專利名稱：一種延長酸奶儲藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品保藏領(lǐng)域，涉及一種延長酸奶儲藏期的方法，具體地說，是指一種 利用從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸菌制備酸奶發(fā)酵劑從而延長酸奶儲藏期的 方法。
背景技術(shù)：
酸乳(也叫酸奶)多是以鮮牛奶為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到的一種酸性適中 的凝聚半固狀奶制品，見參考文獻(xiàn)沈輝，酸乳發(fā)酵凝乳過程中的理化性質(zhì)和生物活性，《無 錫輕工大學(xué)學(xué)報》2000，19(5)。作為乳酸菌發(fā)酵的主要產(chǎn)品之一，酸乳因特有的營養(yǎng)價值和 風(fēng)味而受到越來越多消費者的鐘愛，在產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)量和品種方面都得到了迅速的發(fā)展。 但因為酸奶是含活菌的乳制品，正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運輸、銷售、食用前這一過程 中，菌體仍要生長繁殖，發(fā)生后酸化，即酸奶的PH值繼續(xù)下降，以至出現(xiàn)消費者不可接受的 過酸味及感官質(zhì)量下降。由于酸奶的保存期短，流通性受到限制，給經(jīng)營者造成了很大的困 難，使酸奶的產(chǎn)量徘徊不前，尤其是在我國運輸、消費還沒有形成冷藏鏈一體化的情況下， 酸奶在還沒有食用之前，其質(zhì)量就大大降低了，這種現(xiàn)狀直接影響了消費者和經(jīng)營者的利 益，因此，如何延長酸奶的保質(zhì)期，提高其衛(wèi)生安全性，成為目前食品研究的重要課題之一。目前控制酸奶后酸化的主要方法有1)調(diào)整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比 例；2)添加外來物控制菌的生長和產(chǎn)酸；3)改變細(xì)胞膜的通透性；4)使用基因工程和誘變 育種技術(shù)包括物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合(生物育種)和基因工程技術(shù)進(jìn)行乳酸 高產(chǎn)菌株的選育，提高菌種產(chǎn)乳酸的能力。在上述方法中，通過調(diào)整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例、添加外來物的方 法只能輕微地減弱后酸化的程度；而通過改變細(xì)胞膜通透性和添加細(xì)菌素的方法增加了生 產(chǎn)的成本，不適用于規(guī)?；a(chǎn)；只有通過基因工程和誘變育種生產(chǎn)出在低溫和低PH下產(chǎn) 酸能力弱的菌株可從根本上解決酸奶后酸化問題。目前，盡管國內(nèi)外對于乳酸菌基因組的 研究有較多的報道，并取得了很大的進(jìn)展，但由于其復(fù)雜性，對乳酸菌的基因調(diào)控機制研究 的還不是很透徹，重組基因控制酸奶后酸化的研究目前鮮有報道。至今為止，誘變育種和細(xì)胞融合生物選育仍是世界各國行之有效的重要方法，以 其在篩選優(yōu)良菌株應(yīng)用上的卓越成效而最受推崇。尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良高產(chǎn)菌株絕 大部分都是以誘變育種和生物選育方法獲得的。誘變育種和細(xì)胞融合生物選育除了能提高 產(chǎn)量外，還可達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等目的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種延長酸奶儲藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，該方法通過 對從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到一種抗后酸化菌 株，利用該菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，從而提高了酸奶的保藏期。應(yīng)用本發(fā)明的提供 的發(fā)酵劑制備的酸奶保鮮期長，有利于酸奶運輸量的增加、成本的降低，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明提供的延長酸奶儲藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，通過對篩選菌株進(jìn)行原 生質(zhì)體融合，最終得到一株在貯藏37°C產(chǎn)乳酸量與出發(fā)菌株一樣，但是在10°C貯藏時，突 變菌株產(chǎn)乳酸量明顯減少的菌株，該突變菌株遺傳穩(wěn)定性較好，不易回復(fù)突變，可以作為酸 奶發(fā)酵劑。具體的制備方法步驟如下步驟一、從新疆酸奶疙瘩中通過劃線分離和涂布的方法分離得到一株發(fā)酵性能好 的乳酸桿菌(LN1)和一株乳酸球菌(sm)，將乳酸桿菌(LN1)定義為出發(fā)菌株。步驟二、取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)分別按3%比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基 中形成菌液，42°C恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力。步驟三、原生質(zhì)體制備。分別取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(sm)對數(shù)生長期菌 液10ml，離心并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液洗滌兩次，所用原生質(zhì)體穩(wěn)定液體積與菌液體積相同，洗 滌后收集菌體，轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中。乳酸桿菌LN1的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15.00mg/mL，酶解細(xì)胞壁的 時間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌sm的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為3. 20mg/mL,酶解細(xì)胞壁的時 間為60min，酶解溫度為44°C。應(yīng)用裂解法和倒置顯微鏡觀察圖法測定原生質(zhì)體形成率。步驟四、原生質(zhì)體融合。