一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物及其制備方法

專利名稱：：一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及轉(zhuǎn)基因作物檢測中必須的對照物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，具體說是一種制備轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因特異性片段標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的方法。背景材料轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品越來越進(jìn)入人們的生活。2006年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積為10200萬公頃，與2005年轉(zhuǎn)基因作物9000萬公頃相比增長了13%，從1996年到2006年十年間轉(zhuǎn)基因作物總的種植面積增加了60倍。目前，世界各國已進(jìn)行田間試驗的轉(zhuǎn)基因作物超過5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等。我國轉(zhuǎn)基因生物研究始于20世紀(jì)80年代初期，主要是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。近年來，政府不斷加大對生物技術(shù)研究的支持力度，積極促進(jìn)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。轉(zhuǎn)基因作物安全性主要集中在轉(zhuǎn)基因作物釋放的環(huán)境安全性和由轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)出的食品的安全性上。包括對人和動物健康的風(fēng)險、對生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)的風(fēng)險、對非目標(biāo)生物的風(fēng)險。針對第一種風(fēng)險，1993年，聯(lián)合國經(jīng)濟發(fā)展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評估的"實質(zhì)等同性"原則。如果轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。最早提出對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個法案，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識的最低限量降低到0.9%。日本、澳大利亞、新西蘭對轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從1_5%不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標(biāo)識和進(jìn)口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。轉(zhuǎn)基因作物檢測方法主要基于核酸水平的PCR檢測和基于蛋白質(zhì)水平的檢測。核酸水平檢測分為定性和定量檢測，蛋白質(zhì)水平檢測包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫試紙條法等。目前最常用的檢測方法是定性PCR檢測。通過對樣品中可能含有的外源基因進(jìn)行擴增，再利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。如果電泳結(jié)果含有特異條帶，說明樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分；反之則沒有。在進(jìn)行定性PCR檢測時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，以確保檢測過程的有效性和檢測結(jié)果的可靠性。陰性對照是指用非轉(zhuǎn)基因作物中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；陽性對照是指用特定的轉(zhuǎn)基因作物中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；空白對照指用無菌重蒸水作為PCR反應(yīng)體系的模板。由于轉(zhuǎn)基因作物存在生物安全性的問題，所以有些轉(zhuǎn)基因作物的陽性樣品是很難得到的。為了滿足檢驗檢疫工作需要，歐盟委員會直屬的聯(lián)合研究中心(JRC)下屬的兩個研究所——健康及消費者保護(hù)研究所(IHCP)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及計量研究所(IRMM)在聯(lián)合研制轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，目前只制備出幾種轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括轉(zhuǎn)基因大豆RoundReadySoybean、轉(zhuǎn)基因玉米btll，btl76，mon810，event1507、轉(zhuǎn)基因棉花event281-24_236x3006-210-23和轉(zhuǎn)基因甜菜eventH7-l，含量分別為0%、0.1%、0.5%、1%、2%和5%。而全世界已有近百種商品化轉(zhuǎn)基因品種，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與快速增長的轉(zhuǎn)基因作物相比，根本無法滿足檢測的需要。綜上所述，種類少、不易獲得是轉(zhuǎn)基因陽性材料存在的重要問題，嚴(yán)重影響著轉(zhuǎn)基因檢測工作的進(jìn)行。由于各種限制，國內(nèi)的檢驗檢疫機構(gòu)很難獲得陽性樣品，而且國際上有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的價格也一直居高不下，這些都成為了實際檢側(cè)工作中很重要的制約因素。為了解決這個問題，國內(nèi)各科研單位也做了大量研究工作，但是都不能避開轉(zhuǎn)基因生物的基因漂移的問題。目前，以質(zhì)粒作為陽性對照在國際轉(zhuǎn)基因檢測中的得到公認(rèn)。例如在英國FAPAS分析實驗室能力驗證測試中心組織的國際能力驗證(轉(zhuǎn)基因檢測)中，網(wǎng)站的提交信息選項中明確表示質(zhì)粒可以作為陽性材料使用。在國際期刊上發(fā)表的文章中，很多陽性對照也使用質(zhì)粒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過PCR方法擴增得到轉(zhuǎn)基因作物外源基因的特異性片段，經(jīng)重疊PCR將外源基因的特異性片段拼接在一起，經(jīng)過克隆、建立文庫，那么就可以將插入這些特異性片段的質(zhì)粒作為檢測過程中的陽性對照。這樣就為解決陽性樣品缺乏問題提供一條有效途徑，有效地保障檢測工作的進(jìn)行。而且，以建立文庫的方式獲得陽性材料，容易保存、擴繁。本發(fā)明一個目的在于提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物。本發(fā)明另一個目的在于提供一套用于制備轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物引物。本發(fā)明再一個目的在于提供一種篩選制備標(biāo)準(zhǔn)分子特異性引物的方法。本發(fā)明還一個目的在于提供一種用于制備轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的方法。即設(shè)計特異性引物制備轉(zhuǎn)基因玉米Mon810、Mon863、BTll、BT176中外源基因特異性片段標(biāo)準(zhǔn)分子對照物。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案—種轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物，包括轉(zhuǎn)基因品系M0N810、M0N863、BTll、BT176轉(zhuǎn)化事件特異性序列及內(nèi)源基因zSSIIb特異片段，其先后順序為zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標(biāo)準(zhǔn)分子的特異性引物序列如下引物名稱引物序列(5'-3')長度bpTm。