專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生物催化生產(chǎn)3,6-二氯吡啶-2-羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種生物催化生產(chǎn)3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸的 方法。
背景技術(shù)：
3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸，又名二氯吡啶酸、畢克草，是一種內(nèi)吸性芽后除草 劑，可有效地防除菊科、豆科、茄科和傘形科雜草。目前主要以電解法合成3，6_ 二氯吡 啶-2-羧酸，如美國(guó)專(zhuān)利US4217185、浙江工業(yè)大學(xué)CN1807691A、利爾化學(xué)股份有限公司 CN101235512A等均以3，4，5，6_四氯吡啶甲酸為主要原料，在不同的反應(yīng)體系下電解制得 高純度的3，6_ 二氯吡啶甲酸。美國(guó)專(zhuān)利US3317549采用甲基吡啶為原料，通過(guò)光催化，氯 代水解后制得3，6- 二氯吡啶-2-羧酸。1978年美國(guó)專(zhuān)利US4087431采用化學(xué)法還原3，4， 5，6-四氯-2-氰基吡啶制得3，6- 二氯吡啶-2-羧酸。1977年GB1469610中采用化學(xué)還原 3，4，5，6_四氯吡啶甲酸制備3，6_二氯吡啶-2-羧酸，目前國(guó)內(nèi)外還有幾家單位在采用該法 生產(chǎn)，如射陽(yáng)黃海農(nóng)藥化工有限公司公開(kāi)專(zhuān)利CN101139318A中以2-氰基吡啶和氯氣為主 要原料，采用傳統(tǒng)的氯化、水解及還原生產(chǎn)路線(xiàn)，在傳統(tǒng)的三氯化鐵及鹽酸介質(zhì)中增加氯化 鋅與氯化鈷組份作為主催化劑，控制好還原體系中碳酸鈉濃度、氫氧化鈉與四氯吡啶酸的 質(zhì)量比和反應(yīng)體系的溫度和PH環(huán)境，最終可使收率高達(dá)80%以上，含量高達(dá)98. 8%以上。 此法的不足之處在于環(huán)境污染較嚴(yán)重。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物催化生產(chǎn)3，6_ 二氯吡 啶-2-羧酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一株用于該方法的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到本發(fā)明以3，6-二氯-2-氰基吡啶為起始原料；產(chǎn)水解酶活性細(xì)胞為生物催化劑， 采用水_水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相系統(tǒng)進(jìn)行催化反應(yīng)生產(chǎn)3，6- 二氯吡啶-2-羧酸。 水-水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相反應(yīng)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)與分離的耦合，細(xì)胞富集于水 相中，底物3，6_二氯-2-氰基吡啶位于有機(jī)相中，減少了對(duì)細(xì)胞的毒害；一部分產(chǎn)物以銨鹽 的形式直接進(jìn)入水相，另一部分產(chǎn)物以游離3，6-二氯吡啶-2-羧酸的形式被萃取到有機(jī)相 中，有效降低了高濃度產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制作用。分離階段先靜置數(shù)小時(shí)將兩相分離，上層有 機(jī)相經(jīng)堿液洗滌后以3，6-二氯吡啶-2-羧酸鹽的形式進(jìn)入水相，其余有機(jī)相及其中未反應(yīng) 完的殘余3，6-二氯-2-氰基吡啶底物繼續(xù)套用到下批反應(yīng)系統(tǒng)中。下層水相及上層有機(jī) 相的洗滌液合并后過(guò)濾掉細(xì)胞及其大顆粒狀物質(zhì)即為3，6-二氯吡啶-2-羧酸的鹽溶液，酸 化后結(jié)晶即可得高純度的3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸。一種生物催化生產(chǎn)3，6- 二氯吡啶-2-羧酸的方法，該方法以產(chǎn)腈水解酶活性細(xì)胞 為生物催化劑，在水-水不溶性有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中，溫度為15 35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100 300rpm下反應(yīng)24 72小時(shí)，將底物3，6- 二氯-2-氰基吡啶水解為3，6- 二氯吡啶-2-羧酸。所述的底物3，6-二氯-2-氰基吡啶以0. 1 30% (g/100ml有機(jī)相)的量溶于有 機(jī)相，有機(jī)相的初始體積為水相的5 60%，隨著反應(yīng)的進(jìn)行采用分批補(bǔ)加或流加的形式 逐漸提高其體積比，使其最終所占體積比不超過(guò)反應(yīng)液體積總和的70 %，且催化系統(tǒng)最終 反應(yīng)液的體積不超過(guò)反應(yīng)容器的75%。所述的有機(jī)相溶劑選自水不溶性有機(jī)溶劑正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯 仿中的一種或幾種以任意比例的混合物。所述的水相部分為去離子水，控制pH5 9，加入生物催化劑，制備成催化劑濃度 為5 25% (% :g/100mL)的水相混合液，其中該催化劑為具有腈水解酶活性的靜息游離 細(xì)胞、固定化細(xì)胞或絮凝化細(xì)胞液，優(yōu)選枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)靜息游離細(xì)胞、 固定化細(xì)胞或絮凝化細(xì)胞液。