的第一次試驗(yàn)(10 月)和第二次試驗(yàn)(12月)，以及將人Hl ES細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板14和15的試驗(yàn)。 將第42代和第53代的人H9 ES細(xì)胞、第57代的人Hl ES細(xì)胞以1 2或1 3的稀釋比 接種到含20微摩爾Y-27632的改性表面上。在接種M-48小時(shí)后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除， 用0.5%的結(jié)晶紫為細(xì)胞染色并拍照。集落在孔上是黑點(diǎn)。箭頭用于突出顯示培養(yǎng)板上的 集落。圖觀示出了人ES細(xì)胞在限定培養(yǎng)基mTeSR 中在表面改性培養(yǎng)板4上的粘附性。 將第50代人H9 ES細(xì)胞以1 2的稀釋比接種到在孔中含或不含Y-27632(0或20微摩爾) 的改性表面上，孔用蛋白(0. 明膠、2%BSA、0.3^ig/ml大鼠I型膠原、稀釋比為1 1000 的Matrigel 或稀釋比為1 5000的Matrigel )處理或不處理。在接種48小時(shí)后將培 養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結(jié)晶紫為細(xì)胞染色并拍照。集落在孔上是黑點(diǎn)。圖四示出了用靜滴法在11周內(nèi)測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。在表面處理 和消毒一周后進(jìn)行第一次測(cè)量。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均接觸角(每一滴測(cè)量一次，共7滴)。 在與表面1-4和13相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量在Nuclon Delta 和CellBIND 培養(yǎng)板上的接觸 角，但在第一次測(cè)量之前，進(jìn)行表面處理和消毒12周以上(在第一次測(cè)量之前消毒Nuclon Delta * —周)。
圖30示出了用帶正電的結(jié)晶紫的表面反應(yīng)性測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板上的負(fù)電荷 密度。檢測(cè)每個(gè)表面的三個(gè)樣品，對(duì)來(lái)自每個(gè)樣品的解吸結(jié)晶紫的吸光度測(cè)量重復(fù)進(jìn)行三 次。給出了九次測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖31示出了固體基底表面和Y-27632對(duì)培養(yǎng)于化學(xué)成分限定的無(wú)血清 ftx)293a-CDMTM培養(yǎng)基(A)或培養(yǎng)于添加有10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基(B)中的HEK 293 細(xì)胞的粘附性和生長(zhǎng)的影響。將HEK293細(xì)胞接種在具有CellBIND 表面、Nunclon Delta 表面或表面4的96孔板中。粘附于這些表面的HEK293細(xì)胞的數(shù)目作為培養(yǎng)條件和Y-27632 濃度的函數(shù)顯示。細(xì)胞受到(i)在培養(yǎng)過(guò)程中用Y-27632連續(xù)處理96小時(shí)(Y-27632 96 小時(shí)接觸)；或(ii)在培養(yǎng)過(guò)程中用Y-27632連續(xù)處理48小時(shí)，隨后更換培養(yǎng)基，然后在 培養(yǎng)過(guò)程中在不含Y-27632情況下處理48小時(shí)(Y-2763248小時(shí)接觸/48小時(shí)不接觸)。 在不含有Y-27632的培養(yǎng)基(不含Y-2763》中培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞以與在含有Y-27632的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞同樣的方式操作，也就是說(shuō)，不更換培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)96小時(shí)，或 處理48小時(shí)后更換培養(yǎng)基。當(dāng)施加濃度為2. 0和5. 0 μ M時(shí)，Y-27632可促進(jìn)HEK293細(xì)胞 粘附于表面4和CellBIND 表面。孵育48小時(shí)后去除Y-27632導(dǎo)致大量細(xì)胞從表面4和 CellBIND 表面分離。示出了三次測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖32示出了固體基底表面以及Mio激酶抑制劑Y-27632和H-1152對(duì)HEK293細(xì) 胞在添加有10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)的影響。將HEK293細(xì)胞接種到具有表面 4(A)或未處理的(但用25kGy的、射線(xiàn)照射過(guò))聚苯乙烯表面(B)的Multidish M孔培養(yǎng)板上。圖33示出了 H-1152和表面4對(duì)HEK293細(xì)胞粘附性和形態(tài)的影響。將HEK293細(xì) 胞接種到Multidish 12孔培養(yǎng)板中的添加有10%胎牛血清和H-1152的EMEM培養(yǎng)基中，并 在自動(dòng)的、位于培養(yǎng)箱內(nèi)的顯微鏡內(nèi)孵育67小時(shí)。A中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和B中的顯微照片示出了 H-1152對(duì)HEK293細(xì)胞在表面4上的粘附性和生長(zhǎng)的一般影響，以及更換培養(yǎng)基對(duì)HEK293 細(xì)胞在含或不含H-1152的表面4上的粘附性和形態(tài)的影響。圖；34示出了生長(zhǎng)在含或不含2. 5μΜ Y-27632的表面4和NunclonDelta 表面上 的HEK293細(xì)胞的3次傳代的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。通過(guò)胰蛋白酶化將生長(zhǎng)在添加有10%胎牛血清的 EMEM培養(yǎng)基中的HEK293細(xì)胞傳代3次。圖35示出了 I^ho激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板 么“和⑴以及押加虹化““上的影響。在所有表面上，孔A和B為對(duì)照孔?？證和D含有 ΙΟμΜΥ-27632?？?E 和 F 含有 3 μ M Η1152 甘氨酰(H1152_glycyl)?？?G 禾口 H 含有 10 μ M Η1152甘氨酰。圖36示出了他0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板30上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM Η1152甘氨酰的吸附層。圖37示出了他0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板31上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖38示出了他0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板32上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖39示出了他0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板33上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM Η1152甘氨酰的吸附層。圖40示出了他0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞系Hl細(xì)胞粘附于表面改性培養(yǎng)板34上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖41示出了用靜滴法在40周內(nèi)測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。圖42示出了用靜滴法測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。圖43示出了用帶正電的結(jié)晶紫的表面反應(yīng)性測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板上的負(fù)電荷也/又。圖44示出了用帶正電的結(jié)晶紫的表面反應(yīng)性測(cè)量的表面改性培養(yǎng)板4、22-M和 29上的負(fù)電荷密度。檢測(cè)每個(gè)表面的三個(gè)樣品，對(duì)來(lái)自每個(gè)樣品的解吸結(jié)晶紫的吸光度測(cè) 量重復(fù)進(jìn)行三次。將表面4、22-對(duì)和四的負(fù)電荷密度歸一化到Nunclon Delta 表面的負(fù) 電荷密度。給出了九次測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實(shí)施例方式為了以不受限制的方式清晰說(shuō)明本公開(kāi)，將本發(fā)明的具體實(shí)施方式
分成下列描述 或闡明本發(fā)明某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用的小節(jié)。^X如本文所用，“吸附層”是指在固體基底表面上通過(guò)共價(jià)鍵(也稱(chēng)為接枝)或非共 價(jià)鍵(也稱(chēng)為吸附)將分子附著在表面上而形成的一層。用于制備吸附層的分子可以為 (例如)蛋白質(zhì)分子，其可包括(例如)胞外基質(zhì)蛋白、氨基酸等，還可以為非生物分子，例 如，聚乙烯亞胺?！?β細(xì)胞系”是指這樣的細(xì)胞，其具有轉(zhuǎn)錄因子PDX-I和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一 種的陽(yáng)性基因表達(dá)NGN-3、Nkx 2. 2、Nkx6. l、NeuroD、Isl-1、HNF_3 3、MAFA、Pax4 和 Pax6。 表達(dá)β細(xì)胞系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中 的至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞S0X-17、GATA-4、HNF-3 β、GSC、CerU Nodal、FGF-8、短尾蛋白 (Brachyury)、Mi χ 樣同源盒蛋白、FGF-4CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF_17、GATA_6、 CXCR4、C-Kit、⑶99或0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原 條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至 少一種標(biāo)記物的細(xì)胞PDX-1、HNF-I β、PTF-I α、HNF-6或HB9。表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo) 記物的細(xì)胞包括胰內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至 少一種標(biāo)記物的細(xì)胞NGN-3、NeuroD, Islet-U PDX-U NKX6. 1、Pax_4、Ngn-3 或 PTF-1 α。 表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞包括胰內(nèi)分泌細(xì)胞、表達(dá)胰激素的細(xì)胞、分泌胰激素 的細(xì)胞和β細(xì)胞系的細(xì)胞。
如本文所用，“定形內(nèi)胚層”是指具有以下特征的細(xì)胞這些細(xì)胞來(lái)自原腸胚形 成期間的外胚層并形成胃腸道及其衍生物。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)記物CXCR4、 HNF-3 β、GATA-4、S0X-17, Cerberus、0TX2、鵝素(goosecoid)、c_Kit、CD99 和 Mixll?！鞍饣|(zhì)蛋白”是指通常在體內(nèi)或胎盤(pán)內(nèi)的細(xì)胞間發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子。胞外基質(zhì) 蛋白可以來(lái)自組織、體液(例如血液)或非重組細(xì)胞條件培養(yǎng)基或重組細(xì)胞條件培養(yǎng)基或 細(xì)菌條件培養(yǎng)基。如本文所用，“胚外內(nèi)胚層”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞群 S0X-7、AFP 禾P SPARC?！癏EK293細(xì)胞”是指由正常人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化而來(lái)的細(xì)胞系，如Graham等人 (J. Gen. Virol. 36 =59-72,1977)所述，并且也指衍生自此親本細(xì)胞系的任何細(xì)胞。如本文所用，“標(biāo)記物”是指在所關(guān)注細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的核酸或多肽分子。在上下 文中，差異表達(dá)是指對(duì)于陽(yáng)性標(biāo)記物而言表達(dá)水平升高，對(duì)于陰性標(biāo)記物而言表達(dá)水平下 降。與其他細(xì)胞相比，所關(guān)注細(xì)胞中的核酸或多肽標(biāo)記物的可檢測(cè)水平足夠高或足夠低，使 得可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法識(shí)別所關(guān)注細(xì)胞，并將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。如本文所用，“基質(zhì)”是指細(xì)胞可粘附的三維支架。如本文所用，“中內(nèi)胚層細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、S0X-17, DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF-17, GATA-6。如本文所用，“胰內(nèi)分泌細(xì)胞”或“表達(dá)胰激素的細(xì)胞”是指能夠表達(dá)下列激素中的 至少一種激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。如本文所用，“分泌胰激素的細(xì)胞”是指能夠分泌下列激素中的至少一種激素的細(xì) 胞胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。如本文所用，“原條前體細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞 Nodal 或 FGF-8。如本文所用，“原條細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)記物中的至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞短尾 蛋白、Mi χ樣同源盒蛋白或FGF-4。如本文所用，“表面，，是指旨在用于細(xì)胞培養(yǎng)或分析的固體基底容器或基質(zhì)的分子 最外層?？梢苑謩e用X射線(xiàn)光電子能譜(XPQ、原子力顯微鏡(AFM)和接觸角測(cè)量來(lái)分析表 面的元素組成、粗糙度和潤(rùn)濕性?！氨砻娓男耘囵B(yǎng)板”是指含有在實(shí)例16、17和沈中描述的表面1-34中的任何 一種表面的容器，或含有以商品名為Nunclon Delta 、Costar 、Falcon , CellBIND 和 I^imaria 出售的表面的培養(yǎng)板。容器可以(例如)由諸如聚苯乙烯(PS)、環(huán)烯烴共聚物 (COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或苯乙烯丙烯腈共聚物(SAN)等聚合物制 成。干細(xì)胞為未分化細(xì)胞，可定義為其在單細(xì)胞水平具有自我更新和分化以產(chǎn)生后代 細(xì)胞的能力，包括自我更新的祖細(xì)胞、非更新的祖細(xì)胞和最終分化的細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還 在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞系的功能細(xì)胞 的能力、移植后產(chǎn)生多種胚層的組織的能力以及注射入囊胚后基本上有助于大部分(如果 不是所有的話(huà))組織形成的能力。根據(jù)它們的發(fā)育潛能將干細(xì)胞分為(i)全能干細(xì)胞，意指能夠產(chǎn)生所有胚胎或胚外細(xì)胞類(lèi)型；(ii)多能干細(xì)胞，意指能夠產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類(lèi)型；(iii)專(zhuān)能干細(xì)胞，意 指能夠產(chǎn)生一個(gè)亞群的細(xì)胞系，但這些細(xì)胞系都位于特定的組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)(例 如，造血干細(xì)胞(HSC)能夠產(chǎn)生包括HSC(自我更新)、血細(xì)胞限制性寡能祖細(xì)胞和為血液正 常組分的所有細(xì)胞類(lèi)型和成分(如血小板)的后代；(iv)寡能干細(xì)胞，意指能夠產(chǎn)生比專(zhuān) 能干細(xì)胞更為限制的亞群的細(xì)胞系；以及(ν)單能干細(xì)胞，意指能夠產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞系(如精 子發(fā)生干細(xì)胞)。分化是這樣一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，非特化的(“非定向的”)或少特化的細(xì)胞可 獲得特化細(xì)胞(例如，神經(jīng)細(xì)胞或肌細(xì)胞)的特征。