CGC%MaiZss-ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATG2158.957.1MaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGG1958.557.9Mai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA1961.457.9Mai810-o4TGAGTGCGCAAGCAAATTCGG2162.752.4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明設(shè)計用于制備轉(zhuǎn)基因玉米對照物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子引物的方法以將zSSIIb及轉(zhuǎn)化事件特異性序列特異性引物為基礎(chǔ)，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上轉(zhuǎn)化事件特異性正向引物的反向互補序列；在轉(zhuǎn)化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；在引物設(shè)計軟件primerprimer5.0中調(diào)節(jié)引物Tm值在55-60之間。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化事件特異性引物序列指的是農(nóng)業(yè)部發(fā)布的轉(zhuǎn)基因作物檢測標(biāo)準(zhǔn)中的引物序列情況，詳細(xì)內(nèi)容見附件1。本發(fā)明進(jìn)一步公開了用于制備轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的PCR反應(yīng)條件，其特征在于第一輪反應(yīng)以非轉(zhuǎn)基因玉米及轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPzssb—"PP腦。—"PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PPzssIIb—pPP誦—pPPM863—i、PPB11—i、PP罷—!為模板，以權(quán)力說明書2中對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPzssb—2、PP腦?！?、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5yL，用ddH20補足至25i！L。其中PP腦?！?與PP腦—2相連接，PPB11—2與PP罷—2相連接。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為Mega810+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物Mega810+863和Megal1+176為模板，引物分別為Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPM81。+M863、PPB11+B176。第四輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPM81。+M863+B11+B176。第五輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物PPzssub—2及第四輪產(chǎn)物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25yL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六輪反應(yīng)以第五輪產(chǎn)物為模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176_010擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用(1朋20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4T短期保存。產(chǎn)物記為TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176?；厥占兓诹啴a(chǎn)物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗方法做以詳細(xì)的說明。1、原理本方法采用兩步PCR擴增法將轉(zhuǎn)基因玉米中特異片段逐步連接起來，獲得含有zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176的轉(zhuǎn)基因玉米檢測中需要的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物質(zhì)。將該標(biāo)準(zhǔn)分子通過常規(guī)的方法采用T-easy載體導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，即可長期保存使用。2、引物設(shè)計本引物設(shè)計依據(jù)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因玉米檢測標(biāo)準(zhǔn)中涉及的zSSIIb、M0N810、M0N863、BT11、BT176等引物序列，以將zSSIIb及轉(zhuǎn)化事件M0N810特異性引物為基礎(chǔ)，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上M0N810正向引物的反向互補序列；在轉(zhuǎn)化事件M0N810反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；在引物設(shè)計軟件primerprimer5.0中調(diào)節(jié)引物Tm值在55-60之間。用上述方法設(shè)計出一套用于制備zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176標(biāo)準(zhǔn)分子的引物。表l引物序列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、制備方法第一輪反應(yīng)以非轉(zhuǎn)基因玉米及轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPzssb—"PP腦?！?PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PP^hh、PP誦fPP鵬h、PPb1h、PP罷4為模板，以權(quán)力說明書2中對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPzssb—2、PP腦?！?、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5yL，用ddH20補足至25i！L。其中PP腦?！?與PP腦—2相連接，PPB11—2與PP罷—2相連接。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為Mega810+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物Mega810+863和Megal1+176為模板，引物分別為Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPM81。+M863、PPB11+B176。第四輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPM81。+M863+B11+B176。第五輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物PPzssub—2及第四輪產(chǎn)物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25yL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六輪反應(yīng)以第五輪產(chǎn)物為模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176-ol0擴增；回收純化第六輪產(chǎn)物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可。其方法參本發(fā)明公開的有效制備轉(zhuǎn)基因作物檢測標(biāo)準(zhǔn)分子對照物zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176方法所具有的特點在于(1)方便檢測需要將4種轉(zhuǎn)基因玉米品系的外源基因特異性片段連在一起，在檢測過程中無需提取多種陽性基因組DNA作為陽性對照。(2)易傳代將該標(biāo)準(zhǔn)分子導(dǎo)入大腸桿菌，易保藏、傳代。