所述的反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液放出后靜置分層，先將上層有機(jī)相和下層水相進(jìn)行分 離。采用少量多次的原則用氨水對(duì)上層有機(jī)相洗滌1 3次后靜置分層，水相與反應(yīng)液的 下層水相合并；有機(jī)相繼續(xù)套用到下批反應(yīng)系統(tǒng)中。合并后的水相采用0. 2 0. 5um膜過(guò) 濾，濾液用濃度為0. 1 5mol/L的無(wú)機(jī)酸酸化處理至pH 3 6，之后于1 4°C靜置2h以 上，等晶體析出后冷凍離心，干燥即可得純度在95%以上的3，6- 二氯吡啶-2-羧酸晶體。所述的無(wú)機(jī)酸為鹽酸、硫酸或者磷酸中的一種或幾種組成的混合液。一株用于生物催化生產(chǎn)3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸的枯草芽孢桿菌 (BaCillUSSUbtiliS)KR2，該細(xì)菌保藏于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 號(hào) CGMCC No. 3242?？莶菅挎邨U菌KR2 (CGMCC No. 3242)具有以下微生物學(xué)特征1.形態(tài)學(xué)特征在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)后出現(xiàn)圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，表 面濕潤(rùn)，邊緣光滑，整個(gè)菌落凸起，易挑??；鏡檢成桿狀，大小長(zhǎng)為(0. 5 0. Sum) X (1. 5 2. 5um)，芽孢中生。2.培養(yǎng)學(xué)特征表1枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)在3種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征 3.生理生化特征表2枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)生理生化性質(zhì) (注表中“+ ”表示陽(yáng)性，“_”表示陰性。)枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC NO. 3242)的培養(yǎng)方法如下(1)種子液制備先進(jìn)行枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC NO. 3242)斜面種子制備，將 枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)接種到滅過(guò)菌的斜面培養(yǎng)基上后在20 35°C下培養(yǎng) 3 7天，刮取3 5環(huán)菌種接種到裝有已滅菌的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為20 350C，轉(zhuǎn)速為100 300rpm下振蕩培養(yǎng)30 120小時(shí)，即可作為枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242)的一級(jí)種子。同樣培養(yǎng)條件下，將一級(jí)種子按3 10% (% :v/v)的接種量轉(zhuǎn)接第二批裝有同樣培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)30 72小時(shí)后作為枯草芽孢桿菌 KR2 (CGMCC NO. 3242)的二級(jí)種子。(2)擴(kuò)大培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242) 二級(jí)種子以3 10%
ν)的接種量接種到7 300L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量60 70% (% ν/ν)，通氣量0. 1 1 (v/v. min)，罐壓0. 02 0. 05MPa，溫度20 35°C，轉(zhuǎn)速100 400rpm，發(fā)酵時(shí)間30 120小時(shí)。所涉及的培養(yǎng)基成分如下斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 30，酵母膏2 10，蛋白胨2 10，氯化鈉1 5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，瓊脂15 20，pH 5 9， 121 °C 滅菌 20min。一級(jí)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 30，酵母膏2 10，蛋白胨2 10，氯化鈉1 5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，己內(nèi)酰胺 0. 5 10，異戊腈0· 1 5，氯化鈷5 50ppm，pH 5 9。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 50，酵母膏2 10，蛋白胨2 10，氯化鈉1 5，磷酸二氫鉀0. 5 3，磷酸氫二鉀0. 5 3，硫酸鎂0. 2 2，異戊腈0. 1 5，己內(nèi)酰 胺0· 5 10，氯化鈷5 50ppm，pH 5 9。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用生物催化法生產(chǎn)3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸的工藝在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān) 報(bào)道，為本發(fā)明首創(chuàng)。