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已經(jīng) 在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于分化過(guò)程時(shí)，術(shù)語(yǔ)“定向 的”是指已經(jīng)在分化通路中進(jìn)行到一定程度的細(xì)胞，其中在正常情況下，該細(xì)胞將繼續(xù)分化 成特定的細(xì)胞類(lèi)型或一個(gè)亞群的細(xì)胞類(lèi)型，并且在正常情況下，不能分化成不同的細(xì)胞類(lèi) 型或回復(fù)至更少分化的細(xì)胞類(lèi)型。去分化是指這樣一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，細(xì)胞回復(fù)至細(xì) 胞譜系內(nèi)更少特化的(或定向的)位置。如本文所用，細(xì)胞譜系限定了細(xì)胞遺傳性，也就是 說(shuō)，它來(lái)自哪種細(xì)胞和它能夠產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì) 劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)記物是指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞表型特異性相關(guān)并能夠用于評(píng)價(jià)非定向 細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化的特征。各種術(shù)語(yǔ)用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！熬S持”通常是指在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂條 件下，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，這些條件可以或不可以產(chǎn)生更大的細(xì)胞群?！皞鞔笔侵冈?促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂條件下，從一個(gè)培養(yǎng)容器移去細(xì)胞并將它們接種到第二個(gè)培養(yǎng)容 器的過(guò)程。細(xì)胞或細(xì)胞系的特定群體有時(shí)是指或特征在于其已傳代的次數(shù)。例如，一個(gè)已傳 代了十次的培養(yǎng)細(xì)胞群可以指Pio培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)，即，將細(xì)胞從組織分離后的第一次培 養(yǎng)，指定為Po。第一次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為第二培養(yǎng)物(Pl或第1代)。第二次傳代 培養(yǎng)后，細(xì)胞成為第三培養(yǎng)物(P2或第2代)，以此類(lèi)推。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在傳 代期間，可以有多次群體倍增；因此，培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)大于傳代數(shù)。細(xì)胞在傳代間隔的 時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)增(即，群體倍增數(shù))取決于多種因素，包括(但不限于)接種密度、基底、培養(yǎng) 基、生長(zhǎng)條件和傳代間隔的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面上的方法，該表面含有 至少約0. 9%的N，0和N的總數(shù)大于或等于22. 3%，接觸角為至少約13. 9度，并且該表面 不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，該方法包括以下步驟a.獲得細(xì)胞懸浮液，以及b.將細(xì)胞懸浮液添加到表面，并使細(xì)胞粘附。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面上的方法，該表面含有 至少約0.5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且該表面 不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，該方法包括以下步驟a.獲得細(xì)胞懸浮液，b.用選自下列物質(zhì)的至少一種化合物處理細(xì)胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性的 化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將細(xì)胞懸浮液添加到表面，并使細(xì)胞粘附。
在一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞懸浮液為細(xì)胞群懸浮液。在一個(gè)替代實(shí)施例中，該細(xì)胞懸 浮液為單細(xì)胞懸浮液。在一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞為多能干細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施例中，該細(xì)胞為干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該表面具有吸附層。在一個(gè)實(shí)施例中，該吸附層為胞外基質(zhì) 組分，例如，衍生自基底膜或可以形成一部分粘附分子受體-配體偶聯(lián)物的胞外基質(zhì)組 分。在一個(gè)實(shí)施例中，該吸附層由MATRIGEL(Becton Dickenson)制成。MATRIGEL是由 Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細(xì)胞制備的可溶性制品，其在室溫形成凝膠，從而形成重組基 底膜。蛋白質(zhì)吸附層也可以由層粘連蛋白、纖粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等單 獨(dú)或以各種組合形成。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞在粘附于表面后進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)替代實(shí)施例中，在細(xì)胞粘 附于表面后，去除此至少一種化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)去除此至少一種化合物來(lái)從表 面分離細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，用能夠抑制Iih0激酶活性的至少一種化合物處理該細(xì)胞懸浮 液。在一個(gè)替代實(shí)施例中，用能夠抑制Mio活性的至少一種化合物處理該細(xì)胞懸浮液。在 一個(gè)替代實(shí)施例中，用能夠抑制I^ho激酶活性的至少一種化合物和能夠抑制Mio活性的至 少一種化合物處理該細(xì)胞懸浮液。能夠抑制他0激酶活性的此至少一種化合物選自以下物質(zhì)Y-27632、法舒地爾和羥基法舒地爾。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制Iiho激酶活性的此至少一種化合物為Υ-27632。能夠抑制Iih0激酶活性的此至少一種化合物可以在約0. 1 μ M至約100 μ M的濃度 下使用。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制Mio激酶活性的此至少一種化合物在約10 μ M的濃度 下使用。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制Iiho活性的此至少一種化合物為Mio GTP酶抑制劑。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制Iih0活性的此至少一種化合物為胞外酶C3轉(zhuǎn)移酶。能夠抑制Iih0活性的此至少一種化合物可以在約0. 01 μ g/ml至約5 μ g/ml的濃 度下使用。在一個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制Mio活性的此至少一種化合物在約0. 5 μ g/ml的濃 度下使用。表面改性培養(yǎng)板適用于本發(fā)明的表面改性培養(yǎng)板可以為其表面經(jīng)過(guò)改性的容器，該表面包含至少 約0. 5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于17. 2%，并且接觸角為至少約13. 9度。作為另外一 種選擇，該表面可以為三維基質(zhì)，例如，細(xì)胞可以粘附于其上的多孔支架。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約0. 5%的 N，0和N的總數(shù)大于或等于17.2%，并且接觸角為至少約13.，度。在一個(gè)替代實(shí)施例中， 表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約0. 5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于 19.5%，并且接觸角為至少約13. 9度。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.3%的 N，0和N的總數(shù)為至少約24. 9%，并且接觸角為至少約20. 7度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板1。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1. 7%的N，0和N的總數(shù)為至少約四.6%，并且接觸角為至少約14. 3度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板2。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約2. 0%的 N，0和N的總數(shù)為至少約30.7%，并且接觸角為至少約18. 4度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板3。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約2. 的 N，0和N的總數(shù)為至少約30.2%，并且接觸角為至少約17. 4度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板4。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.8%的 N，0和N的總數(shù)為至少約觀.2%，并且接觸角為至少約18. 8度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板13。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.0% 的N，0和N的總數(shù)為至少約27.8%，并且接觸角為至少約44. 3度，該培養(yǎng)板以商品名 CELLBIND 出售。在一個(gè)實(shí)施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約10. 2% 的N，0和N的總數(shù)為至少約23.0%，并且接觸角為至少約39. 5度，該培養(yǎng)板以商品名 PRIMARIA 出售。表面改件培養(yǎng)板的特件描沭在一個(gè)實(shí)施例中，可以用X射線(xiàn)光電子能譜(XPQ來(lái)分析表面改性培養(yǎng)板表面 的元素組成。XPS，也稱(chēng)為化學(xué)分析電子能譜(ESCA)，用作確定什么元素或原子存在于固 體基底表面(可以檢測(cè)濃度小于0.1原子百分?jǐn)?shù)的除氫和氦以外的所有元素)并確定 這些元素或原子的鍵合環(huán)境的方法。作為一個(gè)例子，對(duì)聚苯乙烯(只含有碳和氫)固體 樣品的XPS分析通常將給出大于97%的碳、小于3%的氧和0%的氮(不能檢測(cè)氫；由于 聚苯乙烯鏈在表面的氧化，例如，由于輻射消毒，可以檢測(cè)到不同水平的氧)(Brevig et al. . , Biomaterials 26 :3039-3053,2005 ；Shen and Horbett, J.Biomed. Mater. Res. 57 336-345, 2001 (Brevig等人，《生物材料》，第洸卷第3039-3053頁(yè)，2005年；Shen和 Horbett,《生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志》，第57卷第336-345頁(yè)，2001年))。在一個(gè)實(shí)施例中，可以用原子力顯微鏡(AFM)來(lái)分析表面改性培養(yǎng)板的表面粗糙 度?？梢杂肁FM以低于1 A的水平分辨率和低于0. 1 A的垂直分辨率為表面原子或分子成 像。在一個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)測(cè)量接觸角來(lái)分析表面改性培養(yǎng)板的表面潤(rùn)濕性。例 如，使用靜滴法進(jìn)行的接觸角測(cè)量提供了固體基底表面和液體表面之間相互作用的信息。 接觸角描述停留在固體基底表面上的液滴的形狀，其是固體基底表面上的液體接觸角，并 在液、固和氣三相交界的接觸線(xiàn)處的液體內(nèi)測(cè)得。具有大于90°的水接觸角的表面稱(chēng)為疏 水的，具有小于90°的水接觸角的表面稱(chēng)為親水的。在極其親水的表面，也就是說(shuō)，對(duì)水具 有高親和力的表面，小水滴將完全鋪展(有效接觸角為0° )。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)量結(jié)晶紫與表面的反應(yīng)性來(lái)分析表面改性培養(yǎng)板表面的 負(fù)電荷密度。結(jié)晶紫帶有正電荷，使得其能夠結(jié)合到帶負(fù)電的分子和分子部分上，例如，聚 合物表面上的帶負(fù)電的官能團(tuán)。如果表面具有相同的粗糙度和面積，則具有高結(jié)晶紫反應(yīng)性的表面比具有低結(jié)晶紫反應(yīng)性的表面具有更高密度的負(fù)電荷。多能干細(xì)胞多能干細(xì)胞的特件描述多能干細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種階段特異性胚胎抗原(SSEA) 3和4、以及可使用 稱(chēng)為 Tra-1-60 和 Tra-1-81 的抗體檢測(cè)的標(biāo)記物(Thomson et al.，Science 282 :1145 1998 (Thomson等人，《科學(xué)》，第282卷第1145頁(yè)，1998年))。多能干細(xì)胞在體外的分化導(dǎo) 致SSEA-4、Tra-1-60和 ει-1-81表達(dá)的喪失(如果存在的話(huà))以及SSEA-I表達(dá)的增加。 未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，其可以通過(guò)用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，然 后用Vector Red作為底物顯影來(lái)檢測(cè)，如制造商所述(Vector Laboratories (Burlingame Calif.))。未分化的多能干細(xì)胞通常也表達(dá)Oct-4和TERT，如由RT-PCR所檢測(cè)。增殖的多能干細(xì)胞的另一期望表型是有潛能分化成所有三個(gè)胚層的細(xì)胞內(nèi)胚 層、中胚層和外胚層組織。可以通過(guò)如下方式來(lái)確定干細(xì)胞的多能性例如，將細(xì)胞注射入 重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4%的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后對(duì)其進(jìn)行組 織學(xué)檢測(cè)，找出來(lái)自三個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型的證據(jù)。作為另外一種選擇，可以通過(guò)產(chǎn)生胚狀體 并評(píng)估胚狀體中三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)記物的存在來(lái)確定多能性。可以使用標(biāo)準(zhǔn)G帶技術(shù)并比較已公布的相應(yīng)靈長(zhǎng)類(lèi)物種的核型來(lái)分析增殖的多 能干細(xì)胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，其意指細(xì)胞為整倍體，其中所有人 染色體都存在并且沒(méi)有明顯的改變。多能干細(xì)胞的來(lái)源可以使用的多能干細(xì)胞類(lèi)型包括，衍生自妊娠后形成的組織的已建立多潛能細(xì)胞 系，妊娠后形成的組織包括取自妊娠期間任何時(shí)期(通常但不一定在妊娠約10-12周之前) 的胚前組織(例如，囊胚)、胚胎組織或胎兒組織。非限制性例子為已建立的人ES細(xì)胞系或 人胚胎生殖細(xì)胞系，例如，人ES細(xì)胞系H1、H7和H9 (WiCell)。也可設(shè)想的是，在此類(lèi)細(xì)胞的 初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開(kāi)的組合物，在此情況下，源細(xì)胞將是直接取自源組織的原 代多能細(xì)胞。也適用的是，取自已經(jīng)在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群以及 已經(jīng)在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群的細(xì)胞。也適用的是，人ES細(xì)胞系的突 變體，例如，BGOlv(BresaGen(Athens, GA))。也適用的是，來(lái)源于成人體細(xì)胞的細(xì)胞，例如， 在 Takahashi et alCell 131 1-12 (2007) (Takahashi 等人于《細(xì)胞》，第 131 卷第 1-12 頁(yè) 2007年)中公開(kāi)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，按照Thomson等人(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，843，780 ;Science 282 1145，1998(《科學(xué)》，第沘2 卷第 1145 頁(yè)，1998 年)；Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133ff.