專利名稱：NOS1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rs12742393多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法，具體是一種N0S1AP(—氧化氮合酶1銜接蛋白)基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法。
背景技術(shù)：
N0S1AP基因位于染色體lq23. 3，該基因編碼的蛋白屬于一種銜接蛋白，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)的活性，并影響N甲基D天冬氨酸受體(NMDAR)介導(dǎo)的一氧化氮的釋放。近期研究表明，nNOS功能紊亂不僅參與糖尿病自主神經(jīng)病變、糖尿病腎病及視網(wǎng)膜病變，而且直接參與胰島素分泌和胰島素釋放。N0S1AP在胰島細(xì)胞中高表達(dá)，可能通過對nN0S的調(diào)節(jié)作用參與胰島素分泌的調(diào)節(jié)。N0SlAP基因上的多態(tài)位點(diǎn)，如rsl2742393的研究有望成為糖尿病遺傳學(xué)研究的新熱點(diǎn)。為適應(yīng)國際上糖尿病遺傳學(xué)研究的趨勢，目前迫切需要建立在大規(guī)模樣本中檢測N0S1AP基因上多態(tài)位點(diǎn)的穩(wěn)定方法。目前對rsl2742393位點(diǎn)在白種人和中國人群中鮮有研究，國內(nèi)外尚未有對該位點(diǎn)進(jìn)行大批量檢測的相關(guān)報(bào)道。 經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Sequenom公司在2005年針對MassARRAY iPlex技術(shù)公開發(fā)行了一份應(yīng)用指南《iPLEX Application Guide》，該指南提及，MassARRAY iPlex方法是一種新型的用于高通量SNP檢測方法，該方法利用單堿基延伸和基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜測定SNP位點(diǎn)基因型，該指南描述了此技術(shù)的操作方法，包括如下步驟基因組DNA模板的提取；設(shè)計(jì)特異性核酸引物擴(kuò)增目的基因；測定SNP位點(diǎn)基因型等步驟。但是該方法對于SNP位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)只描述了設(shè)計(jì)原則，并且無論是DNA的提取方法，還是引物設(shè)計(jì)的實(shí)際操作都使得該方法在應(yīng)用到具體基因時(shí)存在一定局限性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域
上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法。本發(fā)明提供了一種N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上
rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)，并且建立了一種在大批量樣本中進(jìn)行N0S1AP基因上rsl2742393多
態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的， 本發(fā)明涉及一種分離核酸，其序列如SEQ ID NO :1所示。 本發(fā)明涉及的一種N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法，步驟包括 步驟一 ，從樣品中提取基因組DNA ; 步驟二，設(shè)計(jì)可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO :1所示序列中第121位核苷酸位點(diǎn)的核酸引物；
步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增DNA片段； 步驟四，檢測步驟三擴(kuò)增得到的DNA片段中含有的如SEQID NO :1所示序列第121位核苷酸位點(diǎn)是否存在A到C的單核苷酸多態(tài)性。
步驟二中，所述核酸引物長度為22bp 30bp。
步驟二中，所述核酸引物具體為 正向引物5' -ACG TTG GAT GAG GAT AAC ACC ACC CAT ACC_3，，
反向引物5' -ACG TTG GAT GCA CTA TAA GCT GGG AAC AGG_3，。
步驟四中，所述測定為，用單堿基延伸和利用基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜進(jìn)行測定。 本發(fā)明從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；根據(jù)N0S1AP基因rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對特異性核酸引物，擴(kuò)增目的基因；測定rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ IDNO :1所示序列第121位是否存在A到C的單核苷酸多態(tài)性。
本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明提供了一種N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)；建立了 一種在大批量樣本中進(jìn)行N0S1AP基因rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法，可利用 一 臺MassARRAY iPLEX設(shè)備，8小時(shí)內(nèi)完成768個(gè)樣本的rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)檢測。
