專利名稱：提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶化學(xué)領(lǐng)域，涉及固定在無(wú)機(jī)的活性炭、硅膠和有機(jī)的樹脂上用化學(xué)方法提高酶其活性和穩(wěn)定性的技術(shù)；同時(shí)還涉及有機(jī)物的催化酯化和轉(zhuǎn)酯化的技術(shù)。
背景技術(shù)：
脂肪酶通常被用于工業(yè)上在有機(jī)媒介中催化酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。以脂肪酶為催化劑制備生物柴油，反應(yīng)條件溫和、醇用量少、甘油易回收、無(wú)廢物，可以解決目前化學(xué)法生產(chǎn)生物柴油所用催化劑存在的分離難、耗能多的問(wèn)題。酶的固定化技術(shù)解決了脂肪酶在催化反應(yīng)過(guò)程中易結(jié)塊、不易回收、很難重復(fù)利用等問(wèn)題，并且提高了脂肪酶的活性和穩(wěn)定
性[1]。 提高固定化酶在有機(jī)媒介中的催化活性和穩(wěn)定性意義重大。采用某些極性有機(jī)溶劑處理脂肪酶可以明顯提高其催化活性和穩(wěn)定性[2—4]。通過(guò)極性有機(jī)溶劑改變脂肪酶分子的構(gòu)象[5]以及載體對(duì)脂肪酶的吸附狀態(tài)，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，提高酶的催化性能，進(jìn)而提高生物催化劑的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性。
參考文獻(xiàn) [1]蔡志強(qiáng)，楊廣花，趙希岳，等.固定化酶催化高酸廢油脂合成生物柴油的研究.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23(4) :160-162. [2]Min G K， Eun G L， Bung H C. Improved enantioselectivity ofCandidarugosa lipase towards ketoprofen ethyl ester by a simple two—steptreatment. ProcessBiochemistry， 2000(35) :977_982. [3]Michiakim， KojiK， Kazuo K. Enhanced activities of lipase pretreatedwithorganic solvents. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001(76) :1070-1073. [4]Sonia C， Andres R A， Rosa M C， et al. Small water amounts increasethecatelytic behaviour of polar organic solvents pre—treated CMidida rugosalipase. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2001 (11) :939-947.
[5]Chang C S， Hsu C S. Enhancement of enantioselectivity an reactionrate onthe synthesis of(S)-ketoprofen hydroxyalkyl ester in organic solventsviaisopropanol—dried immobilized lipase.Journal of Chemical TechnologyandBiotechnology， 2005(80) :537-544.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提高固定化脂肪酶在有機(jī)媒介中的催化活性和穩(wěn)定性，進(jìn)而提
高生物催化劑的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性。 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是提供一種應(yīng)用有機(jī)化合物處理固定化脂肪酶的方法，采用醇、酮和酯為固定化酶處理劑，將吸附固定的脂肪酶浸泡于處理劑
3中，再對(duì)浸泡的固定化脂肪酶進(jìn)行分離收集和干燥處理，即得催化活性和穩(wěn)定性得以提高的固定化脂肪酶。其方法包括如下步驟 a、脂肪酶液制備取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸緩沖液(0. 05mol/LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化將lg經(jīng)預(yù)處理的固定化載體(預(yù)處理的方法用lmol/LHCl于室溫下浸泡3h，然后水洗至中性)加入30 50ml酶液中，于3(TC、150rpm振蕩吸附2h。
c、固定化脂肪酶的分離和存放過(guò)濾分離得濕固定化酶，于4t:放置24h。
d、有機(jī)溶劑處理在20 50ml極性有機(jī)溶劑中加入lg濕固定化酶，于25 35t:、150rpm振蕩處理1 1. 5h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4"放置24h，測(cè)定酶活力。
所述有機(jī)溶劑為極性有機(jī)溶劑醇、酮、酯。醇以C2 C3醇、酮以C3 C4酮、酯以乙酸的C2 C4酯為好。最佳溶劑醇為丙醇、或異丙醇；酮為丙酮或丁酮；酯為乙酸乙酯