， 1998(《發(fā)育生物學(xué)當(dāng)代論題》，第38卷第133頁(yè)幾段，1998年)；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995 (《美國(guó)科學(xué)院院刊》，第92卷第7844頁(yè)，1995年)所描述方法制備人 ES細(xì)胞。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個(gè)實(shí)施例中，在按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)之前，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在以多種方 式支持多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層或胞外基質(zhì)蛋白上。例如，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在支持多能 干細(xì)胞增殖而不進(jìn)行大量分化的飼養(yǎng)細(xì)胞層上。使用以下物品支持多能干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞 層上無(wú)分化的生長(zhǎng)(i)獲得含有飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)容器；以及(ii)通過(guò)預(yù)先與另一細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)來(lái)調(diào)整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基，例如，無(wú)血清或甚至化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基。又如，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞、但支持多能干細(xì)胞增殖而不進(jìn) 行大量分化的培養(yǎng)體系中。使用以下物品支持多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)中無(wú)分化的生 長(zhǎng)(i)具有一種或多種胞外基質(zhì)蛋白的固體基底表面上的吸附層；以及(ii)通過(guò)預(yù)先與 另一細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)來(lái)調(diào)整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基，例如，無(wú)血清或甚至化學(xué)成分限定 的培養(yǎng)基。在一個(gè)替代實(shí)施例中，將多能干細(xì)胞培養(yǎng)在表面改性培養(yǎng)板上，該表面改性培養(yǎng) 板包含至少約0.5%的N，0和N的總數(shù)大于或等于17.2%，并且接觸角為至少約13. 9度， 并培養(yǎng)于通過(guò)預(yù)先與另一細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)調(diào)整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基中，例如，無(wú)血清 或甚至化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以在US20020072117中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的例子?？梢?在US6642048中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽赪02005014799 中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子。可以在Xu等人(Stem Cells 22: 972-980,2004(《干細(xì)胞》，第22卷第972-980頁(yè)，2004年))中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞 培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽赨S20070010011中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外 一個(gè)例子。可以在 Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ； 190ct 2005 (Cheon等人，《生殖生物學(xué)》，數(shù)字對(duì)象唯一標(biāo)識(shí)符10. 1095/biolreprod. 105. 046870， 2005年10月19日))中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽?Levenstein 等人(Stem Cells 24 :568-574,2006(《干細(xì)胞》，第 24 卷第 568_574 頁(yè)，2OO6 年))中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽赨S20050148070中找到 適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽赨S20050233446中找到適用于本發(fā) 明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子?？梢栽赨S6800480中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基 的另外一個(gè)例子?？梢栽赨S20050244962中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè) 例子?？梢栽赪020050653M中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子。可以在 W02005086845中找到適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的另外一個(gè)例子。合適的培養(yǎng)基也可以由下列組分制成，例如，Dulbecco改進(jìn)的fegle培 養(yǎng)基(DMEM)、Gibco#l 1965-092、Knockout Dulbecco 改進(jìn)的 Eagle 培養(yǎng)基(K0 DMEM), Gibco#10829-018, Ham ‘ s F12/50 % DMEM 基本培養(yǎng)基、200mM L-谷氨酰胺、 Gibco#15039-027、非必需氨基酸溶液、Gibcolll40_050、β -巰基乙醇、Sigma#M7522、人重 組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、Gibco#13256-029。多能干細(xì)胞的分化在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使多能干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中增殖，同時(shí)保持其多能性。 可通過(guò)檢測(cè)多能性相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平的變化來(lái)測(cè)定細(xì)胞多能性隨時(shí)間變化。作為另外 一種選擇，還可通過(guò)檢測(cè)分化相關(guān)標(biāo)記物或另一細(xì)胞類(lèi)型相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平的變化來(lái) 監(jiān)測(cè)多能性的變化。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使多能干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中增殖，并以促進(jìn)其分化為另一 細(xì)胞類(lèi)型的方式處理多能干細(xì)胞。其他細(xì)胞類(lèi)型可為表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì) 胞。作為另外一種選擇，細(xì)胞類(lèi)型可為表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。作為另外一 種選擇，細(xì)胞類(lèi)型可為表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。作為另外一種選擇，細(xì)胞類(lèi)型可為表達(dá)β細(xì)胞系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域的任何合適方法分化為多種 其他細(xì)胞類(lèi)型。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞寸。例如，根據(jù)W02007030870中公開(kāi)的方法，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細(xì)胞可 分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。又如，根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利6，458，589中公開(kāi)的方法，根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干 細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞。例如，根據(jù) D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541, 2005 (D' Amour 等人，《自然-生物技術(shù)》，第23卷第1534-1541頁(yè)，2005年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可 分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，根據(jù)Shinozaki et al. , Development 131 1651-1662，2004 (Shinozaki 等 人，《發(fā)育》，第131卷第1651-1662頁(yè)，2004年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可分化為表達(dá)定 形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，根據(jù)McLean et al.，Stem Cells 25 :29-38, 2007 (McLean 等人，《干細(xì)胞》， 第25卷第四-38頁(yè)，2007年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征 性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，根據(jù) D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術(shù)》，第M卷第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可 分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物選自SOX17、GATA4、Hnf-3 0、GSC、Cerl、Nodal、FGF-8、 短尾蛋白、Mix樣同源盒蛋白、FGF-4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF-17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99以及0TX2。適用于本發(fā)明的細(xì)胞為表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層系特征性 標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為原條前體 細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè) 替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。例如，根據(jù) D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術(shù)》，第M卷第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可 分化為表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物選自Pdxl、HNF-I β、PTFla、HNF-6、HB9和PR0X1。適用 于本發(fā)明的細(xì)胞為表達(dá)至少一種胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 表達(dá)胰內(nèi)胚層系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為胰內(nèi)胚層細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域的任何方法可使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的 細(xì)胞。例如，根據(jù) D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術(shù)》，第M卷第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可 分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。例如，根據(jù) D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour等人，《自然-生物技術(shù)》，第M卷第1392-1401頁(yè)，2006年)中公開(kāi)的方法，多能干細(xì)胞可 分化為表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物選自NGN-3、神經(jīng)源性分化蛋白(NeuroD)、Islet-U Pdx-UNKX6. l、Pax-4、Ngn-3以及PTF-I α。在一個(gè)實(shí)施例中，胰內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)至少 一種以下激素胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的細(xì)胞為表達(dá)至少 一種胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰內(nèi)分泌系特征性標(biāo)記 物的細(xì)胞為胰內(nèi)分泌細(xì)胞。胰內(nèi)分泌細(xì)胞可為表達(dá)胰激素的細(xì)胞。作為另外一種選擇，胰 內(nèi)分泌細(xì)胞可為分泌胰激素的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰內(nèi)分泌細(xì)胞為表達(dá)β細(xì)胞系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞。表 達(dá)β細(xì)胞系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞表達(dá)Pdxl以及至少一種以下轉(zhuǎn)錄因子NGN-3、Nkx2. 2、 Nkx6. 1、神經(jīng)源性分化蛋白、Isl-I、HNF-3 β、MAFAJaxA和1^x6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表 達(dá)β細(xì)胞系特征性標(biāo)記物的細(xì)胞為β細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)(但不限于)以下實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明。SM實(shí)例1細(xì)胞群形式的人胚胎干細(xì)胞的傳代和維持人ES細(xì)胞系Hl和Η9最初維持在經(jīng)絲裂霉素C滅活的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF)上。人ES細(xì)胞在重復(fù)傳代過(guò)程中從MEF飼養(yǎng)層轉(zhuǎn)移到Matrigel (Becton-Dickins on (Bedford, MA))上。用Matrigel 處理表面低生長(zhǎng)因子Matrigel 在4°C解凍后以1 30的比例稀 釋于冷的DMEM/F12anvitrogen(Carlsl3ad，CA))。將足以覆蓋表面的體積加入每個(gè)6cm培 養(yǎng)皿Qml)或6孔板的每個(gè)孔(Iml)中，并在室溫下孵育1小時(shí)。處理過(guò)的表面在數(shù)小時(shí) 之內(nèi)使用或在4°C下最多保存兩周。人ES 細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)在含有 lmg/ml 的膠原酶 IV (Sigma-Aldrich ( . Louis,MO)) 的DMEM/F12中孵育10分鐘，然后用移液管刮取，從而從飼養(yǎng)層獲得未分化的人ES細(xì)胞集 落(來(lái)自H9或Hl細(xì)胞系)。細(xì)胞團(tuán)通過(guò)600 X g離心四分鐘進(jìn)行沉淀，用2ml移液管輕輕地 分散該沉淀，以將集落破碎成小細(xì)胞群。