與化學(xué)水解法相比較而言，本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好；水-有機(jī) 相兩相系統(tǒng)的采用使反應(yīng)與分離實(shí)現(xiàn)耦合，細(xì)胞富集于水相中，底物3，6_ 二氯-2-氰基吡 啶位于有機(jī)相中，減少了高濃度底物對(duì)細(xì)胞的毒害；一部分產(chǎn)物以銨鹽的形式直接進(jìn)入水 相，另一部分產(chǎn)物以游離3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸的形式被萃取到有機(jī)相中，有效降低了高 濃度產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明工藝最終所得產(chǎn)物純度超過(guò)95%，收率在85%以上。 同時(shí)，本發(fā)明還具有產(chǎn)物與底物易分離，收率高，工藝簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。涉及的生物材料樣品的保藏本發(fā)明所要求保護(hù)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)KR2保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3242，保藏日期為2009年8月19日。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌種篩選本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)KR2是本公司生物化工研究 組成員從受腈類(lèi)化合物污染達(dá)15年以上的的農(nóng)藥廠(chǎng)土壤中篩選得到。本發(fā)明中菌種的篩選方法如下從南京第一農(nóng)藥廠(chǎng)污水池不同角度取污泥樣100余批，分批富集培養(yǎng)后進(jìn)行篩選 和鑒定稱(chēng)取10克污泥，加無(wú)菌水50mL，用玻璃珠搖碎后取5mL懸濁液接種到45mL富集培 養(yǎng)基中，放置30°C搖床上，120rpm振蕩培養(yǎng)3天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0_6、 IO-7UO-8的梯度稀釋液涂布到含初篩固體培養(yǎng)基的平板上，置30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 6天。挑取生長(zhǎng)出的單菌落接種到新的初篩固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。待菌長(zhǎng) 出后刮取3 5環(huán)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在30°C搖床上120rpm下振蕩培養(yǎng) 3天，取15mL培養(yǎng)液3000rpm下離心lOmin，倒去上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌 體，繼續(xù)離心得菌體。將所得菌體添加到含(%:g/100mL)亞氨基二乙腈的PBS緩沖液 中轉(zhuǎn)化2小時(shí)，反應(yīng)體系中菌體濃度為0. 5g/L。取5mL轉(zhuǎn)化液3000rpm下離心IOmin得上 清液，HPLC法分析上清液。如果轉(zhuǎn)化液含有亞氨基二乙酸則說(shuō)明該菌對(duì)亞氨基二乙腈具有 轉(zhuǎn)化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化率最高的一株，按《簡(jiǎn)明伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版 進(jìn)行鑒定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏于中國(guó)微生物保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC NO. 3242，保藏日期為2009年8月19日。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)能同時(shí)在分別以丙烯腈、煙腈、乳 腈、羥基乙腈，亞氨基二乙腈為唯一氮源的固體初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，底物范圍廣，降解腈類(lèi) 化合物能力強(qiáng)，適合用于本發(fā)明中3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸的生物催化合成。篩選方法中的所述的液體富集培養(yǎng)基、固體初篩培養(yǎng)基、液體復(fù)篩培養(yǎng)基分別如 下富集培養(yǎng)基(g/100mL)葡萄糖:3，酵母膏0. 5，蛋白胨0. 5，氯化鈉0. 1，磷酸 二氫鉀0. 1，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，PH :7。固體初篩培養(yǎng)基(g/100mL)葡萄糖3，亞氨基二乙腈(或丙烯腈、或煙腈、或乳 腈、或羥基乙腈):1，氯化鈉0. 1，磷酸二氫鉀0. 1，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂:0.05，瓊脂 2，pH :7。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)葡萄糖3，酵母膏0. 5，蛋白胨0. 5，氯化鈉0. 1， 磷酸二氫鉀0. 