或乙酸異戊酯。 e、大豆油轉(zhuǎn)酯化將22. 5g大豆油、llml正己烷及l(fā)g有機(jī)溶劑處理過(guò)的固定化酶混合，于3(TC預(yù)熱20min，按醇油摩爾比3 : 1 (大豆油的1摩爾質(zhì)量是854，甲醇的摩爾質(zhì)量是46，甲醇的摩爾數(shù)為甲醇質(zhì)量除以甲醇的摩爾質(zhì)量，大豆油的摩爾數(shù)為大豆油的質(zhì)量除以大豆油的摩爾質(zhì)量，醇油摩爾比為甲醇的摩爾數(shù)除以大豆油的摩爾數(shù))平均分3次加入無(wú)水甲醇，于150rpm振蕩反應(yīng)24h 。 f、固定化脂肪酶催化劑回收轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮洗滌固定化脂肪酶催化劑3次，于4。C干燥24 48h，測(cè)定酶活力。 其中，所述的固定化載體為40目活性炭、或硅膠G、或匿-130樹脂，所述的醇為丙
醇、或異丙醇，所述的酮為丙酮、或丁酮、所述的酯為乙酸乙酯、或乙酸異戊酯。 采用本發(fā)明方法，通過(guò)使用極性有機(jī)溶劑浸泡處理吸附固定的脂肪酶LVK-FIOO
一定時(shí)間，即可得到催化活性和穩(wěn)定性得以提高的固定化脂肪酶，其脂肪酶活力是對(duì)照的
1. 5 2. 5倍、半衰期延長(zhǎng)3 8h、催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用3-6批。所得固定化脂
肪酶可用作于油脂的轉(zhuǎn)酯化、合成或水解。 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，其突出優(yōu)點(diǎn)為本方法操作簡(jiǎn)單，能有效提高固定化脂肪酶催
化活性和穩(wěn)定性，具有很高的推廣利用價(jià)值。 以下結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1為應(yīng)用有機(jī)化合物提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 a、脂肪酶液制備取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸緩沖液(0. 05mo1/LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化將lg經(jīng)預(yù)處理的40目活性炭加入30ml酶液中，于3(TC、150rpm振蕩吸附2h。所述預(yù)處理是用lmol/LHCl于室溫下浸泡3h，然后水洗至中性。
c、固定化脂肪酶的分離和存放過(guò)濾分離得濕固定化酶，于4t:放置24h。
d、有機(jī)溶劑處理選擇丙酮為固定化酶處理劑。在30ml丙酮中加入lg濕固定化 酶，于25t:、150rpm振蕩處理lh，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4t:放置24h，測(cè)定酶活力。
e、大豆油轉(zhuǎn)酯化將22. 5g大豆油、llml正己烷及l(fā)g有機(jī)溶劑處理過(guò)的固定化酶 混合，于3(TC預(yù)熱20min，按醇油摩爾比3 : 1平均分3次加入無(wú)水甲醇(每次加無(wú)水甲 醇1. lml)，于150rpm振蕩反應(yīng)24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕櫚酸甲酯4. 27g ;硬脂酸甲酯
1. 86g ;油酸甲酯7. 83g ;亞油酸甲酯4. 18g ;亞麻酸甲酯1. 47g)。 f、固定化脂肪酶催化劑回收轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮洗滌固定化脂肪酶催化 劑3次，于4t:干燥24h，測(cè)定酶活力。所得固定化脂肪酶活力為150u/g，是對(duì)照酶活力的1. 5倍，半衰期延長(zhǎng)6h，催化大 豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用5批次。
實(shí)施例2 a、脂肪酶液制備取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸緩沖液(0. 05mo1/ LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化將lg經(jīng)預(yù)處理的硅膠G加入40ml酶液中，于30°C 、 150rpm振蕩 吸附2h。硅膠G預(yù)處理方法同實(shí)施例1。 c、固定化脂肪酶的分離和存放過(guò)濾分離得濕固定化酶，于4t:放置24h。
d、以乙酸乙酯為固定化酶處理劑，在20ml乙酸乙酯中加入lg濕固定化酶，于 3(TC、150rpm振蕩處理1. 5h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4"放置24h，測(cè)定酶活力。
e、大豆油轉(zhuǎn)酯化將22. 5g大豆油、llml正己烷及l(fā)g有機(jī)溶劑處理過(guò)的固定化酶 混合，于3(TC預(yù)熱20min，按醇油摩爾比3 : 1平均分3次加入無(wú)水甲醇(每次加無(wú)水甲 醇1. lml)，于150rpm振蕩反應(yīng)24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕櫚酸甲酯4. 03g ;硬脂酸甲酯
1. 82g ;油酸甲酯7. 69g ;亞油酸甲酯4. 09g ;亞麻酸甲酯1. 47g)。 f、固定化脂肪酶催化劑回收轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮洗滌固定化脂肪酶催化 劑3次，于4t:干燥24h，測(cè)定酶活力。 所得固定化脂肪酶活力為180u/g，是對(duì)照酶活力的1. 8倍，半衰期延長(zhǎng)8h，催化大 豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用3批次。