將這些細(xì)胞群接種到Matrigel 處理的培養(yǎng)皿上 的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基經(jīng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-CM)調(diào)整，還添加了 bFGF(8ng/ml ；R&D Systems (Minneapolis,MN))，接種密度為每6cm培養(yǎng)皿5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種50-150個(gè)集 落。每天更換培養(yǎng)基。MEF-CM中位于Matrigel 上的集落變大，并在其覆蓋70-80%的表 面積時(shí)(大約每3-4天)進(jìn)行傳代。與飼養(yǎng)層上維持的人ES細(xì)胞(圖1)類(lèi)似，集落中的 人ES細(xì)胞具有較高的細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)的比率并且具有明顯的核仁。分化細(xì)胞所占比例小 于培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的5%。就Matrigel 上的MEF-CM中的細(xì)胞的常規(guī)傳代而言，將細(xì)胞在含有l(wèi)mg/ml膠原 酶IV的DMEM/F12中孵育最多60分鐘，并通過(guò)有力的DMEM/F12流沖洗伴以刮取將細(xì)胞從 培養(yǎng)皿中移除。將細(xì)胞沉淀、分散并以1 3或1 4的比率接種。實(shí)例2單細(xì)胞形式的人胚胎干細(xì)胞的傳代根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can Inc的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)LFS5163USPSP中公開(kāi)的方法，以單細(xì)胞形式培養(yǎng)細(xì)胞系H9的人ES細(xì)胞。用TrypLE Express在37°C下處理五分鐘的方法進(jìn) 行細(xì)胞傳代，并以10，000細(xì)胞/cm2基底表面的密度進(jìn)行接種。實(shí)例3使用無(wú)胞外基質(zhì)蛋白/組分和飼養(yǎng)細(xì)胞的表面改件培養(yǎng)板來(lái)講行的人胚胎干細(xì) 朐的粘附、培養(yǎng)和多能件保持細(xì)胞系Hl的人ES細(xì)胞，至第49代時(shí)維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條 件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經(jīng)低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過(guò) lmg/ml膠原酶分離或人工刮取，將細(xì)胞從表面分離以進(jìn)行傳代。然后將這些細(xì)胞接種于表面改性培養(yǎng)板(6孔格式)的兩個(gè)未處理孔上。另外，每 個(gè)培養(yǎng)板的一個(gè)孔用0. 無(wú)異源人明膠處理作為對(duì)照。還將細(xì)胞直接接種于costar (目 錄號(hào) 3516 ； Corning (Corning, NY)) >Falcon (目錄號(hào) 351146 ；Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ))以及Nunclon Delta (目錄號(hào) 140675 ;Thermo Fisher Scientific (Roskilde， Denmark))6孔板的未處理和明膠處理孔上，以用作陰性對(duì)照，并且還接種于用低生長(zhǎng)因子 Matrigel 的1 30稀釋液處理的孔上，以用作陽(yáng)性對(duì)照。在所有處理中，細(xì)胞均維持于 MEF條件培養(yǎng)基中。我們觀察到兩代之后，表面改性培養(yǎng)板2、3和4具有粘附的ES細(xì)胞集落，這些集 落在酶分離后重新粘附于培養(yǎng)板并生長(zhǎng)。表面改性培養(yǎng)板2、3或4上的明膠或未處理孔中， 粘附率或生長(zhǎng)率沒(méi)有明顯差異。從用低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的培養(yǎng)板上機(jī)械分離的細(xì)胞較 弱粘附于表面改性培養(yǎng)板2、3和4，而用lmg/ml膠原酶進(jìn)行酶分離的細(xì)胞能較好粘附于表 面改性培養(yǎng)板2、3或4的明膠或未處理孔中。加入表面改性培養(yǎng)板1和5-12以及未處理或明膠處理的NunclonDelta 培養(yǎng)板、 hlcon 培養(yǎng)板以及Costar 培養(yǎng)板的Hlp49ES細(xì)胞不粘附。相同的細(xì)胞粘附于用低生長(zhǎng) 因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的培養(yǎng)板上，這表明該細(xì)胞能夠粘附于基底表面。對(duì)接種于低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液上的Hl細(xì)胞系ES細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其 正常傳代時(shí)間為3-4天，然而接種于表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細(xì)胞在準(zhǔn)備傳代之前需 要培養(yǎng)7天。這可能是由于處理表面上的粘附率的下降，因?yàn)榕c表面2、3和4相比，在接種 后更多初始集落立即明顯存在于Matrigel 處理表面上。將第50代(p50)細(xì)胞按1 2的比率分離，并收集半數(shù)該樣品，以用于RNA純化 和多能性標(biāo)記物表達(dá)水平檢測(cè)(表1)。每個(gè)樣品的另一半重新接種于表面改性培養(yǎng)板。這 一代(P51)形成的集落在其準(zhǔn)備傳代前仍需要培養(yǎng)7天，僅培養(yǎng)4天后長(zhǎng)成的小集落示于 圖1中。這些集落維持典型ES細(xì)胞集落形態(tài)。表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細(xì)胞在傳代4次時(shí)停止培養(yǎng)，通過(guò)qRT_PCR分析樣 品的多能性標(biāo)記物(表幻并且使樣品分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞(DE)的命運(yùn)。傳代4次的細(xì) 胞保持以下典型多能性標(biāo)記物的表達(dá)0ct4、Nanog, Sox2和TERT。此外，該細(xì)胞具有能夠 在含有 DMEM/F12、100ng/ml 激活素 A、20ng/ml Wnt3a 和 0. 5-2. 0% FBS (表 3)的培養(yǎng)基中 分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞的命運(yùn)，這表明到第4代細(xì)胞仍保持多能性。實(shí)例4^gJirsa / m^mmmmm^mmm.mmamfmKm.m^mmmm.mmu^mim :Rh0 抑制和 Rh0 mmmmm^m細(xì)胞系Hl的人ES細(xì)胞，在第49代時(shí)維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條 件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經(jīng)低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過(guò) lmg/ml膠原酶分離，將細(xì)胞從表面分離以進(jìn)行傳代。然后將這些細(xì)胞接種于表面改性培養(yǎng)板(6孔格式)的未處理孔上。還將細(xì)胞直 接接種于Costar 、i^ilcon 和Nunclon Delta 6孔板的未處理和明膠處理孔上以用作陰 性對(duì)照，并接種于低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的孔上以用作陽(yáng)性對(duì)照。在 所有處理中，細(xì)胞均維持于MEF條件培養(yǎng)基中。在第49代時(shí)加入表面改性培養(yǎng)板1和5-12以及加入未處理或明膠處理的 Nunclon Delta 培養(yǎng)板和Costar 培養(yǎng)板的Hl細(xì)胞系的人ES細(xì)胞不粘附，然而，其卻粘 附于表面改性培養(yǎng)板2、3和4。相同的細(xì)胞粘附于低生長(zhǎng)因子Matrigermi 30稀釋 液處理的培養(yǎng)板，這表明該細(xì)胞能夠粘附于基底表面。對(duì)接種于低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液上的Hl ES細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其正常傳 代時(shí)間為3-4天，然而接種于表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細(xì)胞在準(zhǔn)備傳代之前需要培養(yǎng)7 天。這可能是由于表面改性培養(yǎng)板上的粘附率的下降，因?yàn)榕c表面改性培養(yǎng)板2、3和4相 比，在接種后更多初始集落立即明顯存在于Matrigel 處理表面。將第50代(p50)細(xì)胞按1 2的比率分離，并收集半數(shù)該樣品，以用于RNA純化 和多能性標(biāo)記物表達(dá)水平檢測(cè)(表1)。每個(gè)樣品的另一半重新接種于表面改性培養(yǎng)板。這 一代(P51)形成的集落在其準(zhǔn)備傳代前仍需要培養(yǎng)7天，僅培養(yǎng)4天后長(zhǎng)成的小集落示于 圖1中。這些集落維持典型ES細(xì)胞集落形態(tài)。由于傳代的推遲，將該細(xì)胞以1 2的比率分離，并將傳代4次的半數(shù)樣品接種于 MEF條件培養(yǎng)基或添加有10 μ M濃度的Iih0激酶(ROCK)抑制劑Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基 中，以用于改善細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。傳代后將細(xì)胞保存于接種培養(yǎng)基中48小時(shí)，此時(shí)該培養(yǎng) 基被更換成新鮮的不添加MEF的條件培養(yǎng)基。添加1(^11濃度的￥_27632可顯著提高該細(xì)胞(ρ52)的接種效率并且在接種4天 后集落生長(zhǎng)明顯改善(圖2)。此外，在膠原酶分離之前，Hl細(xì)胞系人ES細(xì)胞還經(jīng)過(guò)0. 5ng/ ml細(xì)胞滲透形式的Mio抑制劑C3外轉(zhuǎn)移酶處理，這也可提高細(xì)胞接種效率。雖然接種于10 μ M Υ-27632中的細(xì)胞可在接種后4天傳代，但無(wú)ROCK抑制劑情況 下接種的細(xì)胞在接種后4天仍不能分離。用Mio抑制劑C 3外轉(zhuǎn)移酶處理的細(xì)胞在接種后 4天仍不能傳代，并且細(xì)胞表現(xiàn)出更趨向于分化為類(lèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)。因此，在第4代時(shí)經(jīng) Rho抑制劑處理的細(xì)胞的所有后代均用Υ-27632進(jìn)行處理(圖3)。細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板3和4上進(jìn)一步傳代至至少10代并檢測(cè)多能性相關(guān)標(biāo)記 物的存在qRT_PCR檢測(cè)基因；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)；以及免疫熒光法檢 測(cè)細(xì)胞表面和核蛋白(圖4-6)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞分化為定形內(nèi)胚層、胰內(nèi)胚層以及形成由三 胚層構(gòu)成的胚狀體的能力來(lái)確定細(xì)胞的多能性(圖7-9)。還檢測(cè)了細(xì)胞的核型穩(wěn)定性，我 們觀察到細(xì)胞可保持正常核型(圖10)。實(shí)例5I^h0激酶抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞粘附和分離的影響細(xì)胞系H9的人ES細(xì)胞，至第40代時(shí)維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經(jīng)低生長(zhǎng)因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過(guò) lmg/ml膠原酶分離或人工刮取，將細(xì)胞從表面分離以進(jìn)行傳代。然后將這些細(xì)胞接種于含有增加量的以下Iih0激酶抑制劑之一的表面改性培養(yǎng) 板 2、3、4 和 13(12 孔格式)上Y-27632(得自 Sigma(St. Louis，M0)或 EMD(San Diego, CA))、法舒地爾(Sigma)或羥基法舒地爾(Sigma)，并維持3天，每天更換培養(yǎng)基和化合物。 在第三天結(jié)束時(shí)，去除培養(yǎng)基并用結(jié)晶紫(0.5%的水溶液)染色培養(yǎng)板以觀察集落。我們觀察到第三天，在含有增加量的Iih0激酶抑制劑的表面改性培養(yǎng)板2、3、4和 13上有粘附的ES細(xì)胞集落。通過(guò)使用Υ-27632(10μΜ)能獲得最佳結(jié)果，盡管某些集落在 存在Mio激酶抑制劑、法舒地爾以及羥基法舒地爾情況下可觀察到粘附和生長(zhǎng)(圖11)。通過(guò)在培養(yǎng)第一天用一系列接種濃度的Υ-27632處理細(xì)胞，我們?cè)噲D檢測(cè) Υ-27632的最佳劑量以促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合。培養(yǎng)第一天后，在隨后的時(shí)間里用ΙΟμΜ濃度的 Υ-27632處理細(xì)胞。我們觀察到促進(jìn)ES細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的最大濃度為10 μ M(圖12)，并且 這種情況出現(xiàn)在表面改性培養(yǎng)板2、3、4、13和Cel 1BIND (Corning(Corning，NY))上。還檢測(cè)了使用單一劑量Υ-27632連續(xù)處理細(xì)胞對(duì)粘附和生長(zhǎng)的影響。該細(xì)胞分 別用0、1、4或10 μ M的Υ-27632處理4天。在未處理(0 μ Μ)的表面改性培養(yǎng)板上觀察到 一些結(jié)合，而在表面改性培養(yǎng)板2、3、4、13上，促進(jìn)ES細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的最佳濃度為10 μ M Y-27632 (表 4)。因?yàn)橄鄬?duì)于未處理的細(xì)胞(圖1 來(lái)說(shuō)，添加ROCK抑制劑在表面改性培養(yǎng)板2、 3和4上顯著增強(qiáng)接種和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，我們希望能確定這是由于恰當(dāng)?shù)募?xì)胞粘附的保持還 是由于提高的細(xì)胞增殖而引起的。我們觀察到Mio激酶抑制并不提高細(xì)胞增殖，因?yàn)橛?Y-27632處理的細(xì)胞同未處理細(xì)胞的生長(zhǎng)密度相似(圖14)。相反，Y-27632處理能保持細(xì) 胞粘附于表面并允許其以正常增殖動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)(圖15)。從ES細(xì)胞接種的含有Mio激酶抑 制劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中去除Mio激酶抑制劑，可導(dǎo)致細(xì)胞從表面分離。通過(guò)在懸浮液中培養(yǎng) ES細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)分化為3胚細(xì)胞系的胚狀體形成。因此，雖然如預(yù)期一樣隨后重新使用Mio 激酶抑制劑能恢復(fù)細(xì)胞的粘附(圖15)，但在樣品中觀察到ES細(xì)胞培養(yǎng)物的大量分化，其 中樣品經(jīng)過(guò)如下處理將Mio激酶抑制劑去除后培養(yǎng)M小時(shí)，使細(xì)胞分離、生長(zhǎng)于懸浮液中 24小時(shí)，再重新使用Iih0激酶抑制劑。實(shí)例6使用I~rypLEa Express傳代的H9人ES細(xì)胞在Y-27632處理時(shí)在表面改性培養(yǎng)板 上旱現(xiàn)改善的粘附件H9人ES細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的初始傳代。使用10 μ M Y-27632連續(xù)處理可 促進(jìn)粘附。四種表面改性培養(yǎng)板2、3、4和13是如此的。Η9細(xì)胞接種于表面3上M小時(shí) 后的圖像示于圖16中。實(shí)例7使用TirpLEia Express傳代的H9人胚胎干細(xì)胞單細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上保持 多能件人ES細(xì)胞是多能性的并能夠分化為所有細(xì)胞系。細(xì)胞的多能狀態(tài)必須由其上生 長(zhǎng)細(xì)胞的表面來(lái)保持。為了檢測(cè)表面改性培養(yǎng)板是否能保持人ES細(xì)胞多能性，用膠原酶將 人ES細(xì)胞傳代38次以及用TrypLE Express傳代38次，然后在表面改性培養(yǎng)板3 (表面3)、表面改性培養(yǎng)板4(表面4)或以1 30稀釋的Matrigel 上傳代5次。將10 μ M的 Υ-27632加入指示樣品的培養(yǎng)基。使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估多能性標(biāo)記物Tra-l-60、Tra-l-81、 SSEA-3和SSEA-4的表達(dá)。結(jié)果示于圖17中。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比示于y軸。生長(zhǎng)于表面改 性培養(yǎng)板3和4上的人ES細(xì)胞單細(xì)胞可保持其多能性。實(shí)例8Rho激酶抑制可促講來(lái)自人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞的粘附和牛長(zhǎng)，這㈣細(xì)胞從 Matrigel"中轉(zhuǎn)移到表面牛培養(yǎng)板卜.時(shí)以單細(xì)胞,形式牛長(zhǎng)研究了 Y-27632在人ES細(xì)胞粘附和細(xì)胞生長(zhǎng)方面的作用與表面改性培養(yǎng)板的相 關(guān)性。