圖1為N0S1AP基因結(jié)構(gòu)及rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)示意圖； 圖2為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜檢測rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)施方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人所著分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork :ColdSpringHarborLaboratory Press, 1998)中所述條件，
或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例 如圖1所示，N0S1AP基因包含10個(gè)外顯子，rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)位于N0S1AP基因內(nèi)含子2。 N0S1AP基因內(nèi)含子2上的rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測具體檢測步驟包括
步驟一，從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板
用常規(guī)酚氯仿法從樣品中提取基因組DNA，具體過程如下 (1)取肝素抗凝的新鮮的人全血5ml，加入破膜液至總體積為50ml，破膜液組成如下0. 32mmol/L蔗糖、10mmol/LTris-HCl、5mmol/LMgCl2、lX Triton-X 100，其中l(wèi)OOOml破膜液的配方為109. 5g蔗糖、10mllMTris-HCl、lml5匪gCl2、10mlTriton-X 100 ;充分混勻，于4000g離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)操作一次； (2)在沉淀中加入含0. 075mol/LNaCl、0. 024mol/L EDTA的溶液4. 5ml，其中，lOOOml該溶液的配方為4. 38gNaCl、240m10. 1MEDTA，充分混勻，再加入蛋白酶Klmg， 5 %SDSO. 5ml，其中，5X SDS的配制為5gSDS加水至100ml ;輕輕混勻，得到混合溶液，上述過 程均在fC條件下操作；將混合溶液于37t:消化過夜； (3)向混合溶液中加入5ml平衡的重蒸苯酚和5ml體積比為24 : 1的氯仿異戊 醇，搖10分鐘，于4000g離心10分鐘，棄去下層有機(jī)相；再加入5ml體積比為24 : 1的氯 仿異戊醇，搖10分鐘，于4000g離心10分鐘，棄去下層有機(jī)相； (5)加入0. 5ml 3mol/L醋酸鈉溶液及12. 5ml的_20°C的無水乙醇，用實(shí)心玻璃棒 撈起狀沉淀，取無水乙醇70ml加水稀釋至lOOml，用該乙醇溶液洗滌沉淀一次，待酒精揮發(fā) 后，將沉淀溶解于500 1 TE緩沖液中，于4t:溶解過夜； 將DNA樣本原液混勻離心，用4倍原液體積的H20稀釋后，用BioPhotometer生物 分光光度計(jì)測定稀釋液濃度及0D260/0D280值，計(jì)算后將DNA樣本稀釋至20ng/ y 1 ，儲存于 微量離心管，使用印Motion移液工作站將稀釋好的樣本加入384孔儲液板于4"C儲存。
步驟二，設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQID NO :l所示序列中第121位核苷酸多態(tài) 性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因 PCR擴(kuò)增目的基因，PCR及單堿基延伸在Mastercycler384孔熱循環(huán)儀
(Eppendorf)上進(jìn)行。 —對特異性核酸引物PCR正向引物5' -ACG TTG GAT GAG GAT AAC ACC ACC CAT ACC-3'，
PCR反向引物5， -ACG TTG GAT GCA CTA TAA GCT GGG AAC AGG_3，，
單堿基延伸引物5' -CCA CCC ATA CCA CAG ATT GTA C_3'。
PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，反應(yīng)體系及步驟如下
反應(yīng)體系 PCR緩沖液為0. 625 ii 1 ;10mM dNTP為0. 25 ii 1 ;混合引物為1 P 1 ;HotStarTaq
酶為0. 1 ill ;DNA模板為1. 0 ill ;ddH20為2. 025 il 1 ;反應(yīng)體系總體積為5 iU。 反應(yīng)步驟 94"預(yù)變性為2min ; 進(jìn)入循環(huán)94。C變性為20s，56。C退火為10s，65。C延伸為30s，共45個(gè)循環(huán)； 最后65 °C延伸為3min 。 SAP反應(yīng) 反應(yīng)體系 SAP反應(yīng)緩沖液為0. 17iU ;SAP酶為0. 30 iU ;PCR反應(yīng)混合液為5. OOill ; ddH20為1. 53 ill ;反應(yīng)體系總體積為7 ill。 反應(yīng)步驟 37。C溫育40min， 85。C加熱5min。 通過上述反應(yīng)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。 步驟三，測定rs12742393多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQID NO :1所示序列第121位是 否存在A到C的單核苷酸多態(tài)性 單堿基延伸反應(yīng) 反應(yīng)體系 iPLEX緩沖液為0. 200 y 1 ;iPLEX反應(yīng)終止液為0. 200 iU ;iPLEX酶為
50. 041 ill ;延伸引物液為0. 804 ill ;SAP反應(yīng)后混合液為7. 000;(1(11120為0. 755 ;
反應(yīng)體系總體積為9. 000 ill。