1，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，尿素0. 5，pH :7。實(shí)施例2生物催化劑的制備在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)刮取枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242)斜面菌 種3環(huán)，接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉2，磷酸 二氫鉀1，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.5，己內(nèi)酰胺5，異戊腈1，氯化鈷10ppm，pH :7. 0， 單位g/L)。在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為150rpm下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)即可得一級(jí)枯草芽孢桿菌 KR2(CGMCC No. 3242)種子液，將該一級(jí)種子液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有同樣成分已滅 菌的培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC No. 3242) 二級(jí)種子 液。將枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC No. 3242) 二級(jí)種子液按照10%的接種量接種到35L 已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化鈉2，磷酸二氫 鉀1，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0. 5，己內(nèi)酰胺:5，異戊腈:1，氯化鈷=IOppm, pH :7，單位:g/ L)，發(fā)酵罐體積為50L，采用通空氣與攪拌聯(lián)用的方式控制溶氧不低于10%，通氣量0. 2v/ v. min，罐壓0. 03MPa，溫度25°C，起始轉(zhuǎn)速lOOrpm，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)發(fā)酵液的溶氧水平有 步驟的調(diào)節(jié)，最大轉(zhuǎn)速不超過(guò)400rpm，發(fā)酵72小時(shí)后即可制得枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC N0. 3242)細(xì)胞發(fā)酵液。取枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC N0. 3242)發(fā)酵液3000rpm離心IOmin得沉淀細(xì)胞，用 等體積去離子水沖洗一遍后繼續(xù)3000rpm離心lOmin，棄上清得沉淀濕菌體。實(shí)施例3 3，6- 二氯-2-氰基吡啶的制備
在50L攪拌釜中，采用水-乙酸乙酯組成的兩相系統(tǒng)作為整個(gè)催化反應(yīng)的介質(zhì)。 將3Kg的3，6_ 二氯-2-氰基吡啶溶解于15L乙酸乙酯中作為催化反應(yīng)的上層有機(jī)相。在 20L去離子水中添加IKg枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)濕菌體做生物催化劑作為反應(yīng) 體系的下層水相。先將5L含有底物的乙酸乙酯有機(jī)相與20L含生物催化劑的水相混合，維 持反應(yīng)系統(tǒng)溫度30°C，150rpm下攪拌開(kāi)始反應(yīng)。之后每隔8h添加5L上述溶解有3，6- 二 氯-2-氰基吡啶的乙酸乙酯溶液，共2次，反應(yīng)30h后即可終止反應(yīng)。將反應(yīng)液放出后靜置3小時(shí)等待分層，分層后將上層有機(jī)相與下層水相分離。向 15L左右的有機(jī)相中用濃氨水2. 5L攪拌洗滌2次后合并到釜中反應(yīng)的下層水相中。合并后 的水相用0. 2um膜過(guò)濾得清液25L。向25L清液中添加0. 5mol/L的鹽酸后攪拌30min，放 置于4°C下冷凍3小時(shí)，等待晶體物析出后于3000rpm下冷凍離心15min得沉淀，真空干燥 后得純度為96. 6%的3，6- 二氯吡啶-2-羧酸2. 95kg，產(chǎn)物收率達(dá)85. 1%.3，6_ 二氯吡啶-2-羧酸采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)參數(shù)如下色譜柱VP_0DS柱， 150mmX4. 6mm I. D ；流動(dòng)相乙腈/水/磷酸(30/70/0. 5)；流速:lmL/min ；柱溫室溫；檢 測(cè)UV 268nm。實(shí)施例4本實(shí)施例僅改變底物的添加量，底物3，6- 二氯-2-氰基吡啶的添加量為1kg，其 他反應(yīng)參數(shù)和操作方法等均與實(shí)施例3保持一致，最終得到純度為95. 3%的3，6- 二氯吡 啶-2-羧酸1. 02kg,產(chǎn)物收率達(dá)87. 1 %。實(shí)施例5本實(shí)施例中參與催化反應(yīng)的生物催化劑以絮凝細(xì)胞液的形式存在，其生物催化劑 的添加量、底物添加量、反應(yīng)參數(shù)和操作方法等均與實(shí)施例3保持一致。絮凝細(xì)胞的制備方法如下將Ikg枯草芽孢桿菌KR2 (CGMCC NO. 3242)濕細(xì)胞與20L去離子水混合均勻，制成 濃度為50g/L的菌懸液，調(diào)pH為6，向20L菌懸液中添加IOg殼聚糖，攪拌均勻后即得絮凝 細(xì)胞液。該20L絮凝細(xì)胞液可作為該催化反應(yīng)中的下層水相部分。