用膠原酶將H9人ES細(xì)胞傳代38次，并用TirpLETMEXpresS傳代50次，然后接種于 表面改性培養(yǎng)板3或4上(初始細(xì)胞)。作為另外一種選擇，用膠原酶將H9人ES細(xì)胞傳代 38次，并用TripleExpress傳代38次，然后在表面改性培養(yǎng)板3 (表面3，適應(yīng)細(xì)胞)，或表 面改性培養(yǎng)板4 (表面4，適應(yīng)細(xì)胞)上傳代9次。細(xì)胞以IOVcm2的密度，在含或不含10 μ M Y-27632的條件下接種于MEF條件培養(yǎng)基中并生長(zhǎng)兩天。結(jié)果示于圖18中。Y-27632促進(jìn) 了初始細(xì)胞對(duì)表面改性培養(yǎng)板3和4的粘附。Y-27632不促進(jìn)適應(yīng)細(xì)胞對(duì)表面改性培養(yǎng)板 3和4的粘附。表面改性培養(yǎng)板3促進(jìn)了初始細(xì)胞的粘附和/或生長(zhǎng)。表面改性培養(yǎng)板4 促進(jìn)了適應(yīng)的人ES細(xì)胞的粘附和/或生長(zhǎng)。這些細(xì)胞經(jīng)過(guò)總共4天的跟蹤觀察(圖19和 20)。在用ΙΟμΜ的Y-27632于表面改性培養(yǎng)板3上培養(yǎng)時(shí)，初始單細(xì)胞呈現(xiàn)增加的生長(zhǎng) 率，顯示出微弱優(yōu)勢(shì)(圖19)。適應(yīng)的單細(xì)胞呈現(xiàn)增加的生長(zhǎng)率，不需ΙΟμΜ的Υ-27632(圖 20)。實(shí)例9表面改性培養(yǎng)板可用于篩選化合物96孔構(gòu)型和分子生物篩選協(xié)會(huì)(SBQ標(biāo)準(zhǔn)形式的表面改性培養(yǎng)板可用于在存在 10 μ M Y-27632的情況下培養(yǎng)單人胚胎干細(xì)胞。接種在96孔板的微孔中的H9單細(xì)胞的圖 像如圖21中所示。這允許直接在96孔板中進(jìn)行化合物的篩選而不會(huì)妨礙細(xì)胞或吸附層， 例如分別為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或Matrigel 。實(shí)例10培養(yǎng)于表面改件培養(yǎng)板上的單胚胎干細(xì)胞能夠分化成定形內(nèi)胚層—個(gè)目標(biāo)是將人胚胎干細(xì)胞分化成不同的細(xì)胞系。為了確定表面改性培養(yǎng)板能否 支持分化，將人胚胎干細(xì)胞用膠原酶?jìng)鞔?8次以及用TrypLETMEXpresS傳代38次，接下來(lái) 在表面改性培養(yǎng)板3 (表面幻或表面改性培養(yǎng)板4 (表面4)上傳代9次。作為陽(yáng)性對(duì)照， 讓人胚胎干細(xì)胞在MatrigelTMl 30稀釋液中生長(zhǎng)。在指明的細(xì)胞樣品的擴(kuò)增過(guò)程中向培 養(yǎng)基中添加ΙΟμΜ Y-27632。細(xì)胞擴(kuò)增后，評(píng)估培養(yǎng)的細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層的能力。簡(jiǎn)而言 之，將70%匯合度的培養(yǎng)物用含有l(wèi)OOng/ml激活素A、10ng/ml Wnt 3a以及0. 5% FBS的 DMEM-F12培養(yǎng)基處理兩天。處理后用含有100ng/ml激活素A以及2% FBS的DMEM/F12處 理3天。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)由CXCR4蛋白的表達(dá)水平鑒定分化成定形內(nèi)胚層的細(xì)胞(圖22)。 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比在y軸上表示。以單細(xì)胞培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞在存在或不存在Y-27632 的情況下可在表面改性培養(yǎng)板3和4上分化成定形內(nèi)胚層。實(shí)例11在表面改件培養(yǎng)板上培養(yǎng)的單胚胎干細(xì)胞能夠分化成胰腺內(nèi)胚層
在完成定形內(nèi)胚層方案之后，將細(xì)胞在含有FGF-7(50ng/ml ；R&DSystems)、音猬 因子抑制劑、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 μ M ；Sigma-Aldrich)以及2% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中孵 育3天。這時(shí)候，擴(kuò)增過(guò)程中未用Y-27632處理的細(xì)胞與表面改性培養(yǎng)板3和4分離。將在 擴(kuò)增過(guò)程中用Y-27632處理過(guò)的細(xì)胞在含有FGF-7 (50ng/ml)、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 μ Μ)、視黃 酸(lyM;Sigma-Aldrich)以及 1 % B27 (Invitrogen)的 DMEM-F12 中再孵育四天(后方前 腸期，PF)。這段時(shí)間后，將細(xì)胞在含有 Exendin 4 (50ng/ml ；Sigma-AIdrich)、DAPT (1 μ M ； Calbiochem)以及1 % Β27的DMEM-F12中再孵育四天。分化持續(xù)至胰腺內(nèi)胚層期(EN)。這 需要使用含 50ng/ml HGF、IGF(R&D Systems)以及 Exendin 4(50ng/ml)和 1%B27 的 CMRL 培養(yǎng)基(Invitrogen)處理三天。在PF和EN期從表面改性培養(yǎng)板3和4的一個(gè)孔中采集 RNA樣本。然后，在此步驟，將這些樣本通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析胰腺標(biāo)記物Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、 Pax4、NeuroD, HNF3b、Ptfla、胰島素以及AFP。在這段時(shí)期重復(fù)評(píng)估相同的胰腺內(nèi)胚層標(biāo) 記物。將從相同細(xì)胞系未處理的人胚胎干細(xì)胞獲得的RNA樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，與處理 過(guò)的樣本作為平行對(duì)照。將處理過(guò)的樣本歸一化到設(shè)為1倍變化的未處理對(duì)照樣本。監(jiān)測(cè) Pdxl和胰島素表達(dá)并在表面改性培養(yǎng)板之間進(jìn)行比較。從表面改性培養(yǎng)板3和4上處理的細(xì)胞中觀察到了胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記物的誘導(dǎo)，然 而在表面改性培養(yǎng)板3上處理的細(xì)胞表達(dá)量更高(圖23)。在擴(kuò)增期間在存在Y-27632的 情況下兩種表面改性培養(yǎng)板均能支持單人胚胎干細(xì)胞向后方前腸和胰腺內(nèi)胚層分化，而在 擴(kuò)增時(shí)間未用Y-27632處理的單細(xì)胞在后前腸分化前分離。實(shí)例12Hl和H9人胚胎干細(xì)胞,粘附到表面牛培養(yǎng)板卜.并誦過(guò)用Y-27632處理細(xì)朐而 曾 強(qiáng)粘附將之前接種到用1 30 Matrigel 處理過(guò)的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的第49代H9人胚胎干細(xì)胞用LIBERASE處理，并接種到表面改 性培養(yǎng)板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中，不進(jìn)行其他處理或添加更高濃度的 Y-27632。我們觀察到，在將H9人胚胎干細(xì)胞接種到表面改性培養(yǎng)板后M小時(shí)和48小時(shí)， 在表面 2-4 和 13、CellBIND 以及 Primaria (目錄號(hào) 353846，BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes, NJ)上通過(guò)結(jié)晶紫染色可觀察到小型集落(圖M_26)。此外，通過(guò)添加Y-27632改 善了 H9人胚胎干細(xì)胞集落的粘附，這一影響具有劑量反應(yīng)關(guān)系(圖25)。相對(duì)于未處理的 人胚胎干細(xì)胞，在人胚胎干細(xì)胞粘附方面，低濃度的Y-27632 (1至2微摩爾)顯示出極微的 改善(圖25)，而較高濃度的Y-27632 (4至20微摩爾)促進(jìn)了人胚胎干細(xì)胞與表面改性培 養(yǎng)板的粘附(通過(guò)結(jié)晶紫染色測(cè)量)(圖25和26)。除了通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Y-27632對(duì)人胚胎干細(xì)胞粘附進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)外，我 們還觀察到在存在Y-27632的情況下人胚胎干細(xì)胞對(duì)各種表面改性塑料制品具有不同的 粘附率。例如，即使在存在持續(xù)的Y-27632處理的情況下，細(xì)胞也較少粘附到CellBIND 培 養(yǎng)板上并隨著時(shí)間的推移極可能與CellBIND 培養(yǎng)板分離，而在用他0激酶抑制劑Y-27632 處理時(shí)，細(xì)胞更多地粘附到表面改性培養(yǎng)板3、4、13或I^imaria 上且不大可能與之分離 (圖 25 禾口 26)。實(shí)例13在存在Y-27632的情況下來(lái)自人胚胎干細(xì)胞系Hl和H9的細(xì)胞以不同的比率在表
將之前接種到用1 30MatrigelTM處理過(guò)的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Hl和H9人胚胎干細(xì)胞用LIBERASE處理，并接種到表面改性 培養(yǎng)板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中，不進(jìn)行其他處理或添加20微摩爾的 Y-27632。在將H9人胚胎干細(xì)胞接種到表面改性培養(yǎng)板14和15后48小時(shí)，在添加了 20 微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中觀察到了小型集落(粘附和集落形成在各實(shí)驗(yàn)之間不同)(圖 27)。Hl人胚胎干細(xì)胞還在表面14和15上添加了 20微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中粘附并形 成集落，并且這比對(duì)H9人胚胎干細(xì)胞觀察到的結(jié)合更普遍。這些數(shù)據(jù)表明人胚胎干細(xì)胞在 固體基底表面上的粘附和集落形成存在細(xì)胞系間變化性。實(shí)例14人胚胎干細(xì)胞粘附到使用限定培養(yǎng)基的表面改件培養(yǎng)板上將第49代H9人胚胎干細(xì)胞在限定培養(yǎng)基mTeSR 中于Matrigel 處理過(guò)的塑料 器皿上傳代2次。然后將細(xì)胞用LIBERASE處理并接種到表面改性培養(yǎng)板Nunc4上mTeSR 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種在含有或不含20微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中。在接種細(xì)胞之前還 將微孔用各種蛋白處理30分鐘(無(wú)處理、0. 明膠、2% BSA、.3%ig/ml大鼠I型膠原、 1 lOOOMatrigel 或1 5000MatrigelTM)，以測(cè)定這些蛋白是否可以促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞 在含有或不含Y-27632的限定培養(yǎng)基中的粘附(圖觀)。我們觀察到，在不存在Y-27632的 情況下，接種到表面改性培養(yǎng)板的限定培養(yǎng)基中的人胚胎干細(xì)胞即使在存在細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白(如I型膠原或1 lOOOMatrigel )的情況下仍不粘附。然而，向限定培養(yǎng)基mTeSR 中加入20微摩爾Y-27632時(shí)，人胚胎干細(xì)胞粘附到表面Nimc4上。此外，這種粘附在未處理 的孔中以及用0. 明膠、2% BSA和0. 34mg/ml大鼠I型膠原處理過(guò)的孔中是相當(dāng)?shù)?。?含有低濃度Matrigel (1 1000和1 5000稀釋比)的微孔中，人胚胎干細(xì)胞的粘附小 幅增加，然而這些濃度的Matrigel 均不足以在不含Y-27632的情況下促進(jìn)細(xì)胞粘附。這 些結(jié)果表明在存在ROCK抑制劑Y-27632的情況下，人胚胎干細(xì)胞可在表面改性培養(yǎng)板上的 限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且大約1 1000或1 5000的低濃度Matrigel 即可改善這種粘 附。實(shí)例15培養(yǎng)瓶形式的表面改性培養(yǎng)板可促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞的粘附以及向定形內(nèi)胚層和 胰腺內(nèi)胚層的分化將之前接種到用1 30 Matrigel 處理過(guò)的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Hl和H9人胚胎干細(xì)胞用LIBERASE處理，并按1 2或1 3 的接種密度接種到具有改性表面的各種尺寸的培養(yǎng)瓶T25、T75、T150和T175上。將細(xì)胞 接種到添加了 8ng/mlbFGF和20微摩爾Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中。然后讓人胚胎干細(xì) 胞集落生長(zhǎng)，每日更換添加了 8ng/ml bFGF和20微摩爾Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基，直到 平板達(dá)到大約50%的匯合度。這時(shí)將培養(yǎng)基換成含有2% BSAU00ng/ml激活素A、20ng/ ml Wnt3a以及20微摩爾Y-27632的DMEM/F12培養(yǎng)基，將細(xì)胞在這種培養(yǎng)基中保持2天并 每日更換培養(yǎng)基。在第3天和第4天，將培養(yǎng)基換成含有2% BSAU00ng/ml激活素A以及 20微摩爾Y-27632的DMEM/F12培養(yǎng)基。然后用TrypLE讓細(xì)胞與表面分離，并通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)分析定形內(nèi)胚層(DE)表面標(biāo)記物CXCR4的表達(dá)。我們觀察到，在這些條件下，人胚胎干細(xì)胞分化成高CXCR4陽(yáng)性群體，CXCR4+高達(dá)幾乎90%，表明細(xì)胞大部分都分化成了定形 內(nèi)胚層(表5)。此外，由于從培養(yǎng)基中除去Y-27632導(dǎo)致了細(xì)胞與塑料表面分離，因此在細(xì) 胞生長(zhǎng)或分化期間細(xì)胞與培養(yǎng)表面的粘附依賴(lài)于ROCK抑制的維持。我們希望確定由從培養(yǎng)瓶形式的表面改性培養(yǎng)板上獲得的定形內(nèi)胚層能否形成 胰腺內(nèi)胚層。為此，我們用含有Y-27632 (20微摩爾)、FGF-7 (50ng/ml)、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 微摩爾)以及B27 (Invitrogen)的DMEM-F12培養(yǎng)基將細(xì)胞再孵育四天，然后在該培養(yǎng) 基中添加視黃酸(1微摩爾，Sigma-Aldrich)繼續(xù)孵育四天，將細(xì)胞分化到胰腺內(nèi)胚層期。 采集RNA樣本并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析胰腺標(biāo)記物Pdxl。將處理過(guò)的樣本歸一化到設(shè)為1倍變 化的未處理的對(duì)照樣本。我們觀察到相對(duì)于未分化的人胚胎干細(xì)胞，樣本中PDXl的水平升 高，分化細(xì)胞中的mRNA水平至少比未分化的人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞中觀察到的相應(yīng)水平高256 倍。實(shí)例16表面處理以及表面改件培養(yǎng)板通過(guò)用電暈等離子體或微波等離子體處理注射成型件來(lái)制備表面改性培養(yǎng)板 (表6)。用于注射成型的聚合材料為聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碳酸酯與聚苯乙烯的共混物、 以及環(huán)狀烯烴共聚物。將表面改性培養(yǎng)板單個(gè)包裝在塑料袋中，然后通過(guò)Y照射(25kGy) 滅菌，最后保存在室溫下直到用于細(xì)胞培養(yǎng)或表面表征實(shí)驗(yàn)。分別使用與表面改性培養(yǎng)板 19、33和34相同的聚合材料模制表面改性培養(yǎng)板18、30和31-32，但不進(jìn)行等離子體處理。 表面14和31不進(jìn)行γ照射處理。電暈等離子體處理在僅有一個(gè)電極的金屬真空室內(nèi)進(jìn)行，電極處于室內(nèi)并與室內(nèi) 電絕緣(C-Lab Plasma ；Vetaphone A/S，Denmark)。金屬壁作為反電極(接地)。自調(diào)電暈 發(fā)生器產(chǎn)生電場(chǎng)，提供充足的能量以在整個(gè)真空室內(nèi)產(chǎn)生等離子體。將待處理的工件放置 在真空室的底部。關(guān)閉真空室并排空至10_2毫巴的壓力。在此壓力下，將通向真空泵的閥 關(guān)閉，啟用電暈發(fā)生器。設(shè)定發(fā)生器以產(chǎn)生2000W的輸出功率。激勵(lì)等離子體5至60秒。 然后打開(kāi)進(jìn)氣閥(空氣)，將室內(nèi)壓力恢復(fù)至大氣壓。微波等離子體處理在石英真空室(300-E型，用于表面改性培養(yǎng)板5-12 ；440型，用 于表面改性培養(yǎng)板14和15 ；二者均得自^Technics PlasmaGmbH,Germany)中進(jìn)行。生成等 離子體的能量由室外的2. 43GHz微波發(fā)生器提供。