專利名稱：：高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠及制備方法和應(yīng)用，具體為一種N-異丙基丙烯酰胺-2-乙烯基_4，-二氨基-1，3，5-三嗪共聚物(PNIPAAm-co-PVDT)水凝膠的制備方法和應(yīng)用，具有表面介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染和脫附細(xì)胞功能的高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠。
背景技術(shù)：
：水凝膠是以水為分散介質(zhì)，親水性而又不溶于水的且能夠吸收大量水分(通常含水量大于總質(zhì)量的50%)具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子聚合物材料。因?yàn)榫酆衔镦滈g的物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)作用而不會(huì)溶解于水中，只能溶脹且保持一定的形狀，同時(shí)，還具有良好的水滲透性，生物相容性，作為人體植入物可以減少不良反應(yīng)。因而水凝膠作為優(yōu)良的生物醫(yī)用材料得到廣泛應(yīng)用。但是，其高含水量導(dǎo)致水凝膠較差的機(jī)械性能限制了其作為生物材料尤其是力學(xué)器件的應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道典型水凝膠的斷裂能在lO—LlOOJ/m2。人體中的一些軟組織(如肌腱、韌帶、半月板軟骨等)也是由凝膠物質(zhì)構(gòu)成的，此類組織具有柔軟、堅(jiān)韌、抗沖擊等優(yōu)良特點(diǎn)。如果能制備出與人體軟組織力學(xué)性能接近且具有良好生物相容性和轉(zhuǎn)基因功效的軟組織類似物，將是一種更好的選擇。為了解決水凝膠較差的力學(xué)性能這一問(wèn)題，近期科學(xué)家們研制了以下幾種高強(qiáng)度水凝膠雙網(wǎng)絡(luò)(DN)水凝膠，插層無(wú)機(jī)納米復(fù)合水凝膠(NC)和高分子微球復(fù)合水凝膠(MMC)。但是這些高強(qiáng)度水凝膠不兼具高的抗拉伸和抗壓縮功能(YoshimiTanaka,JainPingGong,YoshihitoOsada.Novelhydrogelswithexcellentmechanicalperformance.Prog.Polym.Sci.2005；30:1_9.)。同時(shí)，這些高強(qiáng)度水凝膠缺乏對(duì)DNA的吸附能力和對(duì)細(xì)胞的貼附及脫貼附能力。聚2-乙烯基-4，6-二氨基1，3，5_三嗪(PVDT)可在水中有效識(shí)別核酸堿基及其衍生物VDT單體可與尿嘧啶和胸腺嘧啶形成三氫鍵作用，與腺嘌呤形成二氫鍵，與鳥嘌呤形成單氫鍵作用(HiroyukiAsanuma，TakeshiBan,SumieGotoh，TakayukiHishiya,MakotoKomiyama.Hydrogenbondinginwaterbypoly(vinyldiaminotriazine)forthemoIecularrecognitionofnucleicacidbasesandtheirderivatives.Macromolecules1998；31:371_377.)。用VDT制備的聚合物可以增大水中的非極性微環(huán)境，有利于氫鍵的形成。DNA堿基中富含氫鍵供體和受體，可有效的通過(guò)氫鍵作用識(shí)別并作用于目標(biāo)分子。已有文獻(xiàn)報(bào)道PVDT能夠與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物有效的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(ZhiqiangCao,WenguangLiu,DongchunLiang,GangGuo,JingyuZhang.Designofpoly(vinyldiaminotriazine)-basednonviralvectorsviaspecifichydrogenbondingwithnucleicacidbasepairs.Adv.Funct.Mater.2007；17246-252.)區(qū)別于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法(DNA被壓縮成納米粒子后加入到培基中與細(xì)胞接觸)，反相轉(zhuǎn)染(reversetransfection)方法能夠固定DNA于固體材料的表層，這樣將增大細(xì)胞與DNA接觸的機(jī)會(huì)，提高轉(zhuǎn)染效率。并且不依賴于轉(zhuǎn)染試劑，可以降低轉(zhuǎn)染試劑所帶來(lái)的毒性。PVDT光引發(fā)聚合后的水凝膠，表面氫鍵作用可有效的吸附DNA，本體的強(qiáng)氫鍵作用使得水凝膠的拉伸和壓縮性能得到顯著的改善。溫度響應(yīng)性水凝膠一般具有一定比例的親水和疏水基團(tuán)，聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)鏈段在其低臨界溶解溫度(LCST在32_34°C)以下呈現(xiàn)親水性，高分子鏈段呈無(wú)規(guī)線團(tuán)狀；溫度高于LCST時(shí)，PNIPAAm鏈段呈疏水性密實(shí)的小球。溫度的變化影響這些基團(tuán)的疏水作用和大分子鏈間的氫鍵作用，從而改變水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生體積相變。1990年Okano等(NorikoYamada,TeruoOkano,HideakiSakai,FumikoKarikusa,YoshioSawasaki，YasuhisaSakurai.Thermo-responsivepolymericsurfaces；controlofattachmentanddetachmentofculturedcells.Macromo1.RapidCommun.1990；11571-576.)利用PNIPAAm對(duì)溫度的刺激響應(yīng)性這一特征，設(shè)計(jì)了通過(guò)溫度調(diào)節(jié)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞貼附和脫貼附的行為。當(dāng)溫度升高(37°C)時(shí)疏水相互作用增強(qiáng)，表面呈疏水狀態(tài)適合細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，當(dāng)溫度降低時(shí)(在LCST之下)分子鏈段間氫鍵解離，表面呈親水狀態(tài)，細(xì)胞從表面脫離。這種溫度調(diào)控細(xì)胞脫附的方法避免了傳統(tǒng)酶消化法對(duì)細(xì)胞表面造成的損害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高強(qiáng)度溫度敏感PNIPAAm-C0-PVDT水凝膠及制備方法和應(yīng)用。