(3)易加入新的外源片段如有新的轉(zhuǎn)基因材料出現(xiàn)，可在原標(biāo)準(zhǔn)分子的基礎(chǔ)上加入新的外源片段，滿足日益增多的轉(zhuǎn)基因作物材料的檢測需要。(4)降低生物安全等級，風(fēng)險可控標(biāo)準(zhǔn)分子只含有檢測標(biāo)準(zhǔn)中需要的特異片段，不能表達(dá)，且大腸桿菌易滅活。產(chǎn)物記為TP:zssIIb+M810+M863+Bll+B176。圖1為PCR產(chǎn)物用2X瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓，30min圖。圖中M為DL2000D應(yīng)Eirker;其中1-6為zSSIIb引物擴增結(jié)果1為空白對照，2為陰性對照，3為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，4為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，5為樣品重復(fù)1，6為樣品重復(fù)2;7-12為BT11引物擴增結(jié)果7為空白對照，8為陰性對照，9為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，10為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，11為樣品重復(fù)1，12為樣品重復(fù)2;13-18為BT176引物擴增結(jié)果13為空白對照，14為陰性對照，15為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，16為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，17為樣品重復(fù)1，18為樣品重復(fù)2;19-24為M0N810引物擴增結(jié)果19為空白對照，20為陰性對照，21為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，22為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，23為樣品重復(fù)1，24為樣品重復(fù)2;25-30為M0N863引物擴增結(jié)果25為空白對照，26為陰性對照，27為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，28為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，29為樣品重復(fù)1，30為樣品重復(fù)2.結(jié)果顯示樣品中含有轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同時驗證了本專利制備的標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照物能有效地代替轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照。具體實施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的制備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中試驗中所采用的原料及試劑均有市售。實施例1:M0N810+M0N863標(biāo)準(zhǔn)分子制備過程材料轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810和M0N863基因組DNA(50ng/iiL);試劑pfUmix緩沖液(2倍);Taqmix緩沖液(2倍)；引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養(yǎng)箱<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>方法第一輪反應(yīng)以轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、M0N863基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。產(chǎn)物記為PP誦—"PPM863—10第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PP,?！猵PPM863—工為模板，以上表中對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩沖液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產(chǎn)物記為PPM81?！?、PPM863—2。第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5yL，用ddH20補足至25iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為Mega81。+863;第二步以第一步反應(yīng)產(chǎn)物Mega8闊63為模板，引物分別為Mai810_o3和Mai863-o6各1iiL;力口2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPM81。+M863。第四輪反應(yīng)以第三輪產(chǎn)物為模板liiL，用Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72t:，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為TPM81。+M863?；厥占兓谒妮啴a(chǎn)物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可。實施例2:Btll+btl76標(biāo)準(zhǔn)分子制備過程材料轉(zhuǎn)基因玉米品系Btll和Btl76基因組DNA(50ng/iiL);試劑:pfUmix緩沖液(2倍);Taqmix緩沖液(2倍)；引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養(yǎng)箱引物名稱引物序列(5'-3')Maill-o7AAAGATGGTAGCGGAACCCCMaiII-08CGTGCTTTGCAAGAAATGGTCMai176-o9CCATTTCTTGTGAAGCACGGTCMail76-ol0TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG方法第一輪反應(yīng)以轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、BT176基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50L，其中2倍pfUmix緩沖液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為PPB11—"PP罷—10第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PPBn—pPPB176—工為模板，以上表中對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩沖液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5yL，用ddH20補足至25iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為Mega11+176;第二步以第一步反應(yīng)產(chǎn)物Mega^76為模板，引物分別為Mai11-o7和Mai176-ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPB11+B176。第四輪反應(yīng)以第三輪產(chǎn)物為模板lyL，用Maill-o7和Mai176_ol0各1yL擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為TPB11+B176?；厥占兓谒妮啴a(chǎn)物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可。實施例3:ZssIIb+M0N810+M0N863標(biāo)準(zhǔn)分子制備過程材料非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA(50ng/yL)，PCR產(chǎn)物PPM81。