將待處理的工件放在室內(nèi)的玻璃板上。 關(guān)閉真空室并排空至0. 3到0. 5毫巴之間的壓力。讓通向真空泵的閥門(mén)保持打開(kāi)，通過(guò)用 進(jìn)氣閥調(diào)節(jié)氣流(空氣或氧氣)使壓力維持在所需值。然后啟用微波發(fā)生器。設(shè)定發(fā)生器 以產(chǎn)生500或600W的輸出功率。然后關(guān)閉泵閥，打開(kāi)進(jìn)氣閥，使室內(nèi)壓力升至大氣壓。表6示出了通過(guò)電暈等離子體或微波等離子體制備表面改性培養(yǎng)板時(shí)使用的功 率、時(shí)間、壓力和氣體。實(shí)例17^mm^mm.mmm^^水接觸角將表面改性培養(yǎng)板1-4和13單個(gè)包裝在塑料袋中、滅菌并在整個(gè)測(cè)試周期內(nèi)保存 在室溫下。在表面處理和滅菌后一周進(jìn)行第一次接觸角測(cè)量，然后在如圖四中給出的時(shí)間 點(diǎn)再次進(jìn)行測(cè)量。所有接觸角測(cè)量均使用靜止液滴法以及得自FIBRO Systems AB(Sweden)的PG-X測(cè)量頭(由攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)軟件(v. 3. 1)組成的測(cè)角計(jì))進(jìn)行。使用正切傾斜 (tangent leaning)法計(jì)算接觸角。根據(jù)制造商說(shuō)明，在靜態(tài)模式下使用自動(dòng)滴加程序滴加 4. 0 μ L MilliQ水滴。每滴的接觸角測(cè)量一次(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)向每個(gè)樣本滴7滴)。對(duì)于每個(gè) 時(shí)間點(diǎn)，使用新樣本以避免前面的測(cè)量帶來(lái)的任何影響。Nimclon Delta 和CellBIND 表 面上的測(cè)量在與表面1-4和13上的測(cè)量相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，但表面處理和滅菌的完成 時(shí)間在第一次測(cè)量前不止12周(Nunclon Delta *在第一次測(cè)量前一周滅菌)。圖四示出 了表面改性培養(yǎng)板1-4和13具有相似的親水性，且親水性高于(較低的水接觸角)Nunclon Delta 和CellBIND 表面。表面改性培養(yǎng)板1_4和13的親水性在表面處理和滅菌后可穩(wěn) 定至少12周。以前有文獻(xiàn)提到CellBIND 具有13. 4度的接觸角G度的標(biāo)準(zhǔn)偏差)(Corning Technical Report (2005), Corning CellBIND Surface :AnImproved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) (Corning 技術(shù)報(bào)告(2005)，Corning CellBIND 表面一種用于增強(qiáng)細(xì)胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REV1))，見(jiàn)于http:// catalog2. corning. com/Lifesciences/media/pdf/t_CelIBIND_Improved_Surface_CLS_ AN_057. pdf)。負(fù)電荷密度測(cè)定了表面改性培養(yǎng)板1-4和13、Nunclon Delta 表面、CellBIND 表面、 Primaria 表面、Falcon 表面以及未經(jīng)處理(但經(jīng)過(guò)滅菌)的聚苯乙烯表面(全部為3cm 培養(yǎng)皿的形式)上的負(fù)電荷密度。將3ml結(jié)晶紫水溶液(0.015%W/v)分配到每個(gè)培養(yǎng)皿 中，然后將培養(yǎng)皿在室溫和輕搖(50rpm)下孵育60分鐘。為了去除未結(jié)合到表面上的結(jié)晶 紫，將培養(yǎng)皿用:3ml MilliQ水洗滌三次，然后在60°C下過(guò)夜干燥。通過(guò)加入1.5ml 0. IM的 溶于乙醇溶液(99% )的HC1，并在室溫和輕搖(50rpm)下將培養(yǎng)皿孵育2分鐘，以解吸結(jié) 合到表面上的結(jié)晶紫。使用EnVision 2100微板讀數(shù)器(Perkin Elmer ；ffaltham,MA,USA) 在590nm處測(cè)定含有解吸結(jié)晶紫的HCl JtOH溶液的吸光度。校正吸光度值，去除HCl JtOH 溶液的背景吸光度。每種表面測(cè)量三個(gè)培養(yǎng)皿的負(fù)電荷密度，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿重復(fù)測(cè)量三次 吸光度。表面改性培養(yǎng)板的負(fù)電荷密度如圖30所示。表面1-4和13的負(fù)電荷密度相似，但 較長(zhǎng)的表面處理時(shí)間(以5-60秒的間隔)往往導(dǎo)致較低的表面負(fù)電荷密度。表面1-4和 13相對(duì)于CellBIND 表面和2007年處理的Nunclon Delta 表面具有明顯更低的負(fù)電荷密 度。表面1-4和13具有與2005年處理的Nunclon Delta 表面相同水平的負(fù)電荷密度，而 且其負(fù)電荷密度明顯高于Primaria 表面、Falcon 表面和未處理(但經(jīng)過(guò)滅菌)的聚苯 乙烯表面。2005年處理的Nunclon Delta 表面的負(fù)電荷密度低于2007年處理的Nunclon Delta 表面，表明經(jīng)表面處理的聚苯乙烯的負(fù)電荷隨時(shí)間略有減少。CellBIND 的高水平 負(fù)電荷密度不是由較高的表面粗糙度和表面積引起的(參見(jiàn)本實(shí)例中的AFM分析)。X射線(xiàn)光電子能譜(XPS)使用XPS對(duì)表面改性培養(yǎng)板1-4和13-15以及具有Nunclon Delta 、Costar 、 Falcon , CellBIND 和I^imaria 表面的培養(yǎng)板進(jìn)行分析。通過(guò)從培養(yǎng)板上切片并將其 用彈簧夾固定在不銹鋼樣本夾持器上將樣本置于X射線(xiàn)源下。使用Alk α輻射照射樣本 (1486eV)。樣本與分析儀呈45°度角進(jìn)行分析。使用由儀器供應(yīng)商Wiysical Electronics提供的軟件包對(duì)光譜進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。軟件采用市售的Matlab 例程以用于數(shù)據(jù)處理。用于 分析的儀器為Wiysical Electronics MOO型X射線(xiàn)光電子能譜儀。在每種表面的兩個(gè)培 養(yǎng)板的每一個(gè)中，對(duì)培養(yǎng)板的表面處理部分直徑約1毫米的區(qū)域中最外層的2至5納米深 度進(jìn)行分析。以原子百分比為單位的表面元素組成如表7中所示。所有表面改性培養(yǎng)板的表面 均含有碳、氧和氮(在XPS中不檢測(cè)氫)。表面1-4、表面13以及CellBIND 表面比其他分 析表面含有更多的氧。表面1-4和表面13-15比Primaria 含有更少的氮，但比Nunclon Delta , Costar ,Falcon 以及CellBIND 培養(yǎng)板的表面含有更多的氮。氧和氮含量與較 長(zhǎng)的表面處理時(shí)間正相關(guān)(表面1-4和13)，使用30或60秒電暈等離子體處理(分別為表 面3和表面4)得到了這兩種元素的最高水平。表面3和4的元素組成相似。表面2和13 的元素組成相似，并且相對(duì)于表面1的元素組成來(lái)說(shuō)其更類(lèi)似于表面3和4。為了鑒定和定量表面中碳的鍵合環(huán)境，通過(guò)使用可在文獻(xiàn)中找到的物質(zhì)的峰寬和 能級(jí)對(duì)Cls譜峰進(jìn)行曲線(xiàn)擬合(最佳卡方擬合)(表8)。濃度以原子百分?jǐn)?shù)為單位進(jìn)行記 錄，其通過(guò)原子濃度與面積百分?jǐn)?shù)相乘得到。表面2-4和13在碳鍵合環(huán)境方面相似。表 面2-4和13中C*-C-0-C-C*鍵合環(huán)境的碳比例要低于其他分析表面。表面2-4和13中 0-[C = 0]-0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。還鑒定了表面2-4和13以及表 面1、CellBIND 表面和/或Primaria 表面之間的相似性。表面1-4和13中C-O-C或 C-NH3+鍵合環(huán)境(光譜中能級(jí)相同)的碳比例要高于其他分析表面。表面2-4、表面13以 及I^rimaria 表面中C_0_C* = 0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面2_4、表面 13以及CellBIND 表面中CO3鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面1_4、表面13 以及CeLLBIND 表面中C = 0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面1_4、表面13、 CellBIND 表面以及I^imaria 表面中C_
_C鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。 能量損失峰由芳族Π —Π *躍遷產(chǎn)生，是表面芳香性的指示。Ols譜峰幾乎為高斯型，不能進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。為了鑒定和定量表面中氮的鍵合環(huán) 境，通過(guò)使用可在文獻(xiàn)中找到的物質(zhì)的峰寬和能級(jí)對(duì)Nls譜峰進(jìn)行曲線(xiàn)擬合(最佳卡方擬 合)(表9)。濃度以原子百分?jǐn)?shù)為單位進(jìn)行記錄，其通過(guò)原子濃度與面積百分?jǐn)?shù)相乘得到。 從Nunclon Delta 、CellBIND 、Costar 以及i^alcon 表面獲得的Nls信號(hào)較弱，因此不 可能對(duì)這些表面中的氮進(jìn)行鍵合環(huán)境鑒定。表面改性培養(yǎng)板1-4和13的Nls光譜難以區(qū) 別，示出了由兩個(gè)代表性Nls光譜的曲線(xiàn)擬合產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。表面1-4和13在-NH3+鍵合環(huán) 境中的氮比例要高于表面14、15和I^rimaria 表面。-NH2鍵合環(huán)境中的氮僅在表面14和 15以及Primaria 表面中檢出。-NO2鍵合環(huán)境中的氮僅在表面1_4和13中以及在表面15 的一個(gè)樣本中檢出。-NO3鍵合環(huán)境中的氮僅在表面15和I^rimaria 表面中檢出。CellBIND 之前被描述為通過(guò)ESCA分析具有70. 4 %碳、29. 0 %氧、0. 6 %氮和 <0.01%其他元素的元素組成，以及相對(duì)高濃度的C-
-C、C = 0和C00H/R基團(tuán)(Corning Technical Report (2005), Corning Cel 1BIND Surface :An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) (Corning 技術(shù)報(bào)告(2005)，Corning CellBIND 表面一種用于增強(qiáng)細(xì)胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REV1))，見(jiàn)于http:// catalog2. corning. com/Lifesciences/media/pdf/t_CelIBIND_Improved_Surface_CLS_ AN_057. pdf)。
PrimariaTM之前被描述為通過(guò)ESCA分析具有74.6%碳、14.1%氧、ll.l%氮和 0.2%其他元素的元素組成，主要具有腈(Cen)和脲[HN(C = O)NH]碳-氮鍵合環(huán)境。原子力顯微鏡(AFM)使用AFM對(duì)表面改性培養(yǎng)板1-4和13以及具有Nunclon Delta 和CellBIND 表 面的培養(yǎng)板進(jìn)行分析。使用Digital Instruments多模式原子力顯微鏡以輕敲模式對(duì)樣本 進(jìn)行分析。所用探針為T(mén)ESP7型輕敲模式探針。將樣本用雙面膠帶粘附到樣本盤(pán)上。分析 培養(yǎng)板表面處理部分的10 μ mX 10 μ m和500nmX500nm區(qū)域。以納米為單位的表面平均粗 糙度(Ra)和最大高度(Rmax)如表10中所示。像具有Nunclon Delta 和CellBIND 表面 的培養(yǎng)板一樣，表面改性培養(yǎng)板1-4和13相對(duì)光滑，并且在兩種掃描的任一種中Ra和Rmax 都不與表面處理時(shí)間相關(guān)。旨在用于細(xì)胞培養(yǎng)的未處理的聚苯乙烯和氧化聚苯乙烯表面 以及Primaria 表面的分析已由Shen和Horbett進(jìn)行過(guò)描述(J. Biomed. Mater. Res. 57 336-345,2001)所有三種表面的表面粗糙度約為4nm。實(shí)例18與人胚胎干細(xì)胞粘附和集落形成相關(guān)的表面元素組成和接觸角表面元素組成的XPS分析、表面接觸角測(cè)量以及人胚胎干細(xì)胞粘附和集落形成實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果匯總在表11中給出。在不存在能夠抑制Iiho或Iiho激酶的化合物的情況下，僅在表面改性培養(yǎng)板2-4 和13、CellBIND 培養(yǎng)板和Primaria 培養(yǎng)板上觀察到了人胚胎干細(xì)胞粘附到固體基底表 面上并在其上形成集落(每IOcm2表面至少15個(gè)集落)(細(xì)胞以細(xì)胞群懸浮液的形式存在 于表面上)。表面改性培養(yǎng)板2-4和13支持細(xì)胞粘附、集落形成和傳代。經(jīng)過(guò)大約三次傳 代后，人胚胎干細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板2-4和13上的生長(zhǎng)速率自發(fā)下降(僅在不存在Mio 抑制和Iih0激酶抑制的情況下)，然而細(xì)胞形態(tài)表明細(xì)胞尚未分化。此外，對(duì)于在表面3上 傳代4次的細(xì)胞，保持了多能標(biāo)記物的表達(dá)。CellBIND 培養(yǎng)板支持人胚胎干細(xì)胞的粘附和 集落形成，但在第一次傳代前觀察到了細(xì)胞的分化。基于對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察，Primaria 培 養(yǎng)板支持人胚胎干細(xì)胞的粘附和集落形成，無(wú)分化信號(hào)(未檢測(cè)傳代)。表面的氧(例如， 表面2與表面14對(duì)比)和氮(例如，Primaria 與Costar 對(duì)比；以及表面2和表面13與 CellBIND 對(duì)比)含量對(duì)于在不存在Mio抑制和Mio激酶抑制的情況下表面支持人胚胎干 細(xì)胞粘附和集落形成的能力均有影響。含有至少約0.9%的氮、氮和氧含量的總和為至少約 22. 3%以及水接觸角為至少約13. 9度的表面在不存在Mio抑制和Mio激酶抑制的情況下 支持人胚胎干細(xì)胞的粘附和集落形成。在存在能夠抑制Iiho或Iih0激酶的化合物的情況下，在表面改性培養(yǎng)板1-15、表面 改性培養(yǎng)板19、表面改性培養(yǎng)板33、表面改性培養(yǎng)板34、CellBIND 和I^imaria 上觀察到 了人胚胎干細(xì)胞粘附到固體基底表面上并在其上形成集落(每IOcm2表面至少15個(gè)集落) (細(xì)胞以細(xì)胞群懸浮液的形式存在于表面上)。我們注意到，在促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞粘附和 集落形成方面，表面2-4和13以及Primaria 要優(yōu)于表面1、19、33和34以及CellBIND ， 后者又優(yōu)于表面5-12、14和15。在表面改性培養(yǎng)板3和4上，并在存在Iih0激酶抑制劑 的情況下，人胚胎干細(xì)胞粘附并形成擴(kuò)增且可傳代至少十次的集落，從而產(chǎn)生具有正常核 型的多能細(xì)胞(僅對(duì)在表面4上生長(zhǎng)的細(xì)胞檢測(cè)了核型)。表面的氧(例如，CellBIND 與NuncIonDelta 對(duì)比)和氮(例如，Primaria 與Costar 對(duì)比；以及表面2禾口 13與CellBIND 對(duì)比)含量對(duì)于在存在Mio激酶抑制的情況下表面支持人胚胎干細(xì)胞粘附和集 落形成的能力均有影響。含有至少約0.5%的氮、氮和氧含量的總和為至少約17. 2%以及 水接觸角為至少約13. 9度的表面在存在Mio激酶抑制的情況下支持人胚胎干細(xì)胞的粘附 和集落形成。含有至少約0. 5%的氮、氮和氧含量的總和為至少約17. 3%但低于19. 9%以 及水接觸角為至少約9. 4度的表面在存在Mio激酶抑制的情況下，一些支持人胚胎干細(xì)胞 的粘附和集落形成(表面14)，另一些則不支持(表面22-24)。我們注意到，將他0激酶抑制劑從表面改性培養(yǎng)板4上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng) 物中除去導(dǎo)致了人胚胎干細(xì)胞與固體基底表面分離。細(xì)胞可通過(guò)采用Mio激酶抑制劑重新 處理而重新粘附到表面上。假定人胚胎干細(xì)胞的酶消化法傳代是一種潛在的應(yīng)激源，并可 導(dǎo)致核型不穩(wěn)定，那么采用在人胚胎干細(xì)胞傳代期間暫時(shí)移除MlO激酶抑制劑的方法，可 消除酶消化法傳代的應(yīng)激。還采用了無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基、Rho激酶抑制和表面改性培養(yǎng)板4來(lái)說(shuō)明人胚胎干 細(xì)胞的粘附和集落形成。用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對(duì)表面改性培養(yǎng)板4進(jìn)行預(yù)處理得到了更多的 集落，但僅僅是在存在Mio激酶抑制的情況下。除了通過(guò)以集群傳代細(xì)胞來(lái)保持集落式培養(yǎng)條件的酶方法來(lái)傳代人胚胎干細(xì)胞 外，人胚胎干細(xì)胞還可使用像TrypLE 或Accutase 的酶以單細(xì)胞傳代。