反應(yīng)步驟 94。C預(yù)變性為30s ; 進(jìn)入大循環(huán)94。C變性為5s，共40個(gè)大循環(huán)； 進(jìn)入小循環(huán)52。C退火為5s，80。C延伸為5s，共5個(gè)小循環(huán)； 72。C延伸為3min。 基于質(zhì)譜的SNP基因型檢測在MassARRAYCompact Analyzer (Sequenom)上進(jìn)行， rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)基因型檢測和讀取，在每個(gè)反應(yīng)液中加入6mg純化樹脂，每個(gè)樣本加 入16 iil水，沿384孔板長軸旋轉(zhuǎn)15min進(jìn)行純化反應(yīng)，384孔反應(yīng)板4000rpm離心5min 后，使用Nanodispenser點(diǎn)樣轉(zhuǎn)移至Spectro基因芯片，在MassARRAYAnalyzerCompact進(jìn) 行SNP基因型檢測讀取?；|(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜檢測rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果示 意圖如圖2所示，圖2中，分布在位置1內(nèi)的樣本為A/A基因型，分布在位置2內(nèi)的樣本為 A/C基因型，分布在位置3內(nèi)的樣本為C/C基因型。 結(jié)果標(biāo)明，本實(shí)施例可利用一臺MassARRAY iPLEX設(shè)備，8小時(shí)內(nèi)完成768個(gè)樣本 的rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)檢測，N0S1AP基因rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)在3411例樣本中的檢測 成功率達(dá)到99. 6% 。序列表〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法〈160>1〈210>1〈211>240〈212>DNA〈213>人(Homo sapiens)〈220〉〈221>misc_feature〈222〉 (121)〈223>n = a或c〈400>13朋gtgtgct cte朋tt朋c teccac朋tectttatagtatgccatagtttatagcatat60tacaaattat actctaactg tagatcactat朋gCtgggEl3C3gggC朋tgcattttacc120ngtacaatct gtggtatggg tggtgttatcctcatattgcgattgaggct180tagatgttta agtgacttct tggcactcac3cagctggtegattccttatctgggattta240
權(quán)利要求
1、一種分離核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID NO1所示。
2. 2、一種N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法，其特征在于， 包括如下步驟步驟一，從樣品中提取基因組DNA ;步驟二，設(shè)計(jì)可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO :1所示序列中第121位核苷酸位點(diǎn)的核酸 引物；步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增DNA片段； 步驟四，檢測步驟三擴(kuò)增得到的DNA片段中含有的如SEQID NO :1所示序列第121位核 苷酸位點(diǎn)是否存在A到C的單核苷酸多態(tài)性。
3. 3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測 方法，其特征是，步驟二中，所述核酸引物長度為22bp 30bp。
4. 4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的N0S1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測 方法，步驟二中，所述核酸引物具體為正向引物5' -ACG TTG GAT GAG GAT AAC ACC ACC CAT ACC_3，， 反向引物5' —ACG TTG GAT GCA CTA TAA GCT GGG AAC AGG—3'。
5. 5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的NOS1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的檢測 方法，步驟四中，所述測定為用單堿基延伸和利用基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜進(jìn)行測定。
全文摘要
一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的NOS1AP基因內(nèi)含子2區(qū)域上rs12742393多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法；該多態(tài)性位點(diǎn)具體為SEQ ID NO1所示序列中第121位核苷酸；檢測方法包括如下步驟從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQID NO1所示序列中第121位核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因；測定rs12742393多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQID NO1所示序列第121位是否存在A到C的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明建立了一種在大批量樣本中進(jìn)行NOS1AP基因上rs12742393多態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法。
文檔編號C12N15/11GK101698843SQ20091030751
公開日2010年4月28日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者張蓉, 王從容, 胡承, 賈偉平 申請人:上海交通大學(xué)