該溫度敏感性水凝膠具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，具有良好的生物相容性和光學(xué)性能。并且該水凝膠表面具有吸附DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力以及通過(guò)溫度調(diào)節(jié)細(xì)胞的貼附和脫貼附行為。本發(fā)明提供的一種高強(qiáng)度溫度敏感PNIPAAm-C0-PVDT水凝膠是以2_乙烯基_4，6_二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺為原料，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，單體2-乙烯基-4，-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量比為0.2-21，具體步驟室溫下，單體N-異丙基丙烯酰胺、2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯和光引發(fā)劑Irgacure2959于二甲基亞砜中混勻后澆注到透明密閉模具中紫外光照射進(jìn)行自由基聚合，反應(yīng)產(chǎn)物凝膠用水沖洗、浸泡。所述的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的分子量是575。所述的聚乙二醇二丙烯酸酯與2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量的和的比為0.6-0.7:1。本發(fā)明提供的高強(qiáng)度溫度敏感PNIPAAm-C0-PVDT水凝膠的制備方法包括的步驟1)室溫下，在二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，加入單體N-異丙基丙烯酰胺、2-乙烯基-4，_二氨基-1，3，5-三嗪、交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯和光引發(fā)劑Irgacure2959，混勻后加入透明密閉模具中(澆注)。2)在紫外光照條件下照射20分鐘進(jìn)行自由基聚合，制得聚N-異丙基丙烯酰胺-共聚-聚2-乙烯基-4，-二氨基-1，3，5-三嗪水凝膠。3)從模具中取出凝膠，用水沖洗去除未反應(yīng)的單體和溶劑，浸泡7天，每隔12h更換一次水，達(dá)到溶脹平衡。本發(fā)明提供的高強(qiáng)度溫度敏感PNIPAAm-C0-PVDT水凝膠可用于轉(zhuǎn)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)于DNA運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控。其中轉(zhuǎn)染步驟是將上述凝膠浸入醫(yī)用酒精后，在紫外燈下照射20分鐘滅菌，放入48孔板中加入500μ1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將一定濃度的質(zhì)粒(PGL3)DNA溶液加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500μ1DMEM洗每孔的凝膠一次。將C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性。細(xì)胞脫附率測(cè)定的步驟是將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后放入20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率。本發(fā)明提供了高強(qiáng)度溫度敏感型PNIPAAm-C0-PVDT水凝膠。該高強(qiáng)度溫度敏感型水凝膠具有轉(zhuǎn)基因的能力并能實(shí)現(xiàn)在沒有酶的情況下通過(guò)溫度調(diào)控細(xì)胞的脫附行為。制備方法簡(jiǎn)單，合成條件溫和。PVDT自身形成的氫鍵作用使得凝膠本體的力學(xué)性能得到很大的改善，且凝膠表面的PVDT能夠有效地和DNA中的堿基對(duì)形成氫鍵有助于對(duì)DNA的吸附，實(shí)現(xiàn)反相介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染修飾細(xì)胞的目的。此外，PNIPAAm賦予了這種高強(qiáng)度水凝膠溫度響應(yīng)性的能力。這種表面氫鍵吸附DNA的高強(qiáng)度水凝膠可承受較高的載荷，有望直接移植到體內(nèi)，通過(guò)原位釋放基因治療軟組織疾??；另一方面，高力學(xué)強(qiáng)度可避免體外變溫脫附細(xì)胞操作時(shí)的損傷，因而可反復(fù)使用，成為無(wú)損傷脫細(xì)胞的平臺(tái)，可為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供基因修飾的種子細(xì)胞。總之，本發(fā)明的水凝膠具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，具有良好的生物相容性和光學(xué)性能。并且該水凝膠表面具有吸附DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力以及通過(guò)溫度調(diào)節(jié)細(xì)胞的貼附和脫貼附行為。其制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易于長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸。圖1是熒光素酶活性柱狀圖。圖2是實(shí)施例PNV1-2的相差顯微鏡圖，A)37°C時(shí)PNV1-2貼壁生長(zhǎng)；B)20°C時(shí)PNV1-2凝膠脫附。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將單體N-異丙基丙烯酰胺(8mg)，2_乙烯基-4，6_二氨基-1，3，5_三嗪(4mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg，分子量575，以下同)加入到1.5ml離心管中，用200μ1的DMSO溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg，1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2',2'-二甲基乙酮)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV2-1。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500μm。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中，加入500μ1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)后，將2μg質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500μ1DMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為20379。