對上述步驟三中的兩種原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活，各取 4ml滅活的原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水浴保 溫2min，離心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。步驟五、對融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到目的菌株。取步驟四中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基中， 轉(zhuǎn)入滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長出菌落。將長出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均勻，菌 數(shù)在100 200之間的培養(yǎng)基，通過影印法接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和37°C 下培養(yǎng)，選取在37°C下生長，而在20°C下不長或生長緩慢的菌落為目的菌株一即為本發(fā)明 所要制備的酸奶發(fā)酵劑。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)該突變菌株在37°C條件下，產(chǎn)乳酸量跟出發(fā)菌株一樣；在10°C條件下，產(chǎn)乳酸 量比出發(fā)菌株明顯減少，后酸化時間明顯推遲；以120.00° T作為后酸化指標(biāo)值，發(fā)酵脫脂 乳6h后，在10°C條件下儲存，對照菌株(德氏乳桿菌保加利亞亞種6032，購于中國工業(yè)微 生物菌種保藏中心，以下簡稱6032)在第5天出現(xiàn)后酸化(滴定酸度> 120.00° T)，該突 變菌株在第8天出現(xiàn)后酸化。(2)該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，不易回復(fù)突變；(3)篩選得到的抗后酸化突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑，提高了酸奶的保藏性，降低了 生產(chǎn)成本；(4)本發(fā)明中選用了原生質(zhì)體融合法，選育出在高溫條件下產(chǎn)酸較強、在低溫條件 下產(chǎn)酸甚微的菌株作為發(fā)酵劑，這種方法較其他方法正突變率高，操作方便，且有效解決了 酸奶后酸化的問題。
圖1為本發(fā)明酸奶發(fā)酵劑的制備方法流程圖；圖2為供試菌株LN1、SN1生長曲線；圖3為供試菌株6032、LN1、N02、N03發(fā)酵乳10°C儲藏期間滴定酸度變化曲線；圖4為供試菌株LN 1、6032、而2、而3在371培養(yǎng)時滴定酸度值變化。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明提供的酸奶發(fā)酵劑的制備方法作進(jìn)一步的詳細(xì) 說明。本發(fā)明是一種利用抗后酸化的酸奶發(fā)酵劑延長酸奶儲藏期的方法，通過原生質(zhì)體 融合方法得到突變菌株，將突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，具體的制備方法流程如圖1 所示，步驟如下(1)從新疆酸奶疙瘩中通過劃線分離和涂布的方法分離得到發(fā)酵性能好的一株乳 酸桿菌LN1和一株乳酸球菌SN1，將乳酸桿菌LN1定義為出發(fā)菌株。(2)取乳酸桿菌LN1和乳酸球菌Sm分別按3%比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基中形 成菌液，42°C恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力(42°C發(fā)酵6小時酸度達(dá)到 70. 00-120° T)。(3)制備乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(Sm)的原生質(zhì)體。對滿足活力要求的菌株進(jìn)行單因素實驗，分別測定其最適生長溫度、最適接種量、 最適初始PH值，于最佳條件下測定菌株的生長曲線。分別取乳酸桿菌LN 1和乳酸球菌Sm對數(shù)生長期菌液10mL，離心(3000r/min)并 以原生質(zhì)體穩(wěn)定液(PB)洗滌兩次，原生質(zhì)體穩(wěn)定液(PB)使用體積與菌液體積相同，收集菌 體，轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中。乳酸桿菌LN1的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15. 00mg/mL,酶解細(xì)胞壁的 時間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌sm的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為3. 20mg/mL,酶解細(xì)胞壁的時 間為60min，酶解溫度為44°C。應(yīng)用裂解法和倒置顯微鏡觀察圖法測定原生質(zhì)體形成率。(4)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(Sm)的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合.對乳酸桿菌LN1和乳酸球菌Sm的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活，各取4ml滅活的 原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水浴保溫2min，離 心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。(5)對融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到具備較強的抗后酸化能力的目的菌株 (N02)、 (N03)。取步驟(4)中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基 中，轉(zhuǎn)入滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長出菌落。挑取長出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均 勻，菌數(shù)在100 200之間的平皿，通過影印法接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和 37°C下培養(yǎng)，選取在37°C下生長，而在20°C下不長或生長緩慢的菌落為目的菌。