實(shí)施例3 a、脂肪酶液制備取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸緩沖液(0. 05mo1/ LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化將lg經(jīng)預(yù)處理的DM-130樹脂加入50ml酶液中，于30°C 、 150rpm 振蕩吸附2h。匿-130樹脂預(yù)處理方法同實(shí)施例1。 c、固定化脂肪酶的分離和存放過(guò)濾分離得濕固定化酶，于4t:放置24h。 d、以丙醇為固定化酶處理劑，在40ml丙醇中加入lg濕固定化酶，于35°C 、 150rpm
振蕩處理1. 5h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4t:放置24h，測(cè)定酶活力。 e、大豆油轉(zhuǎn)酯化將22. 5g大豆油、llml正己烷及l(fā)g有機(jī)溶劑處理過(guò)的固定化酶
混合，于3(TC預(yù)熱20min，按醇油摩爾比3 : 1平均分3次加入無(wú)水甲醇(每次加無(wú)水甲
醇1. lml)，于150rpm振蕩反應(yīng)24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕櫚酸甲酯4. 05g ;硬脂酸甲酯
1. 82g ;油酸甲酯7. 58g ;亞油酸甲酯3. 98g ;亞麻酸甲酯1. 54g)。 f、固定化脂肪酶催化劑回收轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮洗滌固定化脂肪酶催化
5劑3次，于4。C干燥48h，測(cè)定酶活力。 所得固定化脂肪酶活力為170u/g，是對(duì)照酶活力的1. 7倍，半衰期延長(zhǎng)3h，催化大 豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用3批次。
權(quán)利要求
提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的方法，其特征在于包括如下步驟a、脂肪酶液制備取15g酶粉溶于300ml、pH7.0的磷酸緩沖液，制得0.05mg/ml的脂肪酶液；所述pH7.0的磷酸緩沖液組成為0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4；b、脂肪酶固定化將1g經(jīng)預(yù)處理的固定化載體加入30～50ml酶液中，于30℃、150rpm振蕩吸附2h；所述固定化載體為活性炭、或硅膠G、或DM-130樹脂，其預(yù)處理方法為用1mol/LHCl于室溫下浸泡3h，然后水洗至中性；c、固定化脂肪酶的分離和存放過(guò)濾分離得濕固定化酶，于4℃放置24h；d、有機(jī)溶劑處理在20～50ml極性有機(jī)溶劑中加入1g濕固定化酶，于25～35℃、150rpm振蕩處理1～1.5h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4℃放置24h，測(cè)定酶活力；所述有機(jī)溶劑為極性有機(jī)溶劑醇、酮、酯；e、大豆油轉(zhuǎn)酯化將22.5g大豆油、11ml正己烷及1g有機(jī)溶劑處理過(guò)的固定化酶混合，于30℃預(yù)熱20min，按醇油摩爾比3∶1平均分3次加入無(wú)水甲醇，于150rpm振蕩反應(yīng)24h；f、固定化脂肪酶催化劑回收轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮洗滌固定化脂肪酶催化劑3次，于4℃干燥24～48h，測(cè)定酶活力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的方法，其特征在于步驟e的 有機(jī)溶劑處理中所述的醇為C2 C3醇；所述酮為C3 C4酮；所述酯為乙酸的C2 C4酯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的方法，其特征在于步驟 e的有機(jī)溶劑處理中所述的醇為丙醇、或異丙醇；所述的酮為丙酮或丁酮；所述的酯為乙酸 乙酯或乙酸異戊酯。
全文摘要
一種提高固定化脂肪酶活性和穩(wěn)定性的方法。采用能改變脂肪酶分子構(gòu)象以及載體對(duì)脂肪酶的吸附狀態(tài)的極性有機(jī)溶劑為處理劑，對(duì)吸附固定的脂肪酶浸泡適當(dāng)時(shí)間而成；所述的固定化載體選取40目活性炭、或硅膠G、或DM-130樹脂，所述的有機(jī)化合物選取醇、酮、酯中的一種為固定化酶處理劑。將吸附固定的脂肪酶浸泡于有機(jī)化合物處理劑中，再對(duì)浸泡的固定化脂肪酶進(jìn)行分離收集和干燥處理，即得催化活性和穩(wěn)定性得以提高的固定化脂肪酶。所得處理的固定化脂肪酶可用作于油脂的轉(zhuǎn)酯化、合成或水解，其酶活力為對(duì)照的1.5～2.5倍、半衰期延長(zhǎng)3～8h、催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用3-6批。改善了固定化酶的使用性能。
文檔編號(hào)C12N11/14GK101736000SQ200910249000
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者孫玉梅, 杜凱 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)