+M863;試劑:pfUmix緩沖液(2倍);Taqmix緩沖液(2倍);引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養(yǎng)箱引物名稱引物序列(5'-3')MaiZss—ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATGMaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGGMai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>方法第一輪反應(yīng)以非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各O.5yL，模板(50ng/iiL)1iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72。C，5min;4"C短期保存。產(chǎn)物記為PPZSSIIb—10第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PP^nb—!為模板，以ol-o6對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩沖液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72°C，5min;4"短期保存。產(chǎn)物記為PPZSSIIb—2。第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物及PPM81。+M863各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5yL，用(1(11120補足至25iiL。反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為Megazssiib+810+863，第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物分別為MaiZss-o和Mai863_o6各1yL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPZssiib+81。+863。第四輪反應(yīng)以第三輪產(chǎn)物lyL為模板，用引物MaiZss-ol和Mai176-o8擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用(1朋20補足至50iiL。反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，2min);72°C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為TPzssiib+M8io+M863?；厥占兓?K輪廣物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可。實施例4對照比較材料轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、M0N863、Bt11和Btl76基因組DNA(50ng/iiL)，本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物，待測樣品基因組DNA(50ng/yL);試劑:Taqmix緩沖液(2倍);引物(10mM，見表);儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養(yǎng)箱方法1轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物DNA快速提取無菌條件下，挑去已導(dǎo)入zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標(biāo)準(zhǔn)分子的JM109大腸桿菌一環(huán)，與100iiLPCR小管中，100。C煮沸8min。冰上2min備用。2PCR擴增檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米M0N810、M0N863、BT11、BT176:設(shè)置空白對照、陰性對照、轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照、樣品重復(fù)l、樣品重復(fù)2。使用檢測標(biāo)準(zhǔn)中品系特異性引物依次對樣品中的內(nèi)源基因zSSIIb及外源基因M0N810、M0N863、BT11、BT176進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，DNA模板1iiL，空白對照用水代替，用ddH20補足至50yL。反應(yīng)程序為95。C，3min;35個循環(huán)(94°C，30sec;50°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓，30min。結(jié)果見下圖1。其中1-6為zSSIIb引物擴增結(jié)果1為空白對照，2為陰性對照，3為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，4為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，5為樣品重復(fù)1，6為樣品重復(fù)2;7-12為BT11引物擴增結(jié)果7為空白對照，8為陰性對照，9為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，10為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，11為樣品重復(fù)1，12為樣品重復(fù)2;13-18為BT176引物擴增結(jié)果13為空白對照，14為陰性對照，15為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，16為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，17為樣品重復(fù)1，18為樣品重復(fù)2;19-24為M0N810引物擴增結(jié)果19為空白對照，20為陰性對照，21為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，22為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，23為樣品重復(fù)1，24為樣品重復(fù)2;25-30為M0N863引物擴增結(jié)果25為空白對照，26為陰性對照，27為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照，28為標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照，29為樣品重復(fù)1，30為樣品重復(fù)2.結(jié)果顯示樣品中含有轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同時驗證了本專利制備的標(biāo)準(zhǔn)分子陽性對照物能有效地代替轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA陽性對照。附件1:轉(zhuǎn)基因玉米檢測標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)化事件特異性引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>:0158]附件2:PCR產(chǎn)物回收后連接T-easy載體及導(dǎo)入JM109大腸桿菌方法，參見:0159]http:/7www.promega.com.cn/techserv/ctbs/pGEM—T.pdf。:0160]序列表:0161]<110>天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實驗室:0162]〈120〉一種牛羊源成分的快速檢測方法:0163]〈160>10:0164]〈210>1:0165]〈2U〉21bp:0166]〈212〉DNA:0167]〈213〉人工序列:0168]〈400>1:0169]cggtggatgctaaggctgatg21:0170]〈210>2:0171]〈2H〉19bp:0172]〈212>DNA:0173]〈213>人工序列:0174]〈400〉2:0175]cacacttgaaagggccagg19:0176]〈210>3:0177]〈2H〉19bp:0178]〈212>DNA:0179]〈213>人工序列:0180]〈400>3:0181]gccctttcaagtgtgccca19:0182]〈210>4:0183]<211>21bp:0184]〈212>DNA:0185]〈213>人工序列:0186]〈400>4:0187]tgagtgcgcaagcaaattcgg21:0188]〈210〉5:0189]〈211〉21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ttgcttgcgcactcaaagacc〈210>6〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ggttccgctaccatctttggg〈210>7〈211>20bp<212>DNA〈213〉人工序列〈400>7aaagatggtegcggaacccc〈210>8〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8cgtgctttgcaagaaatggtc〈210>9〈211>22bp〈212>DNA<213>人工序列〈400>9ccatttcttgtgaagcacggtc〈210>10[0219:<211>23bp[0220:〈212>DNA[0221:〈213〉人工序列[0222:〈400>10[0223:tcgactttataggaagggagagg說明書13/13頁20221權(quán)利要求一種用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物，包括轉(zhuǎn)基因品系MON810、MON863、BT11、BT176轉(zhuǎn)化事件特異性序列及內(nèi)源基因zSSIIb特異片段，其先后順序為zSSIIb+MON810+MON863+BT11+BT176。