專利名稱：建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種實驗技術應用于研究人類口腔粘膜病一白色海綿狀斑痣，將人 類口腔疾病轉移至動物模型上從而為該病的機制研究和治療提供有效的實驗動物的技術。
背景技術：
口腔白色海綿狀斑痣(white sponge nevus以下簡稱WSN)又稱白色折皺病，是角 蛋白基因突變引起的一種常染色體顯性遺傳病，特性為具有不規(guī)則的外顯性，個體發(fā)病率 與家族系列相比較多，棘層細胞表達蛋白K13和K4的點突變或外源堿基的插入，導致此病 的發(fā)生。目前關于白色海綿狀斑痣的突變基因的研究，國際上共發(fā)現(xiàn)了 9個突變位點(其 中2個是我們發(fā)現(xiàn)的)，通過比較其他突變位點，我們發(fā)現(xiàn)該突變具有明顯的特點，即存在 顯著的家族遺傳性和人種特異性。2008年，通過研究，我們發(fā)現(xiàn)中國人的WSN病的致病基因 突變發(fā)生在Keratin 4基因上，突變位點為1829G — A，蛋白質(zhì)E520K，從而首次在國際上揭 示了中國人此病的致病基因突變位點，但到目前為止，此疾病發(fā)生的分子機制尚不清晰，也 無有效的治療方法。為了進一步對此病進行研究，我們建立了針對中國人WSN病此突變的 轉基因動物模型，力爭為該病的機制研究和治療提供有效的實驗動物。
發(fā)明內(nèi)容
為了探討WSN病發(fā)病的分子機理，我們在國際上首次建立了針對中國人的，可以 模擬人類口腔白色海綿狀斑痣臨床病理表型的K4突變的轉基因動物模型本發(fā)明提供的實 驗方法，其實驗步驟如下一、探測中國人WSN患者的突變基因位點2.用鹽析法提取WSN患者的DNA。3.設計引物K4F1 5，-GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，，K4R1 5' -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3‘禾ΠK4F2 5’ -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5，-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3，，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 Κ4 基因上 的目的基因。4.對擴增的Κ4基因進行測序。5.發(fā)現(xiàn)中國人WSN患者的基因突變位點。二、Κ4突變基因重組質(zhì)粒的構建2.利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質(zhì)粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 1829位上制造突變G變?yōu)锳，使第520密碼子由GAG突變?yōu)锳AG，氨基酸由E突變?yōu)镵，PCR 及測序證明突變成功。3.構建用于連接的linker A--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然后分別利用限制性內(nèi)切酶BamH I (241bp), EcoR I (816bp), HindIII (2479bp)進行重組，產(chǎn)生重組 的KRT4基因。將KRT4基因利用BamHI/Hindlll插入表達載體pcDNA3. 1(+/_)，完成K4轉基因模 型重組質(zhì)粒的構建。三、重組質(zhì)粒轉染將重組質(zhì)粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉染野生型cytokeratiM cDNA重組質(zhì)粒的細胞表現(xiàn)為長梭形，轉染突變型的細胞則表現(xiàn)為不規(guī)則形或短梭形，說明 基因突變影響了轉染細胞中間張力絲的穩(wěn)定性，從而引起細胞形態(tài)的改變。此表現(xiàn)證實該突變?yōu)橹袊薟SN病的致病突變基因。四、K4轉基因動物模型的篩選與鑒定1.用限制性內(nèi)切酶PvuI將構建好的pcDNA3. 1-KRT4進行線性化，純化后進行顯微 注射，將K4基因的重組質(zhì)粒導入小鼠受精卵中2.對轉基因首建鼠用PCR法進行檢測鑒定。3.將鑒定陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠。4.利用聚合酶鏈式反應鑒定Fl代轉基因小鼠。5.將鑒定陽性的Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、Wfestern blotting、免疫組 化、免疫熒光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現(xiàn)為白色海綿狀斑痣的表 現(xiàn)。6.證實針對中國人白色海綿狀斑痣的轉基因動物模型構建成功。借助分子生物學和胚胎工程的技術，將人類口腔WSN相關K4突變基因在體外擴增 和加工，再導入動物的早期胚胎細胞中，使其整合到染色體上，當胚胎被移植到代孕動物的 輸卵管或子宮中后，發(fā)育成攜帶K4突變基因的轉基因動物。本發(fā)明的優(yōu)點是，其針對中國家系發(fā)現(xiàn)的WSN基因突變位點進行實驗研究，具有 一定的針對性，唯一性。該技術周期短，成本低，特異性強，可基本表現(xiàn)出WSN表征，有助于 人們對WSN疾病發(fā)生機制進行實驗研究。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。圖1是本發(fā)明的實驗步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發(fā)明的實施步驟如下首先用鹽析法提取WSN患者的DNA。設計兩對引物將DNA中K4基因上的目的基因 進行聚合酶鏈式反應(PCR)，對擴增出來的K4基因片段進行測序，發(fā)現(xiàn)中國人WSN患者基因 突變位點。然后利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質(zhì)粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 18 位上制造突變G變?yōu)锳，使氨基酸由E突變?yōu)镵，PCR及測序證明突變成功。