將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，將凝膠放入新的孔板中，置于20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為78.8%。(細(xì)胞的脫附率定義為脫附的細(xì)胞/(脫附的細(xì)胞+殘留在凝膠上的細(xì)胞)X100%)。實(shí)施例2將單體N-N-異丙基丙烯酰胺(7.2mg)，2_乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5_三嗪(4.8mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV3-2。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中加入500u1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將2iig質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500iaDMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為139645。將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，將凝膠放入新的孔板中，置于20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為76.2%。實(shí)施例3將單體N-異丙基丙烯酰胺(6mg)，2_乙烯基-4，6_二氨基-1，3，5_三嗪(6mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次，并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV1-1。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中加入500u1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將2iig質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500iaDMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中熒光素酶活性為176829。將述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，將凝膠放入新的孔板中，置于20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為74.6%。實(shí)施例4將單體N-異丙基丙烯酰胺(4mg)，2_乙烯基-4，6_二氨基-1，3，5_三嗪(8mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV1-2。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中加入500u1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將2iig質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500iaDMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為388996。將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，將凝膠放入新的孔板中，置于20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為71.1%。實(shí)施例5將單體N-異丙基丙烯酰胺(3mg)，2_乙烯基-4，6_二氨基-1，3，5_三嗪(9mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV1-3。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。實(shí)施例6將單體N-異丙基丙烯酰胺(2mg)，2-乙烯基_4，6_二氨基-1，3，5_三嗪(10mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和弓|發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為PNV1-5。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。對(duì)比例1將單體N-異丙基丙烯酰胺(12mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200ill的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為cr-PNIPAAm。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500ym。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中加入500u1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將2iig質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500iaDMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后變溫脫附細(xì)胞，裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為4087。將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)1小時(shí)達(dá)到疏水平衡，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)后，將凝膠放入新的孔板中，置于20°C烘箱培養(yǎng)1小時(shí)使凝膠達(dá)到親水平衡狀態(tài)，細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為78.8%。對(duì)比例2:將單體2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(12mg)和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯(8mg)加入到1.5ml離心管中，用200yl的DMS0溶解單體和交聯(lián)劑后，加入光引發(fā)劑Irgacure2959(0.4mg)。將含有單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑的溶劑注入密閉模具中，模具在紫外固化箱中照射20min，以引發(fā)自由基聚合。