2.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標(biāo)準(zhǔn)分子的引物序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>3.—種用于篩選權(quán)利要求2所述引物的方法其特征在于以將zSSIIb及轉(zhuǎn)化事件特異性序列特異性引物為基礎(chǔ)，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上轉(zhuǎn)化事件特異性正向引物的反向互補序列；在轉(zhuǎn)化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；以連接處為中心，刪減兩端序列，使引物長度在18-28bp之間，Tm值在55-60之間。C。4.一種用于制備權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)分子對照物的PCR反應(yīng)方法，其特征在于第一輪反應(yīng)以非轉(zhuǎn)基因玉米及轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標(biāo)準(zhǔn)中引物序列擴增；反應(yīng)體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng/yL)1yL，用ddH20補足至50yL;反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產(chǎn)物記為PPZSSIIb-"PP腦。-"PPM863-"PPB11-"PP罷-!;第二輪反應(yīng)以第一輪PCR擴增產(chǎn)物PP^nb—pPP誦—pPP腦—pPP,pPP罷—!為模板，以ol-olO中對應(yīng)引物，進(jìn)行PCR擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩沖液`25iiL，上下游引物(10mM)各O.5yL，用ddH20補足至50yL;反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產(chǎn)物記為PPZSSIIb—2、PP腦?！?、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2;第三輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25i！L;其中PP腦?！?與PP腦—2相連接，PPB11—2與PPB176—2相連接;反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"短期保存；產(chǎn)物記為Mega81。+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物Mega810+863和Megall+176為模板，引物分別為Mai810-o3禾PMai863_o6各1iiL，Mai11-o7和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL;反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存；產(chǎn)物記為PPm810+m863、PPb11+B176;第四輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物PPm8io+m863、PPbii+bi76各5iiL，2倍pfUmix緩沖液7.5ilL，用ddH20補足至25iiL;反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；產(chǎn)物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應(yīng)產(chǎn)物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL;反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產(chǎn)物記為PPM810+M863+B11+B176，第五輪反應(yīng)，分兩步進(jìn)行擴增第一步取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物PPzssllb-2及第四輪產(chǎn)物PPM810+M863+B11+B176^S"5ilL，2f昔pfUmix緩沖液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL;反應(yīng)程序95。C，3min;10個循環(huán)(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;fC短期保存；產(chǎn)物記為MegazssIIb+810+863+ll+176，第二步以第一步反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix緩沖液12.5iiL，用ddH20補足至50yL;反應(yīng)程序95。C，3min;20個循環(huán)(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；產(chǎn)物記為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>，第六輪反應(yīng)以第五輪產(chǎn)物為模板L，用引物MaiZss-ol和Mai176_ol0擴增；反應(yīng)體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩沖液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用ddH20補足至50iiL;反應(yīng)程序為95。C，3min;30個循環(huán)(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產(chǎn)物記為TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176;回收純化第六輪產(chǎn)物，連接于T-easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可長期保存使用。全文摘要本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因作物檢測中必要的標(biāo)準(zhǔn)分子對照物及其制備方法。設(shè)計特異性引物制備含有玉米內(nèi)源基因ZssIIB特異片段及轉(zhuǎn)基因玉米品系Mon810、Mon863、BT11、BT176中外源基因特異片段標(biāo)準(zhǔn)分子對照物質(zhì)。本發(fā)明將4種轉(zhuǎn)基因玉米品系的外源基因特異性片段連在一起，在檢測過程中無需提取多種陽性基因組DNA作為陽性對照。將該標(biāo)準(zhǔn)分子導(dǎo)入大腸桿菌，易保藏、傳代。如有新的轉(zhuǎn)基因材料出現(xiàn)，可在原標(biāo)準(zhǔn)分子的基礎(chǔ)上加入新的外源片段，滿足日益增多的轉(zhuǎn)基因作物材料的檢測需要。文檔編號C12N15/10GK101724702SQ20091024503公開日2010年6月9日申請日期2009年12月23日優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日發(fā)明者蘭青闊,朱珠,王永,程奕,趙新申請人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實驗室