在存在或不存在 Rho激酶抑制劑的情況下，使用粘附到表面改性培養(yǎng)板3和4上的TrypLE 將人胚胎干細(xì)胞 集落解離成單細(xì)胞懸浮液，并形成可傳代至少5次的集落，產(chǎn)生具有多能性標(biāo)記物的細(xì)胞。通過(guò)以單細(xì)胞懸浮液的形式傳代細(xì)胞制備的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物，從中除去Iih0 激酶抑制劑不會(huì)導(dǎo)致人胚胎干細(xì)胞與固體基底表面分離，但會(huì)導(dǎo)致集落比未除去Mio激酶 抑制劑時(shí)生長(zhǎng)得更快。實(shí)例19用Y-27632處理促講HEK293細(xì)胞在表面改件培養(yǎng)板上的粘附將人胚腎細(xì)胞^3(HEK293，ECACC no. 85120602)保持在含10%胎牛血清(FBS ； Lonza)的fegle最低必需培養(yǎng)基(EMEM ；Lonza, Verviers, Belgium)中。讓細(xì)胞適應(yīng)于 ft~0293a-CDM培養(yǎng)基(Lonza)，這是一種針對(duì)貼壁細(xì)胞HEK293的培養(yǎng)進(jìn)行了優(yōu)化的化學(xué)成 分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基，適應(yīng)方法是采用順序比率為3 1、1 1、1 3、1 7及最終O 1 的含血清EMEM和ft~0293a-CDM培養(yǎng)基進(jìn)行逐步的數(shù)次傳代。為了維持和適應(yīng)，將HEK293細(xì) 胞按 2. OXlO4 個(gè)細(xì)胞 /cm2 的密度接種于 75-cm2 帶 Nunclon Delta 表面(Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中，在達(dá)到70-80%的匯合度時(shí)采用胰蛋白酶/ 乙二胺四乙酸解離細(xì)胞以進(jìn)行傳代。將按照1. 0,4. O 或 10 μ M 的濃度添加了 Y-27632 (Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)的PrM93a-CDM培養(yǎng)基(100 μ 1)分配到帶有表面4、Nunclon Delta 表面或CellBIND 表面的平底96孔板上。將另外的100 μ 1具有ΗΕΚ293細(xì)胞的ft~0293a-CDM培養(yǎng)基加到孔 中O X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2)。然后將培養(yǎng)物在37°C下以及空氣中含5% CO2的潮濕氣氛中孵 育(i)96小時(shí)；或(ii) 48小時(shí)，接下來(lái)采用200 μ 1 Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS ；Lonza) 將培養(yǎng)物洗滌一次，然后添加200 μ 1無(wú)Υ-27632的ftx)293a-CDM培養(yǎng)基，最后將培養(yǎng)物再 孵育48小時(shí)。然后，使用得自Roche (Switzerland)的乳酸脫氫酶(LDH)活性試劑盒測(cè)定孔中的活細(xì)胞數(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，先用ft~0293a-CDM培養(yǎng)基洗滌孔，然后將貼壁細(xì)胞在100μ 1含有2% (v/v) Triton X-100 (Sigma Chemical Co)的 DPBS 中于 37°C下孵育 30 分鐘進(jìn)行裂解。將 裂解物、100 μ 1催化劑和染料試劑混合物混合并在25°C暗處孵育30分鐘。通過(guò)加入50 μ 1 1. OM的HCl停止反應(yīng)，然后采用微板讀數(shù)器(Genios Pro ；Tecan, Austria)在490nm處測(cè) 量吸光度。采用從這些樣品和標(biāo)準(zhǔn)品(含有得自已知數(shù)量的細(xì)胞的LDH)得到的A490值計(jì) 算細(xì)胞數(shù)。固體基底表面和Y-27632對(duì)ft~o293a-CDM培養(yǎng)基中的HEK293細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng) 的影響如圖31a所示，其中持續(xù)暴露于Y-2763296小時(shí)被標(biāo)記為“Y_2763^^!接觸”，而持 續(xù)暴露于Y-2763248小時(shí)接下來(lái)改變培養(yǎng)基并在不含Y-27632的情況下孵育48小時(shí)被標(biāo) 記為“Υ-2763Μ !接觸/4 不接觸”。在不存在Y-27632的情況下，HEK293細(xì)胞粘附到所 有三種表面上。孵育48小時(shí)后改變培養(yǎng)基導(dǎo)致了在96小時(shí)的孵育后測(cè)得的培養(yǎng)物中的細(xì) 胞數(shù)明顯更少。當(dāng)以2. 0和5. 0 μ M的濃度應(yīng)用時(shí)，Υ-27632促進(jìn)了 ΗΕΚ293細(xì)胞在表面4 和CellBIND 表面上的粘附。孵育48小時(shí)后除去Y-27632導(dǎo)致了細(xì)胞與所有三種表面明 顯分離。進(jìn)行了另一個(gè)類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，但采用2.0\104個(gè)未適應(yīng)的冊(cè)1(293細(xì)胞/(^2的接 種密度，以及整個(gè)實(shí)驗(yàn)均采用添加了 10% FBS的EMEM。固體基底表面和Y-27632對(duì)添加 了 10% FBS的EMEM中的HEK293細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)的影響如圖31b所示，其中持續(xù)暴露于 Y-2763296小時(shí)被標(biāo)記為“Y_2763^Mi接觸”，而持續(xù)暴露于Y-2763248小時(shí)接下來(lái)改變培 養(yǎng)基且在不含Y-27632的情況下孵育48小時(shí)被標(biāo)記為“Υ-2763Μ !接觸/4 不接觸”。在 不存在Y-27632的情況下，HEK293細(xì)胞粘附到所有三種表面上。孵育48小時(shí)后改變培養(yǎng) 基導(dǎo)致了在96小時(shí)的孵育后測(cè)得的培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)明顯更少。當(dāng)以2. 0和5. 0 μ M的濃 度應(yīng)用時(shí)，Υ-27632促進(jìn)了 ΗΕΚ293細(xì)胞在表面4和CellBIND 表面上的粘附。48小時(shí)的孵 育后除去Y-27632導(dǎo)致了細(xì)胞與表面4和CellBIND 明顯分離。實(shí)例20用Y-27632和H-1152處理促進(jìn)HEK293細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)將HEK293 細(xì)胞保持在含 10 % FBS (Lonza)的 EMEM (Lonza)中。在達(dá)到 70-80 % 的 匯合度時(shí)采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解離細(xì)胞以進(jìn)行傳代，按2. OX IO4個(gè)細(xì)胞/cm2的 接種密度接種到 75-cm2 帶 Nunclon Delta 表面(Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中。將添加了10% FBS 且含有 1.0、5.0、10、15或2(^] Y-27632 (Sigma Chemical Co.)或者 0· 4、1· 2、1· 6、2· 4 或 2. 8 μ M Η-1152 (Calbiochem，EMD Chemicals Inc., Darmstadt, Germany)的EMEM(500 μ 1)分配到Multidish M孔板中，它們要么帶有表面4 要么帶有未處理的(但經(jīng)、輻照，25kGy)聚苯乙烯表面。將另外500 μ 1添加了 10% FBS 且含有ΗΕΚ293細(xì)胞的EMEM加到孔中(2. OXlO4個(gè)細(xì)胞/cm2)。將培養(yǎng)物置于IncuCyte Plus (Essen Instruments, Michigan, USA)中，然后在 37°C下以及空氣中含 5% CO2 的潮濕 氣氛中孵育。hcuCyte Plus是一種自動(dòng)成像平臺(tái)，被構(gòu)造為安裝在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)計(jì) 為提供動(dòng)力學(xué)、非侵入性活細(xì)胞成像，方法是在用戶(hù)定義的時(shí)間以及培養(yǎng)物中的位置采集 細(xì)胞的相襯圖像。儀器的主要度量指標(biāo)是培養(yǎng)物匯合度，即被細(xì)胞覆蓋的表面的分?jǐn)?shù)。將 HEK293細(xì)胞無(wú)操作孵育72小時(shí)，且每2小時(shí)在一式三份培養(yǎng)物的9個(gè)位置采集圖像。使用IncuCyte Plus軟件(v. 3. 4. 1. 25966)確定培養(yǎng)物匯合度。增加Y-27632和H-1152的濃度促進(jìn)了 HEK293細(xì)胞在表面4上的粘附和生長(zhǎng)(圖 32a)。未處理的細(xì)胞培養(yǎng)表面和Y-27632或H-1152對(duì)HEK293粘附和生長(zhǎng)的影響如圖32b 所示。在存在10 μ M Y-27632和0.6-1. 2μ M H-1152的情況下，對(duì)ΗΕΚ293細(xì)胞的生長(zhǎng)和粘 附略有促進(jìn)。然而，與表面4相比，在未處理的細(xì)胞培養(yǎng)表面上，對(duì)HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)和粘 附的促進(jìn)不太顯著。實(shí)例21用H-1152處理促講HEK293細(xì)胞,的牛長(zhǎng)和對(duì)表面牛培養(yǎng)板的粘附
將 HEK293 細(xì)胞保持在含有 10 % FBS (Lonza)的 EMEM (Lonza)中。在達(dá)到 70-80 % 的匯合度時(shí)采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解離細(xì)胞以進(jìn)行傳代，并按2. OX IO4個(gè)細(xì)胞/cm2 的接種密度接種于 75-cm2 帶 NunclonDelta 表面(Thermo Fisher Scientif ic, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中。將添加了10 % FBS 且含有 0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,2. 4 或 2. 8 μ MH-1152 的 EMEM(l.Oml)分配到帶有表面4的Multidish 12孔板中。將另外1.0ml添加了 10% FBS且 含有HEK293細(xì)胞的EMEM加到孔中0 X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2)。將培養(yǎng)物置于hcuCyte Plus 中，在37°C下以及空氣中含5% CO2的潮濕氣氛中孵育42小時(shí)(每6小時(shí)采集一次圖像)。 然后通過(guò)移液移除Iml培養(yǎng)基，再加入1. Oml添加了 10% FBS且含有0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、 1. 0、1. 2和1. 4μΜ H-1152的EMEM。將培養(yǎng)物再次置于IncuCyte Plus中，然后在隨后的 25小時(shí)內(nèi)每小時(shí)采集一次圖像。在一式三份培養(yǎng)物的9個(gè)位置采集圖像，使用hcuCyte Plus軟件確定培養(yǎng)物匯合度。檢索通過(guò)hcuCyte Plus在HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物(在存在或 不存在Η-1152(0.6μΜ)的情況下生長(zhǎng))的特定位置采集到的圖像，并以相襯顯微圖示出， 用于比較以下時(shí)間點(diǎn)的ΗΕΚ293培養(yǎng)物形態(tài)孵育開(kāi)始時(shí)(0小時(shí))，臨近改變培養(yǎng)基前(42 小時(shí))，改變培養(yǎng)基后1小時(shí)(43小時(shí))，以及最后為孵育52小時(shí)后。在不存在Η-1152以及存在0. 2μΜ或0. 4μΜ Η-1152的情況下，孵育42小時(shí)后 改變50%的培養(yǎng)基導(dǎo)致了培養(yǎng)物匯合度的顯著降低(圖33a)。在存在0.64 11、0.84皿或 1.4μΜ H-1152的情況下，改變培養(yǎng)基造成的影響甚微。在存在H-1152的情況下生長(zhǎng)在表 面4上的HEK293細(xì)胞對(duì)固體基底表面的覆蓋比在不存在H-1152的情況下生長(zhǎng)在表面4上 的HEK293細(xì)胞更均勻(圖33b)。在不存在H-1152的情況下，HEK293細(xì)胞形成大型集群， 而在存在H-1152的情況下，HEK293細(xì)胞形成具有較低細(xì)胞密度的較小集群。實(shí)例22用Y-27632處理促進(jìn)HEK293細(xì)胞在表面改性培養(yǎng)板上生長(zhǎng)三代將添加了 10% FBS且含有5. ΟμΜ Υ-27632的EMEM (500 μ 1)分配到帶有表面4 或Nunclon Delta 表面的Multidish 24孔板的孔中。將另外500 μ 1添加了 10% FBS且 含有ΗΕΚ293細(xì)胞的EMEM加到孔O. 0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2)中，將培養(yǎng)物在37°C下以及空氣 中含5% CO2的潮濕氣氛中孵育3天。通過(guò)用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Lonz^Verviers， Belgium)在37°C下處理2分鐘讓細(xì)胞傳代，采用NucleoCount細(xì)胞計(jì)數(shù)器(ChemometecA/ S，Allerefd, Denmark)測(cè)定總細(xì)胞數(shù)。對(duì)于連續(xù)傳代，將HEK293細(xì)胞按2. OX IO4個(gè)細(xì)胞 /cm2的密度接種。HEK293細(xì)胞在表面4和NunclonDelta 表面上的生長(zhǎng)因存在2. 5 μ M Y-27632 而增強(qiáng)(圖;34)。
實(shí)例23人胚胎干細(xì)胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白/成分和飼養(yǎng)細(xì)胞 的表面改件培養(yǎng)板4、18和19將保持在1 30MATRIGEL包被的塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng) 基中的第42代Hl人胚胎干細(xì)胞通過(guò)LIBERASE 酶處理分離，然后按1 2的稀釋比按接 種到表面改性96孔板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種到改性表 面4、18或19或者I^rimaria 上。為了確定Iiho激酶抑制對(duì)細(xì)胞與改性表面結(jié)合的影響， 我們采用IOmMRho激酶抑制劑Y-27632或者3或IOmM Rho激酶抑制劑H-1152甘氨酰處理 細(xì)胞。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。培養(yǎng)M小時(shí)后吸出微孔中的液體，干燥細(xì)胞，然后用結(jié) 晶紫對(duì)孔染色。我們觀察到，在培養(yǎng)M小時(shí)后，胚胎干細(xì)胞集落在用Mio激酶抑制劑處理時(shí)粘附 到表面改性培養(yǎng)板4和19及I^imaria 板上并展開(kāi)，然而在表面改性培養(yǎng)板18上未觀察 到相同的效果(圖35)。實(shí)例24人胚胎干細(xì)胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白/成分和飼養(yǎng)細(xì)胞 的表面改件培養(yǎng)板30、31、32、33和34將保持在1 30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng) 基中的第47代Hl人胚胎干細(xì)胞通過(guò)TrypLE 酶處理分離，然后按1 3的稀釋比接種到 表面改性96孔板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種到改性表面30、 31、32、33或34上。為了確定Iiho激酶抑制對(duì)細(xì)胞與改性表面結(jié)合的影響，我們采用3mM Mio激酶抑制劑H-1152甘氨酰處理細(xì)胞。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。另外，將細(xì)胞接種到 用Matrigel 預(yù)處理過(guò)的表面改性培養(yǎng)板的孔中。在接種M小時(shí)后，將培養(yǎng)基用新鮮的添 加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基更換，對(duì)于在存在Mio激酶抑制劑的情況下接種的細(xì) 胞，向培養(yǎng)基添加3mM H-1152甘氨酰。培養(yǎng)48小時(shí)后吸出微孔中的液體，干燥細(xì)胞，然后 用結(jié)晶紫對(duì)孔染色。我們觀察到，在培養(yǎng)48小時(shí)后，胚胎干細(xì)胞集落在用Mio激酶抑制劑處理時(shí)粘附 到表面改性培養(yǎng)板33和34上并展開(kāi)(分別為圖39和40)，然而在表面改性培養(yǎng)板30、31 或32上未觀察到相同的效果(分別為圖36-40)。實(shí)例25人胚胎干細(xì)胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白/成分和飼養(yǎng)細(xì)胞 的表面改性培養(yǎng)板22、23、24或四將保持在1 30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基 中的第46代Hl人胚胎干細(xì)胞通過(guò)Liberase 酶處理分離，然后按1 3的稀釋比接種到 表面改性60mm培養(yǎng)皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種到表面改 性培養(yǎng)板3、4、22、23、M和四上。