隨后打開模具取出凝膠，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次并浸泡7天，每隔12h更換上述去離子水。按相同步驟制備凝膠片狀物，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能和細(xì)胞試驗(yàn)。此凝膠樣品命名為cr-PVDT。其中進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測(cè)試的樣品的尺寸為20mmX2mm，厚為500iim。壓縮力學(xué)性能測(cè)試的樣品尺寸為直徑10mm，高8mm的圓柱。將得到的凝膠浸入醫(yī)用酒精在紫外燈下照射20分鐘滅菌后放入48孔板中加入500u1DMEM培養(yǎng)基置換醫(yī)用酒精。凝膠浸入DMEM培養(yǎng)基24小時(shí)候后，將2iig質(zhì)粒(pGL3)DNA加入到有凝膠的孔板中。20°C吸附23小時(shí)，37°C1小時(shí)后，用500iaDMEM洗每孔的凝膠一次。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的C0S-7細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)吸附了DNA的凝膠中，培養(yǎng)24小時(shí)后，換培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。之后裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為248186。將上述浸入在DMEM培養(yǎng)基中的凝膠放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，加細(xì)胞懸液到有凝膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)。因?yàn)閂DT含量的增大，凝膠的疏水性增加，用移液器吹打即可使細(xì)胞從凝膠上脫落。通過(guò)MTT法測(cè)量從凝膠上脫附的細(xì)胞及殘留在凝膠上的細(xì)胞測(cè)得細(xì)胞的脫附率為79.8%。表1為上述實(shí)施例得到的水凝膠樣品的各項(xiàng)性能參數(shù)?？梢娖渚哂泻芎玫牧W(xué)、光學(xué)性能。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求一種高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠，其特征在于它以2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺為原料，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，單體2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量比為0.2-2∶1；具體步驟室溫下，單體-N-異丙基丙烯酰胺、2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯和光引發(fā)劑Irgacure2959于二甲基亞砜中混勻后澆注到透明密閉模具中紫外光照射進(jìn)行自由基聚合，反應(yīng)產(chǎn)物凝膠用水沖洗、浸泡。2.按照權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述的交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯與2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量的和的比為0.6-0.7:1。3.按照權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述的聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量是575。4.一種權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠的制備方法，其特征在于包括的步驟1)室溫下，在二甲基亞砜溶劑中，加入單體N-異丙基丙烯酰胺、2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯和光引發(fā)劑Irgacure2959，混勻后加入透明密閉模具中；2)在紫外光照條件下照射20分鐘進(jìn)行自由基聚合，制得聚N-異丙基丙烯酰胺_共聚-聚2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪水凝膠；3)從模具中取出凝膠，用水沖洗去除未反應(yīng)的單體和溶劑，浸泡7天，每隔12h更換一次水，達(dá)到溶脹平衡。5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚乙二醇二丙烯酸酯與2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量的和的比為0.6-0.71。6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量是575。7.權(quán)利要求1所述的高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠的應(yīng)用，其特征在于可用于轉(zhuǎn)基因和無(wú)損傷脫細(xì)胞的平臺(tái)。全文摘要本發(fā)明涉及一種高強(qiáng)度溫度敏感水凝膠及制備方法和應(yīng)用，它以2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺為原料，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在下共聚制成，單體2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量比為0.2-2∶1。本發(fā)明具有很強(qiáng)的抗拉伸和抗壓縮能力，具有良好的生物相容性和光學(xué)性能。并且該水凝膠表面具有吸附DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力以及通過(guò)溫度調(diào)節(jié)細(xì)胞的貼附和脫貼附行為，其制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易于長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸。文檔編號(hào)C12N5/10GK101824123SQ20091024502公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2009年12月23日優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日發(fā)明者劉文廣,唐蕾申請(qǐng)人:天津大學(xué)