本實(shí)施例反應(yīng)結(jié)束后最終得到純度為98. 5%的3，6-二氯吡啶_2_羧酸3. 14kg， 產(chǎn)物收率達(dá)92. 4%。由此可見(jiàn)，該生物催化劑以絮凝細(xì)胞液的形式參與催化反應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的 純度和收率具有改善效果。實(shí)施例6本實(shí)施例僅改變生物催化劑的添加量，將實(shí)施例3中枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)濕菌體的量由Ikg調(diào)整為2. 5kg，其他反應(yīng)參數(shù)和操作方法等均與實(shí)施例3保持 一致，反應(yīng)22小時(shí)后即可得到純度為96. 7%的3，6- 二氯吡啶_2_羧酸3. Ikg,產(chǎn)物收率達(dá) 89. 5%。實(shí)施例7本實(shí)施例僅改變生物催化過(guò)程中的反應(yīng)溫度，將實(shí)施例3中的反應(yīng)溫度由30°C調(diào) 整為15°C，其他反應(yīng)參數(shù)和操作方法等均與實(shí)施例3保持一致，反應(yīng)45小時(shí)后得到純度為 95. 5%的3，6- 二氯吡啶-2-羧酸3. 05kg,產(chǎn)物收率達(dá)87.0%。
權(quán)利要求
一種生物催化生產(chǎn)3，6 二氯吡啶 2 羧酸的方法，其特征在于以產(chǎn)腈水解酶細(xì)胞為生物催化劑，在水 水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相系統(tǒng)中，將底物3，6 二氯 2 氰基吡啶水解為3，6 二氯吡啶 2 羧酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的底物3，6-二氯-2-氰基吡啶在有機(jī) 相中的濃度為0. 1 30%，有機(jī)相的起始添加體積為水相的5 60%，采用分批補(bǔ)加或流 加的形式逐漸提高其體積比，使其最終所占體積比不超過(guò)反應(yīng)液總體積的70%，最終反應(yīng) 液總體積不超過(guò)反應(yīng)容器的75%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的有機(jī)相溶劑選自水不溶性有機(jī)溶劑 正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的水相為pH5 9的去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物催化劑添加到水相中，生物催 化劑添加量為5 25%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的催化劑為具有腈水解酶活性的靜息 游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或絮凝化細(xì)胞液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的催化劑為枯草芽孢桿菌KR2(CGMCC NO. 3242)靜息游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或絮凝化細(xì)胞液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的催化反應(yīng)的攪拌轉(zhuǎn)速為100 300rpm，溫度為15 35°C，反應(yīng)時(shí)間為24 72小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液放出后靜置 分層，分離水相和有機(jī)相，用氨水洗滌有機(jī)相1 3次后靜置分層，有機(jī)相繼續(xù)套用到下批 反應(yīng)系統(tǒng)中，氨水相與反應(yīng)液的初始水相合并，合并后用0. 2 0. 5um膜過(guò)濾，再用濃度為 0. 1 5mol/L的無(wú)機(jī)酸酸化處理至pH3 6，于1 4°C靜置2h以上，等晶體析出后冷凍離 心、干燥即可得純度在95%以上的3，6- 二氯吡啶-2-羧酸晶體。
10.用于權(quán)利要求7的一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) KR2，該細(xì)菌保藏于中 國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No. 3242。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公開(kāi)了一種生物催化生產(chǎn)3，6-二氯吡啶-2-羧酸的方法。該方法以產(chǎn)腈水解酶活性細(xì)胞為生物催化劑，在水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)中，溫度為15～35℃，將底物3，6-二氯-2-氰基吡啶水解為3，6-二氯吡啶-2-羧酸。本發(fā)明將生物催化反應(yīng)與產(chǎn)物分離進(jìn)行耦合，既有效克服了高濃度底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害抑制作用，又實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的有效分離，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/125GK101906447SQ20091026430
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者孔國(guó)平, 徐強(qiáng), 江濤, 蔣劍華, 薛誼 申請(qǐng)人:南京第一農(nóng)藥集團(tuán)有限公司;紅太陽(yáng)集團(tuán)有限公司