為了確定Iiho激酶抑制對(duì)細(xì)胞與改性表面結(jié)合的影響， 我們用3 μ M他0激酶抑制劑Η-1152甘氨酰處理細(xì)胞以接種細(xì)胞。在接種細(xì)胞M小時(shí)后， 將培養(yǎng)基用新鮮的添加了 8ng/ml bFGF和ImM Rho激酶抑制劑H-1152甘氨酰的MEF條件 培養(yǎng)基更換。接種到改性表面3、4或matrigel 包被塑料上的細(xì)胞作為對(duì)照。接種M和 48小時(shí)后，通過(guò)相襯顯微鏡觀察培養(yǎng)板。我們觀察到，培養(yǎng)48小時(shí)后，胚胎干細(xì)胞集落未粘附到表面改性培養(yǎng)板22、23、M或四上，無(wú)論是在存在還是不存在Mio激酶抑制劑的情況 下接種，而在存在Mio激酶抑制劑的情況下接種到表面改性培養(yǎng)板3或4上的細(xì)胞則確實(shí) 發(fā)生了粘附和展開(kāi)。實(shí)例26X寸絲日腺翻牛絲面睡一棘ffi水接觸角將表面改性培養(yǎng)板1-4和13分別包裝在塑料袋中、滅菌，在室溫下保存40周的 測(cè)試期。在表面處理和滅菌后一周首次測(cè)量接觸角，然后在如圖41給出的時(shí)間點(diǎn)再次測(cè) 量。所有接觸角測(cè)量均如實(shí)例17所述完成。對(duì)Nunclon Delta 和CellBIND 表面的測(cè) 量在與對(duì)表面1-4和13的測(cè)量相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，但表面處理和滅菌的完成時(shí)間在第 一次測(cè)量前不止12周(Nuclon Delta *在第一次測(cè)量前一周滅菌)。圖41表明表面改性 培養(yǎng)板1-4和13具有相似的親水性且親水性高于(較低的水接觸角)Nunclon Delta 和 CellBIND 表面。表面改性培養(yǎng)板1_4和13的親水性在表面處理和滅菌后可穩(wěn)定至少41 周。還在表面改性培養(yǎng)板5-12、22-M、29、30和33上測(cè)量了接觸角，這些培養(yǎng)板包裝 在塑料袋中并如實(shí)例16所述滅菌，然后在室溫下保存了 9周(保存了觀周的表面改性培養(yǎng) 板四例外)。表面改性培養(yǎng)板18、19、32和34為單個(gè)微孔的形式，因此不能用于測(cè)量接觸 角。表面改性培養(yǎng)板30和33為微孔板格式，其接觸角測(cè)量在板的背后而非孔內(nèi)進(jìn)行。如實(shí) 例17所述測(cè)量接觸角(對(duì)于高親水表面改性培養(yǎng)板四，施加一小滴2. 5 μ IMilliQ水)，但 分析一式三份樣品，每個(gè)樣品施加7滴。對(duì)具有Costar 、Falcon , Primaria 和Nunclon Delta 表面的板的測(cè)量在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，但表面處理和滅菌的完成時(shí)間在第一次 測(cè)量前不止12周。圖42示出了表面改性培養(yǎng)板5-12的親水性高于(較低的水接觸角) Nunclon Delta 、Costar 和Falcon 表面。表面5-12的親水性與Primaria 表面的親 水性相當(dāng)，并高于表面1-4和13的親水性(如圖41所示)。表面改性培養(yǎng)板22- 和33 的親水性與表面1-4和13的親水性相當(dāng)(如圖41所示)，而表面30的親水性與Nunclon DeltaTM、C0StarTM和hlcon 表面的親水性相當(dāng)。表面改性培養(yǎng)板四比其他被分析的表面 親水性明顯更強(qiáng)。負(fù)電荷密度測(cè)定了表面改性培養(yǎng)板5-12(均為5 11培養(yǎng)皿形式)、18、19、30、32、33和34 (均 為微孔形式)、表面改性培養(yǎng)板22-M和四(均為6cm培養(yǎng)皿形式)、CellBIND 表面(3cm 培養(yǎng)皿形式)、Primaria 表面(multidish 6孔培養(yǎng)板形式)以及Nunclon Delta 表面 (3cm培養(yǎng)皿形式)上的負(fù)電荷密度。將過(guò)量的結(jié)晶紫水溶液(0.015%重量體積比)加入 每種形式中(培養(yǎng)皿形式中加入0. 3%il/cm2，微孔形式中加入0. 13ml/cm2)，并在輕微搖動(dòng) (50rpm)下于室溫孵育60分鐘。為了去除未與表面結(jié)合的結(jié)晶紫，用:3ml MilliQ水沖洗培 養(yǎng)皿形式的培養(yǎng)板3次，并用350 μ 1 MilliQ水沖洗微孔形式的培養(yǎng)板3次，然后在60°C下 干燥過(guò)夜。通過(guò)加入0. 17ml/cm2溶于KOH溶液(99% )的0. IM HCl來(lái)解吸與表面結(jié)合的 結(jié)晶紫，然后在輕微搖動(dòng)(50rpm)下于室溫孵育培養(yǎng)板2分鐘。使用EnVision 2100微板讀 數(shù)器(Perkin Elmer ；WaItham，MA，USA)在590nm測(cè)定含有解吸的結(jié)晶紫的HCl JtOH溶液 的吸光度。校正吸光度值，去除HCl JtOH溶液的背景吸光度。對(duì)于表面改性培養(yǎng)板5-12、ZZj^^jellBINDTMjrimaria 和Nunclon Delta ，各測(cè)量三個(gè)板的負(fù)電荷密度，并且每 個(gè)板的吸光度測(cè)量重復(fù)進(jìn)行3次。對(duì)于表面改性培養(yǎng)板18、19、30、32、33和34而言，檢測(cè) 一個(gè)樣品并重復(fù)測(cè)量3次。表面改性培養(yǎng)板5-12的負(fù)電荷密度是類(lèi)似的，并且這些表面的負(fù)電荷密度顯著 低于CellBIND 表面和Nunclon Delta 表面的負(fù)電荷密度，但顯著高于I^rimaria 表面的 負(fù)電荷密度(圖43)。表面改性培養(yǎng)板19、33和34的負(fù)電荷密度顯著高于表面改性培養(yǎng)板 18、30和32的負(fù)電荷密度，后者各自為用相同的聚合材料制成的未處理表面。將表面改性 培養(yǎng)板22-M和四的負(fù)電荷密度歸一化到Nunclon Delta 表面的負(fù)電荷密度，圖44示出 了表面改性培養(yǎng)板22-M的負(fù)電荷密度高于Nunclon Delta 表面的負(fù)電荷密度，而表面改 性培養(yǎng)板四的負(fù)電荷密度顯著低于Nunclon Delta 表面(和表面4)的負(fù)電荷密度。X射線(xiàn)光電子能譜(XPS)按照實(shí)例17中所述的方法，使用XPS分析表面改性培養(yǎng)板5-12、18、19、22-對(duì)、29、 30、31-34。以原子百分?jǐn)?shù)為單位的表面元素組成示于表12中。除了表面改性培養(yǎng)板31和 32 (未進(jìn)行等離子體處理)不含氮外，所有的表面都含有碳、氧和氮(XPS不能檢測(cè)氫)。表 面改性培養(yǎng)板5-12的氧含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13，但顯著高于Costa/Mjalcon 和Nunclon Delta 表面(示于表7中)。表面改性培養(yǎng)板5_12通過(guò)微波等離子體處理制 備，而表面改性培養(yǎng)板1-4和13通過(guò)電暈等離子體處理制備。表面改性培養(yǎng)板19、33和 34通過(guò)電暈等離子體處理制備，但由其他非聚苯乙烯的聚合物注射成型(聚苯乙烯用于制 備表面改性培養(yǎng)板1-4和13)，這些表面改性培養(yǎng)板的氧含量與表面改性培養(yǎng)板1-4和13 的氧含量相當(dāng)。表面改性培養(yǎng)板22-24的氧含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13。表面改 性培養(yǎng)板四的氧含量與表面改性培養(yǎng)板1-4和13的氧含量相當(dāng)。表面改性培養(yǎng)板5-12、 19,33和34的氮含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13，但高于CostarTM、i^alconTM和Nunclon Delta 表面(示于表7中)。表面改性培養(yǎng)板四的氮含量明顯高于其他被分析的表面，包 括 I^rimaria 表面。通過(guò)使用可在文獻(xiàn)中找到的物質(zhì)的峰寬和能級(jí)，對(duì)Cls譜峰進(jìn)行曲線(xiàn)擬合(最佳 卡方擬合)，以確定和定量表面改性培養(yǎng)板中碳的鍵合環(huán)境(表13)。濃度以原子百分?jǐn)?shù) 為單位進(jìn)行記錄，可通過(guò)原子濃度與面積百分?jǐn)?shù)相乘來(lái)得到。就碳鍵合環(huán)境而言，除表面 10、22-M和四以外，所有等離子體處理的表面均類(lèi)似。表面19、33和34中的C_
_C的 碳比例顯著高于表面5-12、18、30和32以及表面1_4和13中的水平(示于表8中)。表 面5-12、19、33和34中的0_[C = 0]_0鍵合環(huán)境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。 表面5-9、11、12、19、33和34中的O-C-O-C-O的碳比例顯著高于表面1-4和13中的水 平，但與Nunclon Delta 禾口 CellBIND 表面中的水平相當(dāng)。表面5_12、19、33和34中的 C-O-C或C-NH3+鍵合環(huán)境(光譜中能級(jí)相同)的碳比例低于表面1-4和13中的水平，但高于 Costa/Mjalcon^^CellBIND 和 I^rimaria 表面中的水平。表面 19、33 和 34 中的 C-0-C* =0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面5-12中的水平，并與表面1-4和13中的水平相當(dāng)。表面 5-12中的C = 0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，但低于表面1_4和13中 的水平。表面5-12中的CO 3_鍵合環(huán)境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，并與表面 1-4和13中的水平相當(dāng)。就碳鍵合環(huán)境而言，表面22-M類(lèi)似。表面22-M中的C-
-C、 0-[C = 0]-0、C-O-C或C-NH 3+> C-O-C = 0*和C = 0中的碳比例顯著低于表面1_4禾Π 13中的水平。表面22-24中的CO 3_和O-C-O-C-C*鍵合環(huán)境的碳比例高于表面1_4和13中的 水平。表面四的碳鍵合環(huán)境不同于所有其他等離子體處理表面的碳鍵合環(huán)境。c-[o]-c中 的碳比例與表面1-4和13中的水平相當(dāng)。表面29中的0-[C = 0]-0、C03_和C*-C_0-C-C* 鍵合環(huán)境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。表面四中的C-O-C或C-NH3+、C-0-C* = 0和C = 0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面1-4和13中的水平。能量損失峰由芳族Π —Π *躍 遷產(chǎn)成，是表面芳香性的指示。Ols譜峰幾乎為高斯型，不能進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。通過(guò)使用可在文獻(xiàn)中找到的物質(zhì)的峰 寬和能級(jí)，對(duì)Nls譜峰進(jìn)行曲線(xiàn)擬合(最佳卡方擬合)，以確定和定量表面中氮的鍵合環(huán)境 (表14)。濃度以原子百分?jǐn)?shù)為單位進(jìn)行記錄，可通過(guò)原子濃度與面積百分?jǐn)?shù)相乘來(lái)得到。 除表面9以外，所有表面中的-NH3+鍵合環(huán)境的氮比例均低于表面1-4和13中的水平。表 面5-12、19、33和34中的-NH2鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都高于表面1_4和13中的水平。 表面5-12、19、33和34的-NO2鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都低于表面1_4和13中的水平。 表面5-12、19、33和34的-NO3鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都高于表面1_4和13中的水平。 表面22-Μ和四的氮鍵合環(huán)境不同于其他等離子體處理表面。表面22-Μ和四中的-NH2 鍵合環(huán)境的氮比例是變化的，但都顯著高于表面1-4和13中的水平。表面22-Μ和四中 的-NO2鍵合環(huán)境的氮比例低于表面1-4和13中的水平。就0 = C-N-C = 0鍵合環(huán)境中的 氮比例而言，表面22-24和29與表面1-4和13是相當(dāng)?shù)?。在整篇文檔中引用的出版物據(jù)此全文以引用方式并入。盡管上文已結(jié)合實(shí)例和優(yōu) 選實(shí)施例描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不受上述具體實(shí)施方式
的限 定，而受以下在專(zhuān)利法原則下合適解釋的權(quán)利要求書(shū)的限定。
^ ι50^,Km.m^mm^ HI 細(xì)朐,Φ多 能標(biāo)記物的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面的方法，所述表面含有至少約0. 5%的N、0和N的總和大 于或等于17.2%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，所述方法包括以下 步驟a.獲得所述細(xì)胞的懸浮液，b.用至少一種選自以下物質(zhì)的化合物處理所述細(xì)胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性的 化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將所述細(xì)胞懸浮液添加到所述表面，讓所述細(xì)胞粘附。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述0和N的總和大于或等于19.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞在粘附于所述表面后進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中將至少一種化合物在所述細(xì)胞粘附于所述表面后 去除。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)去除至少一種化合物將所述細(xì)胞與所述表面 分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液為細(xì)胞群懸浮液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液為單細(xì)胞懸浮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面為容器或基質(zhì)的一部分。
10.一種促進(jìn)細(xì)胞粘附于表面的方法，所述表面含有至少約0. 9%的N、0和N的總和大 于或等于22. 3%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，所述方法包括以下 步驟a.獲得所述細(xì)胞的懸浮液，以及b.將所述細(xì)胞懸浮液添加到所述表面，并讓所述細(xì)胞粘附。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞在粘附于所述表面后進(jìn)行培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液為細(xì)胞群懸浮液。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液為單細(xì)胞懸浮液。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述表面為容器或基質(zhì)的一部分。
16.一種表面，所述表面為旨在用于細(xì)胞培養(yǎng)或分析的容器或基質(zhì)的一部分，所述表面 含有至少約0. 9%的N、0和N的總和大于或等于22. 3%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼 養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層，其中所述表面允許細(xì)胞的粘附和培養(yǎng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的表面，其中所述細(xì)胞在粘附于所述表面后進(jìn)行培養(yǎng)。
19.一種組合物，包含a.表面，所述表面為旨在用于細(xì)胞培養(yǎng)或分析的容器或基質(zhì)的一部分，所述表面含有 至少約0. 5%的N、0和N的總和大于或等于17. 2%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細(xì) 胞層和吸附層，以及b.至少一種選自以下物質(zhì)的化合物能夠抑制Mio激酶活性的化合物和能夠抑制Mio 活性的化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述0和N的總和大于或等于19.5%。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，并提供了用于使細(xì)胞粘附于固體基底表面、在固體基底表面上培養(yǎng)以及與固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約0.5％的N、O和N的總和大于或等于17.2％、接觸角為至少約13.9度且不含飼養(yǎng)細(xì)胞層和吸附層。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將所述細(xì)胞用能夠抑制Rho激酶活性的化合物處理。在另一個(gè)實(shí)施例中，將所述細(xì)胞用能夠抑制Rho活性的化合物處理。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102046779SQ200980106108
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者B·弗里耶, S·納爾遜, T·K·馬伍德, T·布雷維, V·尼爾森 申請(qǐng)人:森托科爾奧索生物科技公司