對上述得到的目的菌做發(fā)酵脫脂乳及貯藏酸性能實驗，與乳酸桿菌LN1和6032所發(fā)酵的脫脂乳為對照，比較其在貯藏過程中的PH值和滴定酸度的變化。用上述制備得到的目的菌做發(fā)酵劑制作酸奶，并進(jìn)行突變效應(yīng)的測定。于10°C儲 藏，隔天測定其酸度° T-滴定法；pH值-采用pH211型酸度計；乳酸菌活菌數(shù)-采用高層 瓊脂法；0D值的測量-采用紫外可見分光光度計測定，波長600nm。下面結(jié)合圖表對本發(fā)明關(guān)鍵步驟的結(jié)果進(jìn)行說明。(1)測定生長曲線乳酸桿菌LN1在37°C、3%接種量、初始pH值6. 6的條件下培養(yǎng)，經(jīng)過一個較短的 延遲期后，菌株即進(jìn)入對數(shù)生長期，如圖2所示，15h時菌體濃度達(dá)到最高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定 期，菌體0D值基本保持不變。乳酸球菌sm菌株在41°C、3%接種量、初始pH值7. 0的條件 下培養(yǎng)，經(jīng)過一個較短的延遲期后，菌株即進(jìn)入對數(shù)生長期，15h時菌體濃度達(dá)到最高峰，之 后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體0D值基本保持不變。制備原生質(zhì)體的細(xì)菌一般要求處于對數(shù)生長期，此時菌體生長狀態(tài)比較同步，容 易變異，同時為了保證處理時具有一定的細(xì)胞濃度以增加可能變異的細(xì)胞總數(shù)，常選用對 數(shù)生長中后期的細(xì)胞進(jìn)行處理。因此，本試驗選定菌株LN1和sm培養(yǎng)時間為12h。(2)原生質(zhì)體制備條件的確定根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗表1，通過均勻試驗確定來原生質(zhì)體制備的最 佳條件。表1LN1原生質(zhì)體制備條件均勻設(shè)計U8女(85)實驗水平因素表 表2Sm原生質(zhì)體制備條件均勻設(shè)計U8女(85)實馬僉水平因素表
表3LN1均勻設(shè)計表及試驗結(jié)果 利用軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析(回歸分析采用后退法，顯著性水平 a = 0. 05)，得到原生質(zhì)體制備率與酶濃度、酶處理溫度、酶處理時間的多元一次回歸方程 為Y(% ) = -25. 3+3. 68X(l)+0. 917X(2)+0. 483X(3)方程偏回歸系數(shù)分別為B1 = 1. 12，B2 = 0. 280，B3 = 0. 369，可見各因素對原生 質(zhì)體制備率(酶解率％ )的影響為酶濃度>酶處理時間>酶處理溫度。由回歸方程可知X1、X2、X3的系數(shù)為正，表明試驗指標(biāo)隨因素的增加而增加，所 以，在確定優(yōu)化方案時，各因素的取值應(yīng)偏上限，即酶濃度取15. 00mg/mL，酶處理溫度取 44°C，酶處理時間取60min。將以上各值代入上述回歸方程，得到原生質(zhì)體制備率(酶解率) 最大值為99. 6 %，這一結(jié)果好于表3中的8個試驗結(jié)果。對其進(jìn)行驗證試驗，得到結(jié)果與計 算結(jié)果相接近。因此得到原生質(zhì)體制備最佳條件為酶濃度取15. 00mg/mL ；酶處理溫度取 44°C ；酶處理時間取60min。表4Sm均勻設(shè)計表及試驗結(jié)果
利用軟件對表4試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析(回歸分析采用后退法，顯著性水平 a = 0. 05)，得到原生質(zhì)體制備率與酶濃度、酶處理溫度、酶處理時間的多元一次回歸方程 為Y(% ) = -2. 78+17. 3X(l)+0. 602X(2)+0. 345X(3)方程偏回歸系數(shù)分別為B1 = 1. 11，B2 = 0. 176，B3 = 0. 278，可見各因素對原生
質(zhì)體制備率(酶解率％)的影響為酶濃度>酶處理時間>酶處理溫度。與LN 1結(jié)果類 似。由回歸方程可知X1、X2、X3的系數(shù)為正，表明試驗指標(biāo)隨因素的增加而增加， 所以，在確定優(yōu)化方案時，各因素的取值應(yīng)偏上限，即酶濃度取3. 20mg/mL，酶處理溫度取 44°C;酶處理時間取60min。將以上各值代入上述回歸方程，得到酶解率最大值為100%，這 一結(jié)果好于表4中的8個試驗結(jié)果。對其進(jìn)行驗證試驗，得到結(jié)果與計算結(jié)果相接近。因 此得到原生質(zhì)體制備最佳條件為酶濃度取3. 20mg/mL，酶處理溫度取44°C，酶處理時間取 60mino(3)突變菌株篩選結(jié)果挑取在37°C下生長，而在20°C下不長或生長緩慢的菌落38個，逐個接入脫脂乳試 管中，37°C恒溫培養(yǎng)，對發(fā)酵乳進(jìn)行感官評價，淘汰產(chǎn)酸過快、凝乳不良、風(fēng)味欠佳的菌株36 株。對剩余的2株菌株N02、N03進(jìn)行貯藏期特性測定，最終篩選出在10°C下產(chǎn)酸緩慢的菌 株 N02、N03。根據(jù)國標(biāo)規(guī)定，酸奶的正常酸度(° T)應(yīng)介于70. 00 110. 00之間，超過 110.00° T則被界定為不合格產(chǎn)品。因此，本試驗將110.00° T作為后酸化的指標(biāo)值。由圖3可以看出，發(fā)酵脫脂乳在10°C貯藏時，由于發(fā)酵乳溫度由37°C未能立刻降 到10°C，所以在儲藏第2d時滴定酸度較儲藏初始時刻有明顯上升，儲藏3d后發(fā)酵乳溫度 達(dá)到10°C，滴定酸度升高趨勢減慢，當(dāng)發(fā)酵乳發(fā)生后酸化后由于自身產(chǎn)酸抑制乳酸菌的增 殖，所以滴定酸度增長幅度較慢。隨貯藏時間的增加滴定酸度值都逐漸升高。試驗中菌株 6032與Lm到第5d時已經(jīng)發(fā)生后酸化(滴定酸度> 120° T)，而菌株N02與N03在貯藏的 第8d和第7d時發(fā)生后酸化。目的菌株N02較LN1的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時間上延長了 3d， 目的菌株N03較LN1的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時間上延長了 2d。(4)突變效果測定結(jié)果用液體MRS培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)對照菌株6032、出發(fā)菌株LN1、目標(biāo)菌株N02、N03,比