構建用于 連接的linker然后分別利用限制性內(nèi)切酶進行重組，產(chǎn)生重組的KRT4基因。將KRT4基因 插入表達載體pcDNA3. 1 (+/-)，完成K4轉基因模型重組質(zhì)粒的構建。將將重組質(zhì)粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養(yǎng)，證實該突變?yōu)橹袊薟SN病的致病突變基因。再將構建好的pcDNA3. 1-KRT4產(chǎn)物大量提取，線性化及純化，通過顯微注射法建 立K4基因突變轉基因小鼠模型。用聚合酶鏈式反應(PCR)對首建鼠進行目的基因檢測鑒 定，將檢測結果陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠。最后對PCR技術鑒定出的陽性Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、 Wfesternblotting、免疫組化、免疫熒光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現(xiàn) 為白色海綿狀斑痣的表現(xiàn)，證實針對中國人白色海綿狀斑痣的轉基因動物模型構建成功。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡 是依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于 本發(fā)明技術方案的范圍內(nèi)。綜上所述，本發(fā)明在結構設計、使用實用性及成本效益上，完全符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展所 需，且所揭示的結構亦是具有前所未有的創(chuàng)新構造，具有新穎性、創(chuàng)造性、實用性，符合有關 發(fā)明專利要件的規(guī)定，故依法提起申請。
權利要求
1. 一種建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法，其特征在于，該實 驗方法的步驟為探測中國人WSN患者的突變基因位點(1)用鹽析法提取WSN患者的DNA；(2)設計引物K4F1 5’ -GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，， K4R1 5’ -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3，禾口 K4F2 5' -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5’-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3’，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增K4基因上的目 的基因；(3)對擴增的K4基因進行測序；(4)發(fā)現(xiàn)中國人WSN患者的基因突變位點； K4突變基因重組質(zhì)粒的構建(1)利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質(zhì)粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因18 位上制造突變G變?yōu)锳，使第520密碼子由GAG突變?yōu)锳AG，氨基酸由E突變?yōu)镵，PCR及測 序證明突變成功；(2)構建用于連接的linkerA--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然后分別利 用限制性內(nèi)切酶BamH I (Mlbp)、EcoRI (816bp)、HindIII (2479bp)進行重組，產(chǎn)生重組的 KRT4基因；將KCT4基因利用BamHI/Hindlll插入表達載體pcDNA3. 1 (+/_)，完成K4轉基因模型重 組質(zhì)粒的構建； 重組質(zhì)粒轉染將重組質(zhì)粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉染野生型cytokeratiMcDNA 重組質(zhì)粒的細胞表現(xiàn)為長梭形，轉染突變型的細胞則表現(xiàn)為不規(guī)則形或短梭形，說明基因 突變影響了轉染細胞中間張力絲的穩(wěn)定性，從而引起細胞形態(tài)的改變； 此表現(xiàn)證實該突變?yōu)橹袊薟SN病的致病突變基因； K4轉基因動物模型的篩選與鑒定(1)用限制性內(nèi)切酶PvuI將構建好的pcDNA3.1-KRT4進行線性化，純化后進行顯微注 射，將K4基因的重組質(zhì)粒導入小鼠受精卵中(2)對轉基因首建鼠用PCR法進行檢測鑒定；(3)將鑒定陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠；(4)利用聚合酶鏈式反應鑒定Fl代轉基因小鼠；(5)將鑒定陽性的Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、ffesternblotting、免疫組化、免 疫熒光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現(xiàn)為白色海綿狀斑痣的表現(xiàn)。
全文摘要
一種建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法，該實驗方法的步驟為探測中國人WSN患者的突變基因位點，K4突變基因重組質(zhì)粒的構建，重組質(zhì)粒轉染，K4轉基因動物模型的篩選與鑒定。本發(fā)明針對中國家系發(fā)現(xiàn)的WSN基因突變位點進行實驗研究，具有一定的針對性，唯一性。該技術周期短，成本低，特異性強，可基本表現(xiàn)出WSN表征，有助于人們對WSN疾病發(fā)生機制進行實驗研究。
文檔編號C12N15/85GK102102103SQ20091024481
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權日2009年12月16日
發(fā)明者張劍明 申請人:張劍明