較其產(chǎn)酸速率。由圖4可知，37°C下LN1、N02、N03、6032在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，隨著時間的增加 滴定酸度值都逐漸下降。N02、N03與LN1、6032相比，產(chǎn)酸量有所減少。6h時，LN1、6032、 N02、N03的滴定酸度值分別為80° T、82.0° T、78° T、81. 0° T，差距不明顯；12h滴定酸度 值分別為130.0° TU35. 0° T、117.3° T、123.0° T，差距比較明顯。說明菌株N02、N03 的耐酸性有所減低，對于延長酸奶儲藏期是非常有利的。對目的菌株N02、N03進(jìn)行傳代培養(yǎng)10代，測定12°C儲藏15d后的滴定酸度，結(jié)果 如表，各代的產(chǎn)酸能力基本一致，變化不大，這充分說明了該誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性好，不 容易發(fā)生退變。表5N02、N03突變菌株遺傳穩(wěn)定性
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權(quán)利要求
一種延長酸奶儲藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，通過原生質(zhì)體融合方法制備得到突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑，其特征在于包括以下步驟(a)從新疆酸奶疙瘩中篩選到發(fā)酵性能好的乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)，將乳酸桿菌(LN1)定義為出發(fā)菌株；(b)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)分別按3％比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基中形成菌液，42℃恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力；(c)制備乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體；(d)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合；(e)對融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到具備較強的抗后酸化能力的目的菌株(NO2)、(NO3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長酸奶儲藏期的方法，其特征在于步驟(b)所述的 要求的活力是指在42°C發(fā)酵6小時酸度達(dá)到70. 00-120° T的情況。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長酸奶儲藏期的方法，其特征在于步驟(c)所述的 原生質(zhì)體制備，首先分別取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)對數(shù)生長期菌液10mL，離心 并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液洗滌兩次，原生質(zhì)體穩(wěn)定液使用體積與菌液體積相同，收集菌體，轉(zhuǎn)入 10cm培養(yǎng)皿中；乳酸桿菌(LN1)的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15.00mg/mL，酶解 細(xì)胞壁的時間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌(SW)的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶 濃度為3. 20mg/mL，酶解細(xì)胞壁的時間為60min，酶解溫度為44°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長酸奶儲藏期的方法，其特征在于步驟(d)所述的 原生質(zhì)體融合具體為對乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活， 各取4ml滅活的原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水 浴保溫2min，離心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長酸奶儲藏期的方法，其特征在于步驟(e)具體為 取步驟(d)中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入 滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長出菌落；挑取長出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在 37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均勻，菌數(shù)在100 200之間的平皿，通過影印法接種到MRS 瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和37°C下培養(yǎng)，選取在37°C下生長，而在20°C下不長或生長緩 慢的菌落為目的菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種延長酸奶儲藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，屬于食品保藏領(lǐng)域，該方法通過對從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸桿菌和乳酸球菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，對融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到目的菌株，利用該菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，從而提高了酸奶的保藏期。應(yīng)用本發(fā)明的提供的發(fā)酵劑制備的酸奶保鮮期長，有利于酸奶運輸量的增加、成本的降低，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12R1/01GK101874519SQ20091023807
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者孫玉